核酸核酸检测技术41讲解

核酸Nucleicaciddetectiontechnology核酸检测技术第二节

转录与逆转录成熟的RNA分子DNA转录RNA前体加工DNA指导下RNA的合成RNA的转录后加工一、转录（DNA指导下RNA的合成）（一）概念转录：DNA指导下RNA的合成。以DNA为摸板，4种核糖核苷酸（NTP）为底物，在RNA聚合酶的作用下，按照碱基互补规律，合成RNA链的过程。转录的不对称性

与转录出的RNA顺序相同的一条链（仅T代替U）编码链（codingstrand，+链）转录时，DNA双链不是同时作为模板，而是在一定条件下，只有一条链（或其上某些区域）可作为转录的模板。

为RNA提供转录模板的链。

模板链（templatestrand，-

链）编码链（正链）模板链（负链）编码链（正链）模板链（负链）不是所有基因的编码链都位于DNA分子的同一条链上。ABCD编码链基因的转录是有选择性的。-并不是全部DNA都必须转录-根据细胞实际需求，特定的基因“开放”或“关闭”，具复杂的调控机制。一、转录（DNA指导下RNA的合成）RNA的转录起始于DNA模板的一个特定位点，并在另一位点处终止，此转录区域称为转录单位。真核生物例：mRNA编码的转录单位原核生物转录单位（单顺反子）（1个基因）转录mRNA1种蛋白质翻译转录单位（多顺反子）（多个基因）转录mRNA多种蛋白质翻译（二）转录单位一、转录（DNA指导下RNA的合成）（三）RNA聚合酶：大肠杆菌的RNA聚合酶全酶由5个亚基α2ββσ组成，五个亚基的功能分别为：α亚基：具体功能不详。β亚基：含催化部位，起催化作用，催化形成磷酸二酯键。β’亚基：与DNA模板结合功能。σ亚基：识别起始位点。大肠杆菌RNA聚合酶全酶示意图真核细胞的RNA聚合酶酶类分布产物α-鹅膏蕈碱对酶的作用I核仁rRNA5.8SrRNA18SrRNA28SrRNA不抑制Ⅱ核质mRNAtRNA低浓度抑制Ⅲ核质5SrRNA高浓度抑制一、转录（DNA指导下RNA的合成）RNA聚合酶的特点1、反应底物：NTP，DNA为模板、Mg2+促进聚合反应。RNA聚合酶不需要引物，合成方向5

3。2、利福平抑制原核生物RNA聚合酶活性；α-鹅膏蕈碱抑制真核生物RNA聚合酶活性。一、转录（DNA指导下RNA的合成）（四）、RNA的转录过程：（以大肠杆菌为例）转录起始链的延伸转录终止RNA的合成不需要引物。1.转录起始指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。启动子-35序列提供了RNA聚合酶全酶识别的信号；-10序列是酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）；第三部分是RNA合成的起始点。启动子的结构至少由三部分组成AACTGTATATTATTGACATATAAT+1转录起始点5’3’3’5’－35序列

提供RNA聚合酶全酶识别信号-10序列双链解开区域DNA序列的书写方式（编码链）+15

3

转录起点上游upstream下游downstream转录单位的起点核苷酸定为+1，起点的左侧为上游，用负的数码表示，起点的右侧为下游，即转录区。RNA聚合酶全酶扫描解链区，找到起始点，然后结合第一个核苷三磷酸。加入的第一个核苷三磷酸常是GTP或ATP，很少是CTP，不用UTP。所形成的启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点，σ亚基就会被释放脱离核心酶。

E-35-10pppG或pppA5‘5‘3‘3‘模板链因子仅与起始有关，RNA的合成一旦开始，便被释放2.RNA链的延伸DNA分子和酶分子发生构象的变化，核心酶与DNA结合比较松弛，可沿DNA模板移动，并按模板顺序选择下一个核苷酸，将核苷三磷酸加到生长的RNA链的3’-OH端，催化形成磷酸二酯键。转录延伸方向从5’

3’在DNA分子上（基因末端）提供转录停止信号的DNA序列称为终止子（terminators),它能使RNA聚合酶停止合成RNA并释放出RNA。3.转录终止原核生物中RNA的转录过程模板的识别转录的起始转录的延伸转录的终止3

5

35

3

5

一、转录（DNA指导下RNA的合成）（五）、真核生物的转录作用真核生物的转录与原核生物转录比较，主要区别：RNA聚合酶不同启动子不同转录后RNA加工修饰不同一、转录（DNA指导下RNA的合成）（六）、RNA的转录后加工在细胞内，由RNA聚合酶合成的原初转录物（primarytranscript）往往需要一系列的变化，包括链的裂解、5

和3

末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的RNA分子。此过程总称为RNA的成熟或称为RNA的转录后加工。原核生物的mRNA转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译。真核生物mRNA需要进一步进行加工修饰转化为成熟的mRNA。加工包括：（1）mRNA前体的剪接，把内含子（DNA上非编码序列）转录序列剪掉，把外显子（DNA上的编码序列）转录序列拼接上（真核生物一般为不连续基因）。（2）3’端添加polyA“尾巴”；（3）5’端连接“帽子”结构；（4）分子内部的核苷酸甲基化修饰。1、mRNA前体的加工原核与真核生物的tRNA转录后都需要加工。包括：（1）由核酸内切酶切除前体上3

和5

端上多余的核苷酸；（2）由核酸外切酶逐个在3

切去附加序列，进行修剪。（3）3’端添加CCAOH序列，由核苷酰转移酶催化。（接受活化AA）（4）核苷的一些特定的碱基和戊糖进行修饰。2.tRNA前体的加工原核与真核生物的rRNA转录后也都需要进行加工。原核：刚转录的rRNA为30S，先在特定的碱基上进行甲基化修饰，然后逐步裂解，最后形成5sRNA、16sRNA、23sRNA。真核：与原核生物相似，但甲基化程度比原核生物高。刚转录的rRNA为45S，最后形成5.8srRNA、18srRNA、28srRNA。3.rRNA前体的加工二、逆转录（一）、定义以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA。二、逆转录（二）、逆转录酶1970年从致癌RNA病毒中发现的逆转录酶。具有三种功能：依赖于RNA的DNA聚合