2025届人教版高考生物一轮复习：pcr相关问题分析

微难点5PCR相关问题分析

核心提炼

1.PCR过程模型

DNA

十出野匚人田变性再与合成

样品DNA人+合成引物复性DNA

变性再与合成引物复性DNA广.I

引物管性DNA/---------------------

待产筮望

的DNA

第1轮免制第2轮复制第3轮复制

图形显示一轮循环产生的子链长度小于互补链的长度，只有第三轮循环时，才会合成出

2个两条脱氧核昔酸链等长的子代DNA,即第〃轮循环，合成等长的DNA分子数为2〃

—2«o

2.引物的归类分析

(DDNA的复制需要引物的原因：DNA聚合酶只能催化脱氧核糖核甘酸加至已有单链的

游离3，一羟基上，而不能使脱氧核糖核甘酸自身发生聚合。

①引物是一小段单链DNA或RNA,它能与DNA母链的一段碱基互补配对。

②细胞内DNA复制以RNA作引物，它的合成是由一种特殊的RNA合成酶——引物酶

所催化的。

③PCR反应一般以DNA作引物(因为RNA易降解)。

⑵设计引物的主要原则

①引物长度应大于16个核甘酸(通常为20〜30个核昔酸)，可防止随机结合。

②引物与靶序列间的7XDNA熔解温度)不应过低。

③引物不应有发夹结构，即不能有4bp以上的回文序列。

④2个引物间不应有4bp以上的互补序列或同源序列，在3,端不应有任何互补的碱基。

⑤引物中碱基的分布尽可能均匀，G+C含量接近50%。

(3)引物的处理

由于引物延伸从3,端开始，3,端不能进行任何修饰，引物5,端对扩增特异性影响不大。

有时需要使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5,端添加不

同的限制酶的识别序列，保证目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环化。

(4)引物的选择和互补链的判断

DNA聚合酶只能特异性地复制处于2个引物之间的DNA序列，弓|物5,端的碱基与DNA

母链3,端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，DNA子链的合成方向

是从引物开始由5,端向3,端延伸。

3.PCR技术中的数量关系

物质（复制）1次2次3次n次

DNA分子数2482〃

含引物的DNA分子数2482"

含引物A（或B）的DNA分子数1=2-13=22—17=23—12n~\

同时含引物A、B的DNA分子数0=2」22=22—26=23—22K—2

共消耗的引物（A和B）数量2=22—26=23—214=2f2"+1—2

两条单链等长的DNA分子数0=21—20=22—42=23—62n~2n

DNA分子种类2455

举题固法

考向1PCR的过程与引物设计

题1（2021・江苏卷）某小组为研究真菌基因m的功能，构建了融合表达蛋白M和tag标签

的质粒。请结合实验流程回答下列问题：

SmaI

引物P2/上游同源序列CCCGGG下游同源序列

5r5,-GGAnCTAGA;ACTAGTGGATCCCCCCCC|!GGGGAAAATTTATATTTT|CAAGGTCAAT-3,

沟而1

3I-CCTAAGATCT!TGATCACCTAGGGGGGGG!!CCCCTTTTAAATATAAAA!GTTCCAGTTA-5,

基因加y-----------------------------—

1PCR扩增、、、、、经单酶切

5'

3_________----------

添加同源序列的6载体A启动子tag序列

酶处理URA3AmpR

R43：酵母筛选标记基因，

缺失该基因酵母无法合成尿嗓咤

Amp--.大肠杆菌筛选标记，

氨茉青霉素抗性基因

UR43用结合体AmPR

A-tag序列：编码特定氨基酸序列，

|导入大肠杆菌可被特异性抗体识别

（（.fj,X切，导入酵母

II扇动子tag序列II~~-----------

URA3_培养筛选融合tag标签

获得目的菌株的童白M

重组质粒Am

（1）目的基因的扩增

①提取真菌细胞RNA，经逆转录获得cDNA,进一步获得基因机片段。

②为了获得融合tag标签的蛋白M,设计引物P2时，不能包含基因机终止密码子的编

码序列，否则将导致蛋白M上不含tag标签。

③热启动PCR可提高扩增效率，方法之一是先将除ThqDNA聚合酶（7hq酶）以外的各成

分混合后，加热到80。。以上再混入酶，然后直接从94℃开始PCR扩增。下列叙述

正确的有.BC。

A.Kzq酶最适催化温度范围为50〜60℃

B.与常规PCR相比，热启动PCR可减少反应起始时引物错配形成的产物

C.两条子链的合成一定都是从5,端向3,端延伸

D.PCR产物DNA碱基序列的特异性体现了Taq酶的特异性

（2）重组质粒的构建

①将S/naI切开的载体A与添加同源序列的机混合，用特定DNA酶处理形成黏性末

端，然后降温以促进.黏性末端碱基配对一，形成A—m结合体。将A—机结合体导入

大肠杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等,完成质粒的环化。

②若正确构建的重组质粒A—机仍能被S/naI切开，则SmaI的酶切位点可能在

因加的连接处、基因加的内部_。

（3）融合蛋白的表达

①用含有尿喀咤的培养基培养UR43基因缺失型酵母，将其作为受体菌，导入质粒A—

m,然后涂布于无尿喀咤的培养基上，筛选获得目的菌株，其机理是.受体菌在无尿喀

陡的培养基上无法生长，导入重组质粒的受体菌含有UR43基因，可以长成菌落一。

②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，说明.融合基因表达（或

融合基因正确解码），后续实验可借助tag标签进行蛋白M的分离纯化。

解析：（1）①以逆转录获得cDNA的方式，要先从真菌细胞中提取基因m转录出来的

mRNAo②从构建好的重组质粒上看，tag序列位于目的基因下游，若机基因的转录产

物mRNA上有终止密码子，核糖体移动到终止密码子时多肽链就断开，则不会对tag序

列的转录产物继续进行翻译，蛋白M上就不含tag标签。③hq酶在延伸阶段发挥作用，

最适催化温度范围为72℃左右，A错误；PCR反应的最初加热过程中，样品温度上升

到70℃之前，在较低的温度下引物可能与部分单链模板形成非特异性结合，并在

KzqDNA聚合酶的作用下延伸，结果会导致引物错配形成的产物的扩增，影响反应的特

异性，热启动可减少引物错配形成的产物扩增，提高反应的特异性，B正确；DNA分

子复制具有方向性，都是从5,端向3,端延伸，C正确；hq酶对碱基序列没有特异性，

与普通的DNA聚合酶相比，酶更耐高温，D错误。（2）①从图上看，载体A只有一

个SmaI的酶切位点，故被SmaI切开后，载体由环状变为链状DNA,将SmaI切开

的载体A与添加同源序列的机混合，用特定DNA酶处理形成黏性末端，然后降温以

促进载体A与添加同源序列的m的黏性末端碱基互补配对。将A-m结合体导入大肠

杆菌，利用大肠杆菌中的DNA聚合酶及DNA连接酶等，完成质粒的环化。②重组质

粒中，载体A被S/nal切开的位置已经与基因机相连，原来的酶切位点已不存在，若

正确构建的重组质粒A-m仍能被SmaI切开，则SmaI的酶切位点可能在基因m的

连接处或基因m内部。（3）①筛选目的菌株的机理是导入了质粒A—机的目的菌株由于

含有URA3基因，能在无尿喀陡的培养基上存活，而URA3基因缺失型酵母则不能存

活。②若通过抗原一抗体杂交实验检测到酵母蛋白中含tag标签，位于tag标签上游的

基因机应该正常表达，说明融合基因表达（或融合基因正确解码）。

审答指导

流程图的解题步骤：①搞清图例或特别说明；②根据单箭头分析流程的变化；③了解每

个特殊步骤的文字说明的目的或指向；④小题干的小情境中，寻找填空处前后的逻辑关

系；⑤没有明显逻辑关系的，则需要从流程图中寻找答案。

座式（2020.江苏卷）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出

已知序列两侧的序列，具体流程如下图所示（以EcoRI酶切为例）。请据图回答问题：

染色体DNA

5~~短有序列E记知序列1未知序列（片段F

n连接DNA连接酶

已知序列、

PCR引物环状DNA

IU扩增|TagDNA聚合酶

&PCR产物

IV测序、分析|

，片段F的

完整序列

⑴步骤I用的EcoRI是一种限制性内切核酸（或限制）酶,它通过识别特定的―核

昔酸序列一切割特定位点。

⑵步骤H用的DNA连接酶催化相邻核甘酸之间的3，一羟基与5，一磷酸间形成.磷酸二

酯键一；PCR循环中，升温到95℃是为了获得DNA单链；K/qDNA聚合酶的作

用是催化以DNA为模板的DNA链的延伸o

（3）若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR弓I物，步骤DI选用的PCR引物必

须是一②④_（从引物①②③④中选择，填编号）。

DNA序列（虚线处省略了部分核昔酸序列）

已知

5AACTATGCGCTCATGA•••GCAATGCGTAGCCTCT-3'

iiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii

序列3,-TTGATACGCGAGTACT-CGTTACGCATCGGAGA-5,

①5，一AACTATGCGCTCATGA—3'

PCR②5，一GCAATGCGTAGCCTCT—3'

引物③5，一AGAGGCTACGCATTGC—3'

④5'-TCATGAGCGCATAGTT—3'

⑷对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中（虚线处

省略了部分核甘酸序列），结果正确的是_L。

A.5'—AACTATGCG...AGCCCTT—3'

B.5f-AATTCCATG...CTGAATT-3f

C.5'—GCAATGCGT…TCGGGAA—3'

D.5'—TTGATACGC...CGAGTAC—3'

解析：DNA连接酶是在相邻的核甘酸之间形成磷酸二酯键。引物与对应的模板链能够

碱基互补，且方向相反，步骤ni需要扩增出片段F的完整序列，需要包括已知序列两端

的未知序列，所以需要引物②（其3,端与环状DNA内链已知序列的5,端互补）和④（其3,

与环状DNA外链已知序列的5,端互补）。观察图知，片段F两侧均有EcoRI切割后的

末端，EcoRI的识别序列是G1AATTC,所以F片段一条链的5,端开始肯定是AATTC,

只有B符合。

审答指导

引物的选择或设计类问题的解决

（1）一定要知道的原则：引物延伸的方向是不变的，子链一定从5,端向3,端延伸。

（2）具体操作：①沿着引物的方向确定模板DNA；②确定引物延伸得到的目标DNA；③

找到引物与模板DNA的结合位置；④引物一定是模板链的互补链，且方向一定是从夕

端—3,端。

考向2PCR技术中的数量关系

无（20H.江苏卷节选）请回答基因工程方面的有关问题：

（1）利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（见下图）。图中引物为

单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。

n变性

vu

第

一

轮

循

环

①理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为15/16。

②在第」一轮循环产物中开始出现两条脱氧核甘酸链等长的DNA片段。

（2）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组弓I物（只标注了部分碱基序歹U）

都不合理（见下图），请分别说明理由。

第1组1「弓1物1...............................................

引物CAGGCT

【引物D•---------r-T—r-T-r-1--------------

AGCCTG

「耳|物I\..................................................................

第2组J

引物+AACTGCAGTT

CGACTGATTA

①第］组：引物I和引物n局部发生碱基互补配对而失效；

②第2组：引物「自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。

（3）PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶

的功能，这是因为DNA聚合酶只能将单个脱氧核昔酸连续结合到双链DNA片段的

引物链上

解析：（1）①由图可知，由原来的每条母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引

物A或引物B,而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第

四轮循环共产生16个DNA分子，其中含有引物A的分子是15个，占15/160②PCR

过程需引物，画出反应过程如下图所示:

两条链等

长的DNA

片段

-----两条链等

-----长的DNA

-----片段

第一轮第二轮第三轮

由图示可知，第一、二轮循环合成的DNA的两条链长度均不同，第三轮循环产生的DNA

分子存在等长的两条核甘酸链。（2）在第1组引物中，引物I的部分碱基序列是一

CAGGCT-,引物H的部分碱基序列是一AGCCTG—,若利用这两个引物进行DNA扩

增，会因其中的这部分碱基发生碱基互补配对而使引物失效。在第2组引物中，引物「

的部分碱基序列是一AACTG—和一CAGTT一,该引物一旦发生自身折叠，也将会出现

部分碱基互补配对而使引物失效。（3）图中直接将两个脱氧核甘酸合成DNA单链，这不

能反映DNA聚合酶的功能，因为DNA聚合酶只能在DNA模板存在的条件下，将单个

脱氧核甘酸连续结合到DNA片段的引物链上。

考向3新情境下PCR技术

题3（2023•常州期末）重叠延伸PCR技术是常规PCR技术的衍生，它依据需要连接的基

因中核昔酸序列（或基因片段）设计出多对具有互补末端的引物，先分段对模板进行扩增,

再将PCR产物混合，其中的重叠链将相互搭桥、互为模板而延伸，最终实现不同来源

的扩增片段重叠拼接起来的目的，如图1所示。请分析并回答下列问题:

引用1I⑧

I@引说

—1

—1-

外显子AB

图1

吆心

5'^——■夕

35，

5'引物A，55|^c3

蛋白A基因及设计的四种引物

图2

⑴图1中的过程②在2个反应体系中进行,原因是引物互补影响PCR结果。经

过程②后，体系中存在不同长度的DNA片段，获取所需DNA的方法是（琼脂糖凝胶）

电泳分离一。①中引物2和引物3的游离部分分别与.外显子B、外显子A-的部分序

列同源。

⑵图1中的过程⑥一不需要.（选填“需要”或“不需要”）另加引物,原因是两条DNA

的交错部分即可作为其延伸的引物一。进行②⑥⑧⑩过程时，需要在一定的缓冲溶液中

进行，⑩过程除图示条件还需要加入.原料（四种脱氧核昔酸）、耐高温的DNA聚合酶

（ThgDNA聚合酶）。

（3）重叠延伸PCR技术可用于基因的定点突变。基因定点突变是根据目的基因（如图2蛋

白A基因）的序列，设计4条单链寡核昔酸片段为弓|物（图2中的引物A-D）,原理是取

弓I物A、B进行PCR1反应，以及弓I物C、D进行PCR2反应，然后将需要的两个片段

混合、延伸并大量扩增。图2引物B和引物C中的“人”代表.突变碱基一，引物B和引

物C碱基序列间存在的关系是一互处

解析：（1）过程②中的引物2和引物3会发生部分互补，需要2个反应体系。分离不同

长度的PCR产物，可通过琼脂糖凝胶电泳进行。由图1可知，①中引物2和引物3的

游离部分分别与外显子B、外显子A的部分序列同源。（2）由于引物2有一部分与外显

子A重叠，另一部分与外显子B重叠，可作为其延伸的引物，所以图1中的过程⑥不

需要另加引物。②⑥⑧⑩为PCR过程，除了图中的引物、模板、缓冲液外，还需要添

加四种脱氧核甘酸和ThqDNA聚合酶。（3）基因定点突变是根据目的基因的序列，使基

因上的某碱基缺失、增添或替换，故图2引物B和引物C中的“A”代表突变碱基。分

析图2可知，引物B和引物C碱基序列间存在互补关系。

问题

»（2023・江苏卷）为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构

建质粒，如图1所示。请回答下列问题：

拟构建的注：EGFP荧光蛋白

基因结构—AnBl纳米抗体

PCR引物及

“目的产物片段

线性质粒

基因重组载体

克隆流程

注：—表示PCR引物;

相同背景方框表示

同源序列。

01

(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板、

引物，扩增程序中最主要的不同是.退火温度.。

(2)有关基因序列如图2。引物F2—F、Fl—R应在下列选项中选用CD。

EGRP基因序歹!J：5"ATGGTGAGCAAGGGC...GACGAGCTGTACAAG3"

基因序歹U：5'CATGTCCAGCTGCAG...CCAAAACCACAACCA3'

图2

A.ATGGTG...CAACCA

B.TGGTTG...CACCAT

C.GACGAG...CTGCAG

D.CTGCAG...CTCGTC

(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用

于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有.限制酶、

DNA连接酶。

(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有ABC。

A.稀释涂布平板需控制每个平板30〜300个菌落

B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高

C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落

D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化

(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1

—F和F2—R进行了PCR扩增，质粒P1〜P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结

果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4o

.MPlP2P3P4

Dp,‘‘'’]’》‘，

300()—

2()0()—

100()———

500

250—

图3

(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是

电泳只能测定DNA长度，不能确定碱基序列。

解析:本题主要考查基因工程的相关知识。⑴PCR反应进行的条件包括引物、酶、dNTP、

模板和缓冲液(其中需要Mg2+)等。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两

个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)和引物。PCR过程包括变性、复性和延

伸三个阶段，通过温度的变化进行控制，由于引物和模板存在差异，扩增程序中最主要

的不同是退火温度。(2)据图分析可知，PCR扩增片段F1与片段F2后，需要通过重叠

延伸的方式构建融合基因。引物F2-F的部分序列与引物F1-R的部分序列可互补，

且引物F2-F的部分序列与F1片段(EGFP)靠近右侧(3,端)的序列一致；引物F1-R的

部分序列与F2片段(AnBl)靠近左侧(5,端)的序列互补配对，因此引物F2—F和引物F1

-R的序列分别与C和D对应。(3)传统重组质粒构建需要使用限制酶切割质粒使其具

有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质

粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下发生同源重组形成环

化质粒，不需要使用限制酶和DNA连接酶。(4)采用含有抗生素的培养基筛选，利用稀

释涂布平板法接种，可能形成的菌落数较低，不在30〜300的范围内，A错误；抗性平

板上未长出菌落的原因可能是重组质粒未能成功导入大肠杆菌，B错误；转化后的大肠

杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落,

故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细

菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化,D正确。

(5)EGFP为720bp,AnBl为390bp,二者的总大小为720bp+390bp=l110bp,用引

物Fl—F和F2-R进行了PCR扩增，Pl、P2的扩增产物与电泳结果符合，可以舍弃

的质粒有P3、P4。(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，无法

确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常

需进一步通过基因测序确认。

题2（2022.江苏卷）纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引发多种疾病。因此，

研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题：

⑴纤毛结构如图I所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由脂质和蛋白质.组成。基

体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是发出星射线，形成纺锤体（与纺

锤体的形成有关］。

（2）某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基

因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓

度，将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0mol1-1的目的是—渣

解DNA。PCR扩增时，需在一耐热/耐高温的DNA聚合酶（hqDNA聚合酶）催化

下，在引物的3，端进行DNA链的延伸,获得扩增产物用于测序。

（3）为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋

白具有绿色荧光，可指示其在细胞内位置。将x—GRP基因融合片段M导入如图n所

示载体质粒Y,构建Y—M重组质粒（在EcoRV位点插入片段）。请完成下表。

限制酶识别序列

BamHIG^GATCC

EcoRVGAT，ATC

HindIIIA^AGCTT

5g/IIA^GATCT

序列编号Y—M连接处测序后部分序列

QI5\..AGATCTCCGATATT...3"

Q25L..AGATCTCCAAGCTT..3

Q35\..AAGCTTCCGGATCC...3"

Q45"...AAGCTTCCGATATC...3'

图m

分步实验目标简易操作、结果、分析

①选择图II引物.a、b；②PCR目的产物约为

PCR鉴定正向重组质粒Y—M

100bp

确保M及连接处序列正确③质粒测序，图ni中正确的是04（选填序列编号）

④对照质粒Y—GFP（仅表达GFP）与实验质粒Y—M

分别导入细胞,发现对照组整个细胞均有绿色荧光而

检测融合蛋白定位

实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X在细

胞中定位于纤毛基部

（4）为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人

基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA,经逆转录形成cDNA作为模板，PCR

扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人。值为15,而病人。值为

20（。值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数）。从理论上估算，在PCR扩增

20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的倍。

解析：（1）纤毛膜是由细胞膜延伸而来，故成分是一样的，主要是脂质和蛋白质。中心体

与有丝分裂过程中纺锤体的形成有关，动物细胞有丝分裂前期，中心体发出星射线，形

成纺锤体。（2）DNA在0.14mol-L-1的NaCl溶液中溶解度最低，而可溶于2.0moLL-i的

NaCl溶液，故添加NaCl至2.0molL-i的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在耐高温

的DNA聚合酶（即TaqDNA聚合酶）的催化下，在引物的3,端进行DNA链的延伸（DNA

的合成方向是从5,端到3,端）。（3）由图中限制酶切位点和引物箭头方向可知，PCR应选

择图H中的引物a和引物b,则PCR目的产物长度约为300+800=1100bp。在EcoR

V位点插入片段构建Y—M重组质粒，则Y—M的连接处上游应含有HindHI+EcoR

V的识别序列，下游应含有EcoRV+及/机HI的识别序列，根据图HI中各限制酶识别

序列，表中序列Q4符合。实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X在细胞中定位于

纤毛基部。（4）RNA经逆转录形成cDNA。。值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR

循环数，健康人。值为15,而病人。值为20,说明病人基因Z表达较弱，达到同样

强度时，健康人比病人多5个循环，故从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物

中，健康人样品的目的产物大约是病人的25=32倍。

审答指导

表格型试题的考查主要以实验设计和操作步骤、结果结论的分析为主体，因此对探究性

实验要整体和局部相结合，要点和易错点相结合，分析卡点，疏通堵点，抓住增分点，

建立操作要点和实验目的之间的“因果循环关系”。基因工程和PCR问题中常以此形式，

或结合其他情境进行综合考查。

衍射训练

由于C4途径有更高的光合作用能力，科学家正试图采用基因工程手段将C4植物的相关

基因克隆到水稻（C3植物）中以提高产量。下表是相关研究中的一些步骤，请根据题意完

成以下表格。

实验目的方法步骤要点

获得目的基因PCR扩增出目的基因片段

构建载体质粒将目的基因克隆进Ti载体质粒

大量培养水稻细胞①进行植物细胞培养获得愈伤组织

转化细胞用农杆菌转化

转基因细胞筛选②用含抗生素的培养基筛选（或用选择培养基筛选）

③调控培养基中生长素与细胞分裂素的比例诱导形成完整

诱导植株形成

植株.

转基因植株分析④PCR鉴定基因、酶活力测定、测定光合作用能力一

配套精练

1.（2023•扬州中学）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带

（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反

应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（D）

A.增加模板DNA的量B.延长热变性的时间

C.延长延伸的时间D.提高复性的温度

解析：增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异条带；延长热变

性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不

能有效减少反应非特异条带；非特异产物增加的原因可能是复性温度过低，造成引物与

模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异条带的产生。

2.循环阈值（。值）是通过PCR等技术手段，使病毒的核酸扩增产物达到可检测水平所

需的循环次数。下列说法错误的是（B）

A.Ct值为40和Ct值为35的核酸扩增产物的量可能相等

B.G值越高，则表示所检测的样本中病毒浓度越高，检测所需的时间越长

C.PCR反应过程中每次循环都要消耗两种引物

D.PCR反应缓冲液中添加的Mg2+可以激活耐高温的DNA聚合酶

解析：由于样品中的核酸含量不同，则。值为40和。值为35的核酸扩增产物的量可

能相等，A正确；。值越高，则表示所检测的样本中病毒浓度越低，检测所需的时间越

长，B错误；PCR产生的DNA分子是双链的，每条链都需要一种引物，则PCR反应过

程中每次循环都要消耗两种引物，C正确；用PCR扩增目的基因时，反应缓冲液中一

般要添加Mg?+来激活耐高温的DNA聚合酶，D正确。

3.（2024•连云港调研）数字PCR技术通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同

的反应单元，每个单元最多包含一个拷贝的目标分子（DNA模板），在每个反应单元中分

别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析,

如下图所示。下列相关叙述错误的是（B）

O无荧光

稀释、分装荧光PCR・有荧光

待分析PCR每个反应单元中最检测荧光并计数，

反应体系多含有1个DNA分子得出目标分子起始拷贝数

A.PCR每一循环包括变性、复性（退火）和延伸三步

B.数字PCR可以在常温下进行，降低了检测成本

C.每个反应单元有无荧光取决于是否含有目标分子

D.数字PCR可实现对样品中目标分子的绝对定量分析

解析：PCR每一循环都包括变性、复性和退火三步，A正确。数字PCR也是体外DNA

复制，需要高温使DNA变性，B错误。每个单元最多包含一个拷贝的目标分子，如果

反应单元中有目标分子，经PCR可以扩增大量目标分子，利用荧光检测时出现荧光信

号。如果反应单元中没有分配到目标分子，反应单元不进行DNA复制，没有产物，利

用荧光检测时不出现荧光信号，C正确。起始待测样品分配时，待分析PCR反应体系

每个反应单元中最多分配有1个DNA分子，所以检测时，有多少单元有荧光信号，待

测样品中起始就有多少DNA分子，所以数字PCR可实现对样品中目标分子的绝对定

量分析，D正确。

4.（多选）（2024.淮安调研）引物在极大程度上决定了PCR的成败，下列关于引物的说法，

正确的有（ABD）

A.PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，PCR引物一般是单链DNA

B.若引物的CG碱基含量相对较高，PCR退火步骤的温度需要适当升高

C.在PCR的退火步骤，两种引物分别结合在模板链的3,端和夕端

D.若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10轮循环，至少需要20460个引物分子

解析：PCR和生物体内的DNA合成都需要引物，体内的DNA复制引物通常是RNA,

PCR引物一般是单链DNA,A正确；G与C之间有3个氢键，稳定性高，若引物的CG

碱基含量相对较高，PCR退火步骤的温度需要适当升高，B正确；在PCR的退火步骤，

两种引物都结合在模板链的3,端，C错误；若初始有10个胰岛素基因，PCR中进行10

轮循环，得到10x21°个=10240个DNA分子，共1024x2=20480条链，由于初始的

20条链不需要引物，故至少需要20480—20=20460个引物分子，D正确。

5.（多选）（2023・南通期末）多重PCR是指在反应体系中加入多种引物，最终扩增出多种

目的DNA片段的技术，如图。相关叙述正确的是（ACD）

一科白母基因A

弓［物^

一寸小川基因B

引物对c

0一尸产A尸基因C

_丁基因D

A.多重PCR加入的引物之间不能互补配对形成局部双链

B.不同对引物的退火温度差异越大，扩增的特异性越强

C.多重PCR扩增出的大小不一的DNA片段可用电泳检测

D.多重PCR可用于多种病原体感染的检测

解析：多重PCR加入的不同引物的碱基排列顺序不能互补，如果互补，就会造成引物

之间形成双链，不能与模板链结合，降低扩增的效率，A正确；一般而言，引物的GC

含量越高，结合特异性越强，扩增的特异性越强，B错误；电泳技术可分离不同大小的

DNA分子，故多重PCR扩增出的大小不一的DNA片段可用电泳检测，C正确；PCR

鉴定病原体的原理是碱基互补配对，该体系中加入多种引物，最终扩增出多种目的DNA

片段，故多重PCR可用于多种病原体感染的检测，D正确。

6.(多选)(2024•南通10月质监)交错PCR能实现同源基因的重组(如图，仅示单链)。第

一轮延伸15s,获得短产物①②。在第二轮开始时(95℃)产物①②与原来模板分开，然

后(55℃)随机地与不同模板交错结合，延伸15s,合成交错产物③④。每一轮扩增仅延

伸一小段，经过多轮“产物一模板”交替结合、延伸，最终扩增出交错重组基因产物。相

关叙述正确的是(AB)

引物引物

A.交错PCR原理是DNA半保留复制

B.交错PCR延伸温度设定为55℃可增加交错次数

C.上一轮交错产物需与模板链严格配对才能继续下一轮扩增

D.若交错循环20轮，一共产生220个DNA分子

解析：交错PCR是PCR技术的延伸，利用了DNA半保留复制，A正确；在第二轮开

始时(95℃)产物①②与原来模板分开，然后(55℃)随机地与不同模板交错结合，延伸15

s,合成交错产物③④，故延伸温度设定为55℃可增加交错次数，B正确；交错延伸PCR

与普通PCR技术的区别是每轮扩增仅延伸一小段，经过多轮“产物一模板”交替结合、

延伸，最终扩增出交错重组基因片段混合产物，故上一轮交错产物不需与模板链完全配

对也可继续下一轮扩增，交错循环20轮，也可能只产生1个DNA分子，C、D错误。

7.基因定点突变是指按照特定的要求，使基因的特定序列发生插入、删除、置换、重

排等变异。图甲是一种PCR介导的基因定点突变示意图，图乙是研究人员利用基因Ml

构建基因表达载体的过程。请回答下列问题：

|引物|引物2

；二二一二J基因M

丽^/引物4

AnB

----------基因M]

BamHlGJGATCC

注：|代表酶切位点，HindmA|AGCTT

--------代表两段特定DNA序列PstlCTGCAIG

甲乙

(1)进行基因定点突变的PCR反应体系中，除加入引物和模板DNA外，一般还需要加

入预酶、dNTP(缓冲液、M『+)等,图甲所示的基因定点突变技术需要3次PCR,

获得产物A需要的引物是引物1和引物3。

(2)研究人员对PCR的中间产物A、B进行纯化后，利用图中相关酶对基因M和产物

A、B进行充分酶切后得到不同的片段，长度(kb)如下表，则图中基因敲除片段的长度

为。23kb,基因Ml的长度为6.09kb。

基因MAB

长度3.24、2.8、0.15、0.132.8、0.093.24、0.05

(3)通过图甲过程获得的基因Ml仍需要大量扩增，此时选择的引物是引物1和引物

2，为了与图乙中的Ti质粒相连,还需要分别在它们的5端引入限制酶H泳HH、

Ps/I的识别序列。

(4)构建基因表达载体时，Ml基因必需插入Ti质粒的T—DNA中,原因是Ti质粒

上的T—DNA能够转移并整合到受体细胞的染色体上。

解析：(1)进行基因定点突变的PCR反应体系中，除加入引物和模板DNA外，一般还

需要加入Taq酶、dNTP(缓冲液、Mg?+)等。从图甲可以看到，从加入引物到获得基因Ml

总共经历了3