仪器分析第十二章复习

1仪器分析InstrumentalAnalysis色谱概论

IntroductionofChromatography沈昊宇，haoyushen2000@163.com22008年9月讲课内容：《仪器分析》之色谱法罪魁祸首：

“假蛋白”

三聚氰胺

(Melamine)

C3H6N6

沈昊宇，haoyushen2000@163.com3结石机理J.Am.Chem.Soc.2001,123,7518-7533沈昊宇，haoyushen2000@163.com4色谱技术为什么会被添加？含氮量高、不易被发觉为什么不易被发觉？检测方法有漏洞如何来检测？沈昊宇，haoyushen2000@163.com5沈昊宇，haoyushen2000@163.com6沈昊宇，haoyushen2000@163.com7我们做过的绿色植物中色素提取的实验绿色植物中色素的分离应用的就是色谱技术基本过程：菠菜剪碎研细→石油醚/甲醇混合液提取→分液→浓缩→上柱分离（柱中装中性氧化铝，石油醚/丙酮混合液洗脱）

固定相流动相

什么是色谱技术？沈昊宇，haoyushen2000@163.com8

色谱分离的基本过程沈昊宇，haoyushen2000@163.com9载气系统进样系统色谱柱检测系统温控系统进样系统高压输液装置分离系统检测系统

认识常用的仪器GCSystem沈昊宇，haoyushen2000@163.com101906年Tswett创立“chromatography”—“色谱法”新名词。分离的组份在柱中显示了不同的色带，他称之为色谱(希腊语)。色谱法因此得名。1907年在德国生物会议上第一次向世界公开展示显现彩色环带的柱管。逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”沿用至今。1930年R.Kuhn用色谱柱分离出胡萝卜素1935年AdamsandHolmes发明了苯酚-甲醛型离子交换树脂，进一步发明了离子色谱1938年Izmailov发明薄层色谱

色谱法进展沈昊宇，haoyushen2000@163.com111850年RUNGE的色谱分离过程报告；1905年RAMSEY用色谱法分离气体；1906年TSWETT发明了柱色谱；1952年Martin和Synge因开创气相色谱分析法而获诺贝尔化学奖；1956年GOLAY发明了毛细管拄；1957年HOLMES将气相色谱与质谱联用。

12个Nobel奖有关色谱研究沈昊宇，haoyushen2000@163.com121941年Martin&Synge发明了液-液分配色谱1944年Consden,Gordon&Martin发明纸色谱1952年Martin&Synge发明气-液色谱1953年Janak发明气-固色谱1954年Ray发明热导检测器1957年Martin&Golay发明毛细管色谱1959年Porath&Flodin发明凝胶色谱1960年液相色谱技术完善1954年我国研究成功第一台色谱仪沈昊宇，haoyushen2000@163.com13气相色谱法(GC)液相色谱法(LC)三、色谱法的分类（一）按两相状态分超临界流体色谱法(SFC)电色谱沈昊宇，haoyushen2000@163.com14（二）按分离机理分吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。分配色谱是利用溶液中被分离物质在两相中分配系数不同，以使组分分离。其中一相为液体，涂布或使之键合在固体载体上，称固定相；另一相为液体或气体，称流动相。离子交换色谱是利用被分离物质在离子交换树脂上的离子交换作用不同而使组分分离。常用的有不同强度的阳、阴离子交换树脂，流动相一般为水或含有有机溶剂的缓冲液。排阻色谱又称凝胶色谱或凝胶渗透色谱，是利用被分离物质分子量大小的不同和在填料上渗透程度的不同，以使组分分离。常用的填料有分子筛、凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。沈昊宇，haoyushen2000@163.com15（二）按固定相形态分柱色谱薄层色谱纸色谱沈昊宇，haoyushen2000@163.com16四色谱法的特点（1）分离效率高

复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2）灵敏度高

可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3）分析速度快

一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广

气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。

不足之处：

被分离组分的定性较为困难。联用技术发展可以弥补。

沈昊宇，haoyushen2000@163.com17沈昊宇，haoyushen2000@163.com18

设疑

如何“看”懂色谱图？

从色谱图中如何获取相应检测结果的信息？

与光谱图又有什么区别？沈昊宇，haoyushen2000@163.com19色谱图色谱流出曲线基线色谱峰第二节色谱流出曲线及有关术语

色谱图：色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵标为信号强度，横坐标为保留时间。

一色谱流出曲线沈昊宇，haoyushen2000@163.com20

色谱图及相关术语

前伸峰a、d

拖尾峰b、c

分叉峰e“馒头”峰f峰底(PeakBase)峰高h(PeakHeight)峰(底)宽W(PeakWidth)半(高)峰宽W1/2(PeakWidthatHalfHeight)峰面积A

(PeakArea)

峰拐点E、F沈昊宇，haoyushen2000@163.com21

保留值死时间保留时间调整保留死时间二色谱基本参数

相对保留值（ris）或选择因子aa＝

沈昊宇，haoyushen2000@163.com22

从色谱图中如何获取相应检测结果的信息？

根据峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数。根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析。根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析。色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据。色谱峰两峰间距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。沈昊宇，haoyushen2000@163.com23色谱分析的目的是什么？

设疑

如何判断组分分离了？沈昊宇，haoyushen2000@163.com24

分配系数K一与分离相关的参数

分配比（partionradio）k第三节色谱法基本原理沈昊宇，haoyushen2000@163.com25

一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；选择适宜的固定相可改善分离效果；每个组份在各种固定相上的分配系数K不同；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。

分配系数K的讨论沈昊宇，haoyushen2000@163.com26

在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：

1.分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。

2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。

3.分配比可以由实验测得。分配比也称：容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；通过调整保留值可以计算。

分配比k

的讨论沈昊宇，haoyushen2000@163.com27

式中β为相比。填充柱相比：6～35；毛细管柱的相比：50～1500。容量因子越大，保留时间越长。

容量因子k与分配系数K的关系

沈昊宇，haoyushen2000@163.com28分配系数K、容量因子k与选择因子(相对保留值)的关系注意：K或k反映的是某一组分在两相间的分配；而

是反映两组分间的分离情况！当两组分K或k

相同时，

=1时，两组分不能分开；当两组分K或k相差越大时，

越大，分离得越好。

两组分在两相间的分配系数不同，是色谱分离的先决条件。

和k

是计算色谱柱分离效能的重要参数！沈昊宇，haoyushen2000@163.com29二色谱分离的基本过程沈昊宇，haoyushen2000@163.com30三色谱分离的基本原理

色谱分离的基本原理是试样组分通过色谱柱时与填料之间发生相互作用，这种相互作用大小的差异使各组分互相分离而按先后次序从色谱柱后流出。气-固色谱气-液色谱溶解－挥发吸附－脱附两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础沈昊宇，haoyushen2000@163.com31

色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。两种色谱理论：塔板理论和速率理论组分保留时间为何不同？色谱峰为何变宽？组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定液的结构和性质）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）四色谱理论沈昊宇，haoyushen2000@163.com32

塔板理论的假设：

(1)在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；

(2)将流动相看作成脉动（间歇）过程；

(3)试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；

(4)每次分配的分配系数相同。塔板理论的提出：

1941年James,Matin提出；半经验理论；将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）；1塔板理论（platetheory）沈昊宇，haoyushen2000@163.com33

色谱柱长：L，虚拟的塔板间距离：H，色谱柱的理论塔板数：n，则三者的关系为：

n=L/H理论塔板数与色谱参数之间的关系为：保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!色谱柱效能的参数：柱效：也叫柱效能。是指色谱柱在分离过程主要由动力学因素所决定的分离效能，通常用理论塔板数n或用理论塔板高度H来表示。

沈昊宇，haoyushen2000@163.com34

单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有效塔板高度：

有效塔板数与有效塔板高度沈昊宇，haoyushen2000@163.com35(1)当色谱柱长度一定时，塔板数n

越大(塔板高度H越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。

(2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。(3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。(4)塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果，也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径。塔板理论的特点和不足沈昊宇，haoyushen2000@163.com362速率理论

1956年荷兰学者vanDeemter提出

H=A+B/u+C·u

H：理论塔板高度，

u：载气的线速度(cm/s)

减小A、B、C三项可提高柱效；存在着最佳流速；

A、B、C三项各与哪些因素有关？

速率方程（也称范.弟姆特方程式）沈昊宇，haoyushen2000@163.com37A─涡流扩散项

A=2λdp

dp：固定相的平均颗粒直径λ：固定相的填充不均匀因子

固定相颗粒越小dp↓，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。

空心毛细管柱：A=0沈昊宇，haoyushen2000@163.com38B/u—分子扩散项

B=2νDgν

：弯曲因子，填充柱色谱，ν<1。

Dg：试样组分分子在气相中的扩散系数（cm2·s-1）

(1)存在着浓度差，产生纵向扩散;(2)扩散导致色谱峰变宽，H↑(n↓)，分离变差;(3)分子扩散项与流速有关，流速↓，滞留时间↑，扩散↑;(4)扩散系数：Dg

∝(M载气)-1/2；M载气↑，B值↓。

(5)较低的柱温可以减小B沈昊宇，haoyushen2000@163.com39减小担体粒度，选择小分子量的气体作载气，可降低传质阻力。C·u

—传质阻力项

传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL即：

C=（Cg+CL）沈昊宇，haoyushen2000@163.com40流速高时：

传质阻力项是影响柱效的主要因素，流速

，柱效

。流速低时：

分子扩散项成为影响柱效的主要因素，流速

,柱效

。H-u曲线与最佳流速：

由于流速对这两项完全相反的作用，流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值，即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值。以塔板高度H对应载气流速u作图，曲线最低点的流速即为最佳流速。H=A+B/u+C·u

流动相线速度对塔板高度的影响沈昊宇，haoyushen2000@163.com41

固定相粒度越小，塔板高度越小。受线速度影响越小，但流动阻力加大，需采用高压技术。（HPLC）

固定相粒度大小对塔板高度的影响气相色谱：H=B/u+C·u液相色谱：H=A+C·u

气相色谱与液相色谱法的H-u图沈昊宇，haoyushen2000@163.com42(1)组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散、浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因。(2)通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提高柱效。(3)速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导。阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响。(4)各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使柱效提高，但同时传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到最高。

小结：速率理论的要点沈昊宇，haoyushen2000@163.com43

塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响：保留值之差──色谱过程的热力学因素；区域宽度──色谱过程的动力学因素。色谱分离中的四种情况如图所示：

讨论：①柱效较高，△K(分配系数)较大,完全分离；②△K不是很大，柱效较高，峰较窄，基本上完全分离；③柱效较低，△K较大,但分离的不好；④△K小，柱效低，分离效果更差。沈昊宇，haoyushen2000@163.com44R=0.8：两峰的分离程度可达89%；R=1：分离程度98%；R=1.5：达99.7%（相邻两峰完全分离的标准）。第四节分离度与基本色谱分离方程式

分离度的表达式：沈昊宇，haoyushen2000@163.com45R=1.5R=0.75R=1.0响应信号保留时间t,min沈昊宇，haoyushen2000@163.com46

色谱分离方程式：分离度受柱效、选择因子、容量因子的影响，分离度与三者的关系为：沈昊宇，haoyushen2000@163.com47

讨论：（1）分离度与柱效的关系

分离度与柱效的平方根成正比，选择因子一定时，增加柱效，可提高分离度，但组分保留时间增加且峰扩展，分析时间长。R12/R22＝n1/n2=L1/L2（2）分离度与选择因子的关系

增大选择因子是提高分离度的最有效方法，计算可知，在相同分离度下，当选择因子增加一倍，需要的n有效减小10000倍。

一般通过改变固定相和流动相的性质和组成或降低柱温，可增大选择因子。

增大选择因子的最有效方法是选择合适的固定液。沈昊宇，haoyushen2000@163.com48（3）分离度与容量因子的关系

当k>10时，随容量因子增大，分离度的增长很小。一般k为2-3为宜。对于气相色谱，通过提高温度，可选择合适的k。对于液相色谱，改变流动相的组成，可以有效控制k。

讨论：沈昊宇，haoyushen2000@163.com49

分析时间：分析时间通常指最后一个组分出峰的时间。

可见，分析时间与R，，k、H/u等参数有关。R增加1倍，分析时间则是原来的4倍。

实际工作中，即要能获得有效的分离，又要在较短时间内完成分析。

分析时间沈昊宇，haoyushen2000@163.com50

在一定条件下，两个组分的调整保留时间分别为85秒和100秒，要达到完全分离，即R=1.5。计算需要多少块有效塔板。若填充柱的塔板高度为0.1cm，柱长是多少？解：a=100/85=1.18

n有效=16R2[a/(a-1)]2=16×1.52×(1.18/0.18)2

=1547（块）

L有效=n有效·H有效=1547×0.1=155cm

即柱长为1.55米时，两组分可以得到完全分离。

例1沈昊宇，haoyushen2000@163.com51

在一定条件下（n=3600，L=1米），两个组分的保留时间分别为12.2s和12.8s，计算分离度。要达到完全分离，即R=1.5，所需要的柱长。解：分离度：塔板数增加一倍，分离度增加多少？

例2沈昊宇，haoyushen2000@163.com52一、色谱定性鉴定方法1.利用纯物质定性的方法

利用保留值对照定性：通过对比试样中具有与纯物质相同保留值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中的位置。不适用于不同仪器上获得的数据之间的对比。

利用加入法定性：将纯物质加入到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。第五节色谱定性与定量分析Qualitativeandquantitativeanalysisinchromatography沈昊宇，haoyushen2000@163.com532.利用文献保留值定性

相对保留值r21仅与柱温和固定液性质有关。在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保留数据，可以用来进行定性鉴定。

利用相对保留值r21定性

相对保留值沈昊宇，haoyushen2000@163.com54

保留指数又称Kovats指数(Ⅰ)，是一种重现性较好的定性参数。测定方法：

将正构烷烃作为标准，规定其保留指数为分子中碳原子个数乘以100（如正己烷的保留指数为600）。其它物质的保留指数（IX）是通过选定两个相邻的正构烷烃，其分别具有Z和Z＋1个碳原子。被测物质X的调整保留时间应在相邻两个正构烷烃的调整保留值之间。

利用保留指数定性

2.利用文献保留值定性（续）沈昊宇，haoyushen2000@163.com553.与其他分析仪器联用的定性方法

色质谱联用仪（GC-MS；LC-MS）色谱-红外光谱仪联用仪等；

组分的结构鉴定SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDGasChromatograph(GC)MassSpectrometer(MS)SeparationIdentificationBACD沈昊宇，haoyushen2000@163.com56二、色谱定量分析方法峰面积的测量

（1）峰高（h）乘半峰宽（Y1/2）法：近似将色谱峰当作等腰三角形。此法算出的面积是实际峰面积的0.94倍：

A=1.064h·Y1/2

（2）峰高乘平均峰宽法：当峰形不对称时，可在峰高0.15和0.85处分别测定峰宽，由下式计算峰面积：

A=h·（Y

0.15+Y

0.85

）/2

（3）自动积分和微机处理法沈昊宇，haoyushen2000@163.com572.定量校正因子

试样中各组分质量与其色谱峰面积成正比，即：

mi=fi·Ai绝对校正因子：比例系数f

i

，单位面积对应的物质量：

f

i=mi/Ai

定量校正因子与检测器响应值成倒数关系：

f

i=1/Si

相对校正因子f

’i

：即组分的绝对校正因子与标准物质的绝对校正因子之比。

当mi、mS以摩