醋纤膜电泳课件

血清蛋白质

醋酸纤维素薄膜电泳

（Electrophoresisoncelluloseacetatemembraneofserumproteins)醋纤膜电泳实验目的1、掌握醋酸纤维素薄膜电泳的原理2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白质的实验操作技术和注意事项。3、了解醋酸纤维素薄膜作支持物进行电泳的优点及使用范围。醋纤膜电泳电泳技术电泳：溶液中带电粒子在直流电场向着电极相反方向移动的现象称为电泳（electrophoresis）。电泳技术是利用带电粒子在电场作用下定向移动的特性，对混合物组分进行分离、纯化和测定的一项技术。醋纤膜电泳电泳的分类按分离目的：分析电泳和制备电泳按电场强度：常压电泳和高压电泳按电泳媒介：自由电泳和区带电泳区带电泳（按支持介质）：淀粉凝胶电泳滤纸电泳

醋酸纤维素薄膜电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳按支持介质形式：水平式电泳、垂直电泳按缓冲液pH值：连续pH和不连续pH电泳醋纤膜电泳临床电泳项目临床上以琼脂糖电泳法开展的电泳项目：血清蛋白电泳免疫固定电泳尿蛋白电泳同工酶电泳脑脊液寡克隆电泳本周氏蛋白电泳脂蛋白电泳醋纤膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳

采用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜，干燥后就成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，厚度约为120μm，通透性好，对分子移动阻力少，是一种良好的电泳支持物。醋纤膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳的优点及应用具有微量、快速、简便、区带清晰、灵敏度高、便于摄影和保存等优点。用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如血浆蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、同工酶等的分离鉴定。醋纤膜电泳

原理

血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。醋纤膜电泳

血浆蛋白质的等电点、

平均相对分子量、及正常含量

球蛋白清蛋白

Aα1α2βγpI相对分子量（×104）含量（%）4.886.957~725.06202~55.06304~95.129~156.2~126.85~7.315.6~3012~20醋纤膜电泳实验材料健康人血清或动物血清醋纤膜电泳试剂1、pH8.6巴比妥缓冲液2、氨基黑10B染色液3、漂洗液4、洗脱液5、透明液（试剂配制参见实验讲义）定量时用醋纤膜电泳仪器和器材1、常压电泳仪、电泳槽2、醋酸纤维素薄膜（2×8cm）3、点样器（载玻片或盖玻片）、玻璃板4、培养皿（泡膜、染色和漂洗用）5、滤纸6、镊子7、试管、试管架、吸量管8、分光光度计（定量用）醋纤膜电泳操作步骤1、薄膜准备①将醋酸纤维素薄膜切成2×8cm的小条。②在薄膜粗面一端1.5cm处用铅笔轻轻画一横线。③在薄膜角上用铅笔作一标记。④将醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中20min。

醋纤膜电泳操作步骤醋酸纤维素薄膜规格及点样位置8cm2cm点样线点样区1.5cm(粗面）点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多,用铅笔做好标记（组号以及蛋白名称）醋纤膜电泳操作步骤2、电泳仪准备在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高。先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。醋纤膜电泳操作步骤3、点样（电泳的关键步骤）用镊子把膜条从缓冲液中取出，夹在两层滤纸中间，吸去多余的液体，然后平铺在玻璃板上（粗面朝上），将点样器先在培养皿的血清中沾一下，再在膜条点样线处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。点样线尽量点得细窄而均匀。宁少勿多。醋纤膜电泳操作步骤4、上槽待血清吸入膜后，以薄膜粗面向下、点样端置阴极端，两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平，加盖，平衡约5min，使薄膜渗透的缓冲液达到平衡。

切勿使点样处与电泳槽接触醋纤膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图醋纤膜电泳操作步骤5、电泳检查电泳装置是否正确，开启电源，调节电压、电流，然后通电40~60min。

电压：110~130V（10V/cm膜长）薄膜的有效长度是两电极缓冲液面之间滤纸盐桥和薄膜的长度之和。

电流：0.4~0.6mA/cm膜宽有数条膜便求数条膜宽的总和。

醋纤膜电泳操作步骤6、染色和漂洗电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换2~3次），至背景颜色脱净为止。取出膜，用滤纸吸干即可。醋纤膜电泳操作步骤血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳图谱－＋电泳方向Aα1βγα2醋纤膜电泳血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果醋纤膜电泳醋纤膜电泳操作步骤7、透明薄膜完全干燥后，浸入透明液中20min后，取出平贴在玻璃板上（不要留有气泡），完全干燥后即成透明的薄膜图谱，要作扫描或照相用。可长期保存。醋纤膜电泳操作步骤8、定量（略）①洗脱比色法②光密度计扫描法醋纤膜电泳血清蛋白电泳光密度扫描醋纤膜电泳临床意义1、M蛋白（异常免疫球蛋白）血症：在β-球蛋白区、γ-球蛋白区或两者之间，出现区带细而浓，有时呈波浪状，在光密度计扫描图上呈尖陡高峰的M蛋白带。2、蛋白质缺乏症3、肾病4、急慢性炎症5、肝病：肝硬化出现“β-γ桥”原发性肝癌在Alb与α1-球蛋白之间出现一小的区带，称为甲胎蛋白带。醋纤膜电泳几种疾病的蛋白电泳变化病名

Alb

1

2

肾病肝硬化原发性肝癌多发性骨髓瘤慢性炎症无丙种球蛋白症双白蛋白血症↓↓↓↓↓↓↑

↑↑↓AFP

↑↑↑↓

↑

↑

-

桥

↑

↓↑↑↑↑↑↑↓↓

醋纤膜电泳醋纤膜电泳操作流程1、薄膜准备2、电泳仪准备3、点样4、上槽5、电泳6、染色及漂洗醋纤膜电泳注意事项1、最好选用同一批号、厚薄均匀、质量良好的醋纤膜。2、样品要新鲜。3、点样要细窄、均匀、集中。4、盐桥要平整。5、电泳槽盖要密封。6、室温不宜过高。醋纤膜电泳注意事项7、选择