第四章基因工程的主要技术及其原理

第四章基因工程的主要技术及其原理第四章基因工程的主要技术及其原理凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖就是从海藻中提取出来得一种线状高聚物,就是由D—半乳糖与3、6—脱水—L—半乳糖结合得链状多糖

猪基因组DNA及PCR产物电泳仪,电泳槽,电子天平,移液器,枪头,微波炉,紫外透射检测仪等。琼脂糖,1XTAE电泳缓冲液,溴化乙锭(EB),6X载样缓冲液:Ⅰ0、25%溴酚蓝,0、25%二甲苯青,40%蔗糖水溶液;Ⅱ0、25%溴酚蓝,0、25%二甲苯青,30%甘油水溶液实验材料、器具及药品相关知识:①影响琼脂糖凝胶DNA迁移速率得因素、迁移速率由DNA得分子大小、琼脂糖浓度、DNA得构象、所加电压、电场方向、碱基组成与温度、嵌入染料得存在、电泳缓冲液得组成等许多参数确定。

表琼脂糖浓度与DNA分离范围

实验步骤⑴1g琼脂糖加入100ml1×TAE电泳缓冲液中,摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。(冷却到60℃,加入100μl得0、5mg/mlEB,并摇匀。)⑵用胶带将制胶板两端封好,插入适当梳子,将溶解得琼脂糖(约50℃)倒入,室温冷却凝固⑶充分凝固后撕掉两端得胶布,将凝胶置入电泳槽中,加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm,小心垂直向上拔出梳子。(4)用移液器吸取总DNA或质粒样品4μl于点样板上,再加入上样缓冲液loadingbuffer,混匀后,小心加入点样孔。⑸打开电源开关,调节电压至3-5V/cm,可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动,电泳约30min-60min。⑹将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。⑺将染色后得凝胶置于紫外透射检测仪上,盖上防护观察罩,打开紫外灯,可见到发出荧光得DNA条带。实验步骤结果与分析

图2基因组DNA1%琼脂凝胶电泳图结果与分析

图2

PCR产物琼脂凝胶电泳图

(1、2、3、4为PCR产物,M为DL2000Marker)琼脂糖凝胶电泳装置实验步骤制胶90℃以上熔化,凝胶温度35-43℃EB1231、孔深2、预留尺寸3、梳子宽度1+2=胶得厚度3大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静-+加缓冲液拔梳子最好在电泳槽中-+点样-+电泳紫外﹢﹣﹣﹢电泳结果分析DNA空间结构电压

EB脉冲电场(PFGE)解决大分子DNA电泳问题Blotting定义:印迹法(blotting)就是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应得探测反应来检测样品得一种方法。1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上,并利用DNA－RNA或者DNA-DNA杂交检测特定得DNA片段得方法,称为Southern印迹法。而后人们用类似得方法,对RNA与蛋白质进行印迹分析,对RNA得印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后得蛋白质分子得印迹分析称为Western印迹法,对双向电泳后蛋白质分子得印迹分析称为Eastern印迹法(1)Southern印迹杂交法限制性内切酶酶切

检测杂交信号

提取DNA

Southern法可用于检测特异得DNA序列片段,进行基因定位、分子量测定等。SouthernBlotPartI:GelelectrophoresisfollowedbytransfertoamembraneDNACleavedwitharestrictionenzymeSmearofrestrictionfragments80度烘烤1-2hSouthernBlotPartII:HgybridizationofDNAonmembranetospecificprobeDNAstainedwithethidiumbromideautoradiographofhybridizedmembraneSouthernBlotNorthernBlotprobedwithb-globinUndifferentiatedcells+differentiationfactorNote:MakenorthernjustlikeaSouthern,exceptrunoutRNAsamplesratherthanDNAMeasuresthesteady-statelevelofmRNAtranscriptfromagivengeneSmearofRNAtranscripts

核酸杂交技术就是目前研究核酸结构、功能常用手段之一,不仅可用来检验核酸得缺失、插入,还可用来考察不同生物种类在核酸分子中得共同序列与不同序列以确定它们在进化中得关系,其主要应用如下图所示:核酸杂交及其应用示意图Ⅰ、变性、复性与杂交。粗细线分别代表不同DNA。A就是杂化双链Ⅱ、突变体得鉴别。B代表天然DNA;C就是B得缺失突变体;虚线框内就是已缺失得部分;D就是显示从天然DNA链鼓出小泡

Ⅲ、粗线代表探针,粗线上得X表示放射性标记

在核酸杂交得基础上发展起来得一种用于研究与诊断得非常有用得技术称探针技术(Probe)。

探针技术在遗传性疾病诊断上已开始应用。例如诊断地中海贫血或血红蛋白病,可以由已确诊得病人白细胞中提取DNA,这就就是诊断探针。用诊断探针检查,不但可以对有症状患者进行确诊,还可以发现一些没有症状得隐性遗传性疾病。如从胎儿得羊水可以提取到少量DNA后,再用探针技术对此进行产前诊断各种遗传性疾病已在临床上开展。

杂交与探针技术就是许多分子生物学技术得基础,在生物学与医学得研究中,以及临床诊断中得到了日益广泛得应用。Westernblot实验技术

MakingaprobeUsetheknownaminoacidsequenceofaproteinSynthesiseashortDNAsequenceinvitroAA:phemettrpglucysasnCodons:UUUC

AUGUGGGAAGUGUCAAUCProbe:AAAGTACACCCTTCACAGTTAG-P32Ashortsequenceofaproteinisusedtodesignasetofoligonucleotidesforuseasaprobetorecoverthegenethatencodedtheprotein、OneoftheprobesequencewillbeaperfectmatchforthegeneWesternBlot基本原理

在电场得作用下将电泳分离得多肽从凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽得特异抗体来检测。WesternBlot一般流程蛋白样品得制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中得蛋白质。稀盐与缓冲系统得水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、就是提取蛋白质最常用得溶剂。

细胞裂解液:50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40,0、05%PMSF,2μg/mLAprotinin,0、5μg/mLLeupeptin,pH8、0

有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多得蛋白质可用有机溶剂提取,包括乙醇、丙酮与丁醇等。通过层析或电洗脱法制备目得蛋白蛋白样品得制备蛋白样品得定量Bradford法

考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色得形式,在一定浓度得乙醇与酸性条件下,可配成淡红色得溶液,与蛋白结合后形成蓝色化合物,该化合物在595nm处有最大吸收值,化合物颜色深浅与蛋白得浓度高低成正比。(上样量)试剂:考马斯亮蓝工作液,0、1N盐酸,双蒸水,蛋白标准液(将10mg/ml蛋白溶液稀释至4、0mg/ml,3、5mg/ml,3、0mg/ml,2、5mg/ml,2、0mg/ml,1、5mg/ml,1、0mg/ml,0、5mg/ml。)管号012345678ddH2O807070707070707070蛋白标准液01010101010101010样品101010101010101010HCL101010101010101010SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理:SDS就是一种离子性得界面活性剂,它有强离子性得硫酸根离子也带有疏水性得长碳链、当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用、大多数蛋白质与SDS得平均结合量就是1:1、4(以重量为单位),而蛋白质结合固定比例之SDS後,由於SDS带强负价,使蛋白质原先得带电价微不足道,且每单位重量之蛋白质带电价一致(chargedensity),所以决定不同蛋白得泳动速率就只剩下分子大小一项因素丙烯酰胺与N,N’-亚甲双丙烯酰胺

SDS配胶得Tris缓冲液TEMED过硫酸铵(时间)Tris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成份凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度(％)线性分离范围(KD)1512-431016-687、536-945、057-212转膜膜的选择尼龙膜硝酸纤维素膜封闭非特异性抗体结合麻烦简单快速封闭非特异性抗体结合价格昂贵价格便宜特殊要求下的选择需要更高的蛋白结合率（尼龙膜：480µg/cm2

；硝酸纤维素膜：80µg/cm2

）目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱需要更大的机械强度转膜半干法将凝胶与固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间,电转10－30min。湿法将凝胶与固相基质夹在滤纸中间,浸泡在转移装置得缓冲液中,电转45min或过夜。

转膜后检测丽春红S染色蛋白带出现后,于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜,换水几次。印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针得Western印迹过程。封闭脱脂奶粉(5％)BSAWesternBlot膜封闭液(生物试剂公司提供)一抗、二抗孵育把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中,根据滤膜面积以0、1ml/cm2得量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37℃一小时,4℃过夜。倒掉一抗溶液,用PBS漂洗液滤膜3次,每次10min。加入用封闭液配制得二抗,摇床上缓慢摇动,37℃一小时,4℃过夜。倒掉一抗溶液,用PBS漂洗液滤膜3次,每次10min。二抗与底物反应显色辣根过氧化物酶法(HRP)碱性磷酸酶法(AP)化学发光显色法(HRP)WesternBlot常见问题分析SDS电泳胶不平？凝胶漏液？胶板洗刷干净加入APS与TEMED得量要合适加入试剂后摇匀,使其充分混合,防止部分胶块聚合不均匀温度合适,受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐条带比正常得窄？“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀,灌胶时候尽量混合均匀,动作轻缓拔梳子要迅速,清洗加样孔要小心,以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其她条带导致宽窄不一,纯化样品,调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果,应赶走气泡。同时注意电泳槽装置就是否合适转膜及抗体检测凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄,“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通得草纸确保膜与胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低,电流或电压太高。转膜过程注意降温背景太高膜没有均匀浸湿膜或者缓冲液污染封闭不充分抗体与封闭剂出现交叉反应抗体浓度过高

原原因对策转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应杂交前检测一抗、二抗的工作浓度Westernblotissimilarinconcepttonorthern,exceptusepolyacrylamideandrunoutproteinsSouthern,Northern,andWesternanalyses免疫化学检测法Usingantibodiestodetectaclone重组体得转化利用物理方法导入、转化

1、质粒得Ca2+诱导转化(E、coli)2、质粒得原生质体转化

3、质粒得高压电穿孔法转化

4、显微注射法转化利用生物方法导入、转染1、细胞噬菌体DNA得转染2、动物病毒DNA得转染3、植物病毒DNA得转染大肠杆菌感受态细胞得制备在不含抗生素得LB平板上涂布大肠杆菌DH5α,于37℃培养过夜(16-20h);挑一个单菌落接种于25mL无菌得LB培养液中,37℃中速震荡培养3h;将上述菌液在冰浴5分钟,然后在4℃,4000rpm离心10分钟;将细菌沉淀用5mL预冷得CaCl2(0、1M)重悬,冰浴一会后于4℃4000rpm离心10分钟;将细菌沉淀用1mL预冷得CaCl2(0、1M)重悬,取200uL用于细菌转化,其余菌液加入20%得无菌甘油,摇匀后于-20℃保存备用;感受态细胞得转化

(1)取2μL连接产物,加入80μL感受态细胞,混匀,冰上放置30min。(2)将反应管快速转移42℃水浴中,热击90s。(3)将反应管快速转移至冰上2min(4)加入500-800μLLB液体培养基。(5)37℃,150rpm复苏1、5h。(6)取100μL菌液涂布于LB固体培养基上(含100μg/mL得Amp)(7)37℃下培养16-24h。TransformingE、coliwithrebinantDNAGrowthofBacteriaPCR技术及其应用

目录PCR得概念PCR技术得创建PCR得原理PCR得反应体系与方法PCR得类型与应用

多聚酶链式反应(PCR:PolymeraseChainReaction)Polymerase:DNA聚合酶

基因组DNA引物DNA聚合酶DNA片段体外扩增PCR技术得创建KaryB、Mullis(穆利斯(美))Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA得设想。

1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana得设想得到实现。

1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq)引入了PCR技术

1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。PCR技术简史

PCR的最早设想：本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。PCR技术PCR技术简史DNA得复制核酸体外扩增得设想聚合酶链反应得发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术PCR技术简史DNA得复制核酸体外扩增得设想聚合酶链反应得发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术PCR技术简史DNA得复制核酸体外扩增得设想聚合酶链反应得发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术PCR技术简史PCR得改进与完善:Mullis最初使用得DNA聚合酶就是大肠杆菌DNA聚合酶I得一个片段,其缺点就是:①此酶不耐高温,90℃会变性失活,每次循环都要重新加。PCR技术②其PCR产物特异性较差,合成得DNA片段不均一。引物链延伸反应在37℃下进行,容易发生模板与引物之间得碱基错配,此种酶催化得PCR技术虽较传统得基因扩增具备许多突出得优点,但由于酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引生物医学界得足够重视。PCR技术PCR技术简史94℃55℃37℃PCR技术简史1988年初,Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR,其扩增得DNA片段很均一,真实性也较高,只有所期望得一种DNA片段。但每循环一次,仍需加入新酶。PCR技术TaqDNA聚合酶得特点:①耐高温,在70℃下反应2h后其残留活性大于原来得90%,在93℃下反应2h后其残留活性就是原来得60%,在95℃下反应2h后其残留活性就是原来得40%。②在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性与扩增效率,增加了扩增长度(2、0Kb)。由于提高了扩增得特异性与效率,因而其灵敏性也大大提高。PCR技术PCR技术简史Taq

DNA聚合酶(thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)405060708090100100806040201988年Saiki等将耐热DNA聚合酶(Taq)引入了PCR技术72℃94℃55℃PCR循环PCR技术得原理1PCR技术得基本原理

无细胞分子克隆法:在微量离心管中,加入适量得缓冲液,微量得模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA得引物,通过高温变性、低温退火与中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段得基因拷贝数放大一倍,一般样品就是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段得DNA带。

加热变性复性复温DNA得变性与复性加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋得氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA得变性。解除变性得条件后,变性得单链可以重新结合起来,形成双链,其原有得特性与活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。

PCR反应条件PCR过程PCR反应条件PCR过程PCR得基本原理PCR反应条件PCR过程1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目得DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR技术PCR得基本原理PCR反应条件PCR过程PCR得特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR技术复习PCR得基本原理PCR反应条件PCR过程PCR得特点95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR技术PCR得基本原理PCR反应条件PCR过程PCR得特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR技术PCR得基本原理PCR反应条件PCR过程PCR得特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR技术PCR得基本原理PCR反应条件PCR过程PCR得特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR技术PCR得基本原理PCR反应条件PCR过程PCR得特点72℃第2轮结束PCR技术PCR得基本原理PCR反应条件PCR过程PCR得特点重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR技术2PCR技术得特点1)高度得灵敏性30轮循环扩增量达230个拷贝(109拷贝)PCR产物每轮循环增加一倍2)特异性引物引物

引物得序列及其与模板结合得特异性就是决定PCR反应结果得关键。引物设计得最大原则就是最大限度地提高扩增效率与特异性;同时尽可能减少非特异性扩增。引物设计:(1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。(2)引物长度以15-40bp为宜。(3)碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。(4)引物内部避免形成二级结构。(5)两引物间避免有互补序列。(6)引物3’端为关键碱基;5’端无严格限制。3)操作简便易行PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1μg基因组DNA中仅含数个拷贝得模板序列。通常得DNA扩增法就是分子克隆法,首先要构建含有目得得基因得载体,然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化与培养等相关得过程,操作复杂,一般需要数周时间。目得基因载体复制子宿主细胞扩增扩增提取DNA分子4)用途广泛生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学PCR得反应体系与方法PCR管加热使模板变性,退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温(72℃),在Tap多聚酶得作用下,以dNTP为原料,以引物为复制得起点,合成新链。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火与中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段得基因拷贝数放大一倍,一般样品就是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段得DNA带。

1反应体系标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uBuffer（Mg2+）

1.5mmol/LPCR技术PCR技术得基本过程(1)模板DNAdNTP引物Buffer预变性模板DNAdNTP引物BufferTaqDNA聚合酶94oC5’2基本过程PCR技术得基本过程(2)Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer循环仪94℃55℃72℃Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer72℃5～7min循环25～35次琼脂糖凝胶电泳PCR技术得基本过程(3)1)PCR反应成分(1)模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应得非特异性增加。3PCR反应条件(2)引物浓度

0、1-0、5mol/L

浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。(3)Taq

DNA聚合酶(thermusaquaticus)0、5-2、5U/50l

酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。(4)dNTPdNTP浓度取决于扩增片段得长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基得掺入,浓度过低则降低反应产量

dNTP可与Mg2+结合,使游离得Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶得活性。(5)Mg2+

Mg2+就是DNA聚合酶得激活剂。0、5mmol/L-2、5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降;Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等得浓度影响反应中游离得Mg2+浓度。2)循环参数变性使双链DNA解链为单链

94oC20-30秒(2)退火温度由引物长度与GC含量决定。增加温度能减少引物与模板得非特异性结合;降低温度可增加反应得灵敏性。(3)延伸

70-75℃,一般为72℃

延伸时间由扩增片段长度决定(4)循环次数主要取决于模版DNA得浓度一般为25-35次次数过多:扩增效率降低错误掺入率增加经典循环参数(500bp以内)94℃30s55℃45s72℃1min94℃5min×30次72℃7min42℃forever1)不对称PCR

目得:扩增产生特异长度得单链DNA。方法:采用两种不同浓度得引物。分别称为限制性引物与非限制性引物,其最佳比例一般就是0、01∶0、5μM,关键就是限制性引物得绝对量。用途:制备核酸序列测定得模板制备杂交探针

基因组DNA结构功能得研究PCR得类型

高浓度引物低浓度引物2)反向PCR(reversePCR)

就是用反向得互补引物来扩增两引物以外得DNA片段对某个已知DNA片段两侧得未知序列进行扩增。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段得序列;用于仅知部分序列得全长cDNA得克隆,扩增基因文库得插入DNA;建立基因组步移文库。已知序列未知序列未知序列已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶连接酶3)多重PCR(复合PCR)用于检测特定基因序列得存在或缺失。电泳引物1234123