第十章高效液相色谱法叶桦珍福建卫生89课件

第十章

高效液相色谱法叶桦珍福建卫生职业技术学院教学目标

掌握化学键合相色谱法；高效液相色谱法对固定相和流动相的要求与选择方法。熟悉实验条件的选择；高效液相色谱仪的组成。了解高效液相色谱法的特点和分类；高效液相色谱法在药物分析中的应用。第三节

实验条件的选择一、色谱柱相关条件的选择（一）色谱柱填料类型选择

高效液相色谱的色谱填料种类较多，如硅胶、高分子多孔微球、化学键合相、包覆聚合物柱填料、微粒多孔碳填料等。化学键合固定相最常用。化学键合相

化学键合相是利用化学反应通过共价键将有机分子键合到载体表面，形成牢固、均一的单分子薄层。不易流失，稳定性高，色谱柱使用寿命长；均一的单分子薄层，传质阻力小，传质快，柱效高；分离选择性高，适用于不同性质物质的分离；可用于梯度洗脱，重现性高；载样量大。

1.化学键合相的特点2.化学键合相的分类化学键类型Si-O-Si-C型Si-O-CSi-N型固定液的极性极性键合相键合基团为-CN、-NH2

正相色谱中等极性键合键合基团为醚基和二羟基非极性键合相键合基团为C18、C8

反相色谱离子交换键合相

（二）色谱柱规格的选择

常用的分析型色谱柱柱长10cm～25cm，内径2.1mm～4.6mm，填料粒径3～10μm,用于常规的分离分析。半制备柱与制备柱内径一般在6mm以上，用于制备目的。快速分析柱的内径一般为6mm或更大，柱长30〜80mm，填料粒径为3um或者更小,适应于快速分析需求。微径柱内径1mm或更小内径的毛细管柱，适应于电色谱等特殊需要。（三）色谱柱柱温的选择

色谱柱柱温会影响分离效果和分析时间，柱温的波动会影响分析结果的重现性，实验中应维持柱温的恒定。如无特殊说明色谱柱温度系指室温，色谱柱的最高使用柱温为60度调高柱温会加快传质，缩短分析时间。二、流动相相关条件的选择（一）高效液相色谱法流动相的要求1.纯度要高配制流动相的水要求为高纯水或二次蒸馏水，溶剂为色谱纯试剂。2.黏度要低 采用甲醇、乙腈等低粘度的溶剂可降低色谱柱柱压，提高柱效。3.化学惰性不能与固定相或被测组分发生任何化学反应，不改变填料的任何性质。4.溶解度适宜对试样有适宜的溶解度，试样在流动相中不能析出。（二）流动相种类的选择

常常采用烃类等非极性或弱极性有机溶剂为主体，加入醇、氯仿、乙腈等极性较大的溶剂调节其极性

常常采用水或无机盐缓冲液、弱酸、弱碱作为主体，加入甲醇、乙腈、四氢呋喃等有机溶剂调节其极性1.正相键合相色谱法2.反相键合相色谱法3.流动相洗脱方式的选择

等度洗脱：在洗脱过程中流动相的组成恒定

梯度洗脱：洗脱过程中流动相的组成和配比不断改变，需配有梯度洗脱装置。

应用梯度洗脱时，应注意以下问题：（1)所用溶剂的纯度要很高（2)溶剂间要有互溶性（3)混合溶剂的粘度会随组成而变化，在梯度洗脱时会出现压力的变化

（4)应用缓冲溶液与有机溶剂混合时可能会析出盐的结晶体，尤其使用

磷酸盐时需特别小心。（5)进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辩认溶剂杂质峰。（三）流动相应用要求1.须新鲜制备2.使用前应过滤3.使用前应脱气4.贮液瓶中流动相应足量5.维持流动相的pH在一定的范围内6.防止含缓冲盐的流动相中缓冲盐的析出7.应用不同流动相时注意“过渡”为保护色谱柱，实验中流动相应避免组成及极性剧烈变化。三、检测器的选择

检测器的种类

适合检测的对象紫外检测器（UVD