梅花鹿胚胎移植技术规范

1DB2201/—2021梅花鹿胚胎移植技术规范本文件规定了胚胎移植的基本原则、前期准备、胚胎移植、胚胎的冷冻保存和解冻、妊娠检查和记录的要求。本文件适用于梅花鹿胚胎移植。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4143牛冷冻精液3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1胚胎移植embryotransfer将良种母鹿体内早期胚胎或体外受精及其他方式获得的早期胚胎，移植到同种生理状态相同的受体母鹿体内，使之继续发育成个体的技术。3.2供体鹿donor在胚胎移植过程中提供胚胎的母鹿。3.3受体鹿recipient在胚胎移植过程中接受胚胎的母鹿。3.4同期发情synchronizationofestrus利用某些激素制剂人为地控制并调整母鹿的发情周期进程，使之在预定时间内集中发情。3.5阴道栓vaginalsuppository一种内含孕酮、用特制的放置器将其放入阴道的同期发情装置。3.6发情鉴定oestrusidentification对母鹿发情征状的确定。3.7超数排卵multipleovulation2DB2201/—2021在母鹿发情周期的适当时间，应用外源促性腺激素处理，使卵巢比自然发情时有更多的卵泡发育并排卵，简称为“超排”。3.8人工授精artificialinsemination用人工方法适时将精液输入发情母鹿生殖道内达到受孕，以代替公母鹿交配而繁衍后代的一种繁殖技术。3.9冷冻精液frozensemen经特殊方法处理的精液超低温冷冻后在液氮中（-196℃)长期保存。4基本原则4.1供体和受体母鹿应为同一属种。4.2供体鹿和受体鹿发情时间相差不应超过24h。4.3从供体鹿输卵管内收集到的胚胎应移植到受体鹿的输卵管内，从供体鹿子宫角内收集到的胚胎应移植到受体鹿的子宫角内。4.4胚胎发育应处于周期黄体期内。4.5胚胎质量优良，应在处理过程中避免不良因素的影响。5前期准备5.1供体鹿和受体鹿选择5.1.1供体鹿选择5.1.1.1品种优良，生产性能好。5.1.1.2遗传性能稳定，谱系完整。5.1.1.3体质健壮，无遗传疾病、生殖疾病和传染性疾病。5.1.1.4产历清楚，无流产史，性周期正常，繁殖机能好，年龄在3～5周岁的成年母鹿。5.1.2受体鹿选择5.1.2.1健康、营养状况良好，无遗传疾病、生殖疾病和传染性疾病。5.1.2.2繁殖性能良好，发情周期正常，母性和哺乳能力良好，无流产史，产后60d以上的经产母鹿，年龄应在2～5周岁。5.1.2.3配种两个发情周期以上不孕的母鹿不应选作受体。5.1.2.4受体鹿的体型大小应接近或者大于供体鹿的体型大小。5.1.3供体与受体比例供体鹿和受体鹿的比例应为1:3～4。5.2供体鹿和受体鹿的饲养管理5.2.1胚胎移植前8周应加强饲养管理。5.2.2应分群组群，保持受体鹿饲养环境的相对稳定与卫生，避免应激。3DB2201/—20215.2.3应在饲喂全价日粮饲料基础上，补充盐、矿物质、维生素和微量元素，保持营养平衡、饮水充足，加强舍外活动。5.3同期发情5.3.1供体鹿在任意一天放入含有孕激素阴道栓（CIDR），12d后撤掉，同时肌肉注射孕马血清促性腺激素（PMSG）300IU～350IU。5.3.2受体鹿5.3.2.1同期处理之前应进行直肠触摸或超声波检查，检查卵巢是否有周期性黄体。5.3.2.2操作步骤同5.3.1。5.3.2.3同期发情处理后，密切观察，通过直肠触摸或超声波检查卵泡发育状态，观察发情。5.3.3发情鉴定CIDR取出后12h开始用试情公鹿每隔2h～4h试情一次，每次持续0.5h～1h。母鹿稳定接受爬跨即为发情。记录母鹿接受爬跨的时间。5.4供体鹿超数排卵放置CIDR当天记为第0d，放CIDR第9d开始注射促卵泡素(FSH)，每天注射两次间隔12h，早晚各1次，4d8次等量或减量注射。到第12d～13d结束，共注射FSH320mg。第7次注射FSH时取出CIDR。5.5人工授精5.5.1精液品质检查5.5.1.1新鲜精液色泽乳白色或淡黄色。精子活力≥70%，精子密度≥1.2×109mL,精子畸形率≤15%。5.5.1.2冷冻精液应符GB4143的规定。精子活力≥30%，精子畸形率≤15%，细菌数≤800个，每管冻精的有效精子数在1000万以上。5.2.1操作步骤a)精液准备：鲜精应稀释使用，温度保持在25℃左右；细管冻精应用38℃±2℃温水直接浸泡解冻，无需稀释，时限1h；b)确认母鹿发情接受爬跨后，进行第一次输精，间隔8h～12h重复输精一次；c)保定母鹿，外阴应清洗消毒；d)把精液装入无胶塞注射器，并连接输精管，排出空气，若为冻精剂量为2支/头e)抹无菌润滑剂，手持输精管缓慢插入母鹿阴道内，小心通过子宫颈插入子宫体，推入精液，将输精管缓慢退出，完成输精。6胚胎移植4DB2201/—20216.1手术冲胚6.1.1时间应在供体母鹿第一次配种后6d～7d。6.1.2器材套管针、冲胚管及内芯、肠钳夹、注射器、培养皿、量筒、毛剪、镊子、手术刀、手术缝合针和缝合线、创布、止血纱布、体式显微镜、恒温板等。6.1.3药品新洁尔灭、0.9%生理盐水、胚胎保存液（Holding液）、酒精、碘伏、青霉素、链霉素、石蜡油、麻醉药、解麻药等6.1.4冲胚液的配置杜氏磷酸盐缓冲液（PBS），配方参见附录A。或者使用商品冲胚液。6.1.5步骤6.1.5.1供体母鹿应在术前24h内禁食禁水，手术在冲胚室进行。6.1.5.2供体母鹿应进行全身麻醉，呈前低后高仰卧保定。6.1.5.3麻醉后的母鹿应进行术部备皮，用温水清洗，5%碘酊和75%酒精消毒。6.1.5.4在腹部中线距乳房约4cm处做一切口，将两侧子宫角和输卵管暴露，观察左右卵巢上的黄体发育情况并记录。6.1.5.5在子宫角基部用止血钳穿孔，插入冲胚管，由充气管注入5mL左右空气，使气囊封阻子宫腔；在子宫角和输卵管结合部的子宫角端插入套管针，拔出针芯，将装有冲胚液的50mL注射器接到套管针上，注入35℃~37℃的冲胚液30mL～50mL，将胚胎从子宫角的上端冲出，由冲卵管的出液孔收集于培养皿（直径90mm）中，放气后取下冲胚管。6.1.5.6将子宫角放回体内，并用0.9%的生理盐水进行冲洗，并注入2mL石蜡油以防止生殖道连。6.1.5.7缝合伤口，撒抗生素（青霉素和链霉素并在术后的3d内每天注射2次青霉素（8000000IU/6.2胚胎质量鉴定6.2.1检胚在实验室（检胚室）内20℃~25℃常温下，将冲胚后回收液平皿放在30℃的恒温板上，置于体式显微镜下，划分区域进行检查，检查顺序参见图1。检出的胚胎用吸卵器及时移入PBS中进行鉴定，确定受精与否及胚胎发育阶段。5DB2201/—20216.2.2胚胎质量分级6.2.2.1配种后6d～7d的供体鹿，处于以下发育期：桑椹胚（M）、致密桑椹胚（CM）、早期囊胚（EB）、囊胚（B）或扩张囊胚（EXB）。6.2.2.2按形态学将胚胎划分为1、2、3、4四个等级，1、2、3级胚胎为可用胚胎，4级为不可用胚胎。a)1级：发育正常，胚龄与发育期一致，胚胎细胞团成均匀对称的球形，轮廓清晰，分裂球大小均匀，结构紧凑，色调和透明度适中，无游离的细胞和液泡，或很少，变性细胞比例少于10%；b)2级：胚龄与发育期基本一致，轮廓清晰，分裂球大小基本一致，色调和透明度及细胞密度良好，可见到一些游离的细胞和液泡，变性细胞占10%～30%；c)3级：胚龄与发育期不太一致，轮廓不清晰，色调过暗或过淡，细胞密度小，结构较松散，游离的细胞或液泡较多，变性细胞达30%～50%；d)4级：发育阶段迟缓、细胞不均匀、变性细胞占胚胎大部分；未受精卵。6.3移植6.3.1器具手术刀、手术缝合针和缝合线、腹腔内窥镜、宫6.3.2药品6.3.3步骤6.3.3.1受体鹿术前准备同6.1.5.1、6.1.5.2和6.1.5.3的处理方法。6.3.3.2在乳房前方腹中线两侧各切开一个0.5cm～1cm长的小口，一侧插入打孔器和腹腔镜，另一侧插入宫颈钳。通过腹腔镜和宫颈钳相互配合观察受体鹿的卵巢状态，记录黄体数目。6.3.3.3将卵巢上有1～3个黄体侧的子宫角取出，在子宫角的上1/3部位穿刺，连接上结合有1mL注射器的移植套管针。6.3.3.4将含有1～2枚胚胎的0.3mL～0.5mL的Holding液，通过1mL注射器注入子宫角，缓慢拔出移植套管针。6.3.3.5受体鹿左右创口各缝1针，外涂5%碘酊。6.3.3.6移植后肌肉注射黄体酮。6DB2201/—20217胚胎的冷冻保存和解冻7.1冷冻保存7.1.1器具实体显微镜、胚胎冷冻仪、液氮罐、细管、胚胎吸管、0.22µm过滤器、培养皿、记号笔等。7.1.2保存液与冷冻液7.1.2.1保存液：含有20%犊牛血清(CS)的PBS液。7.1.2.2冷冻液：8%乙二醇（EG0.1mol/L海藻糖（Tre.m-PBS＋20%CS，用0.22µm滤器过滤灭菌分装。7.1.3胚胎装管胚胎应在保存液微滴中清洗4次，后在冷冻液微滴中清洗4次。将胚胎吸入0.25mL细管内，用封口机封口、分类、标记，在4℃的冰箱内放置平衡10min～15min后放入冷冻仪。7.1.4胚胎冷冻保存胚胎冷冻仪温度降至-6℃~-7℃,保持2min后进行人工植冰，继续保持至10min，以0.3℃/min的速率降温至-35℃~-38℃,保持10min后，直接放入盛有液氮的液氮罐中保存，并定期检查和加液氮。7.2解冻从液氮中取出装有胚胎的细管，空气浴6s后32℃~35℃水浴10s，用消毒纸擦干细管，再用半干的酒精棉球擦拭细管表面，晾干，剪开细管封口端(如用细管塞封口的则拔出即可)，细管棉塞端朝里装入移植枪供移植。应在解冻后10min内完成移植。8妊娠检查应在移植结束后90d采用超声波法检查，确认母鹿是否怀孕以及胎儿发育情况。9记录胚胎移植过程中应记录供体鹿超数排卵、输精、冲胚、受体鹿移植情况,记录内容可参考附录B。7DB2201/—2021杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）配方A.1杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）配方表A.1杜氏磷酸盐缓冲液（PB