食品毒理学 食品毒理实验讲义学习课件

实验一小鼠经口半数致死剂量（LD50）测定一、实验目的（一）通过本次实验掌握经口灌胃技术，了解半数致死量的意义。（二）通过本次实验学习半数致死量的计算和评价．二、测定方法本试验以灌胃方式测定氯丙烯的LD50。（一）实验动物与分组：试验前取体重为18-25g小鼠，观察3-7天，以了解其正常活动情况和健康状态。试验时，称体重、编号、按随机分组原则，将试验动物分成5组，每组10只，雌雄各半。（二）剂量选择：首先了解受试化学物的化学结构及理化性质，查阅寻找与受试化学物化学结构及理化性质相近似的其它化学物毒性资料（LD50），以此LD50值作为受试化学物的预期毒性中值，即中间剂量组，再上下各推1～2个剂量组，进行预试验．但应注意，动物种系和给药途径相同的毒性资料才可用作预期毒性中值。各剂量组的间距可很据LD50计算方法要求按等比级数或等差级数安排，本实验用机率单位法计算LD50，要求按等比级数排列，常用1：0.8比例，如氯丙烯的最高剂量为1125mg/kg，其次组剂量为1125mg/kg×0.8=900mg/kg；依次类推为720、576和461mg/kg五个剂量组。（三）受试化学物配制与稀释1.溶剂水溶性受试化学物以蒸馏水为溶剂配成溶液，脂溶性受试化学物以吐温－80、二甲基亚讽、植物油、淀粉等配成混悬液。2.受试物的稀释倍数根据小鼠灌胃量决定。如氯丙烯用吐温－80配成10、21.5、46.4、100mg/ml的浓度，最后计算出不同体重和不同剂量组实验动物应灌胃的容量（毫升数）。见表一。表一不同体重和不同剂量组灌胃的容量（毫升数）计算表体重（g）1000mg/kg464mg/kg215mg/kg100mg/kg灌胃重量（mg）灌胃容量（ml）灌胃重量（mg）灌胃容量（ml）灌胃重量（mg）灌胃容量（ml）灌胃重量（mg）灌胃容量（ml）170.171819202122232425262728（四）灌胃方法1.灌胃实验要求动物禁食12～16h后给药，以免因食物多而影响吸收，毒物可以其原液、水溶液、植物油液、乳状液或混悬液等。一次灌胃液体积为小鼠0.2～0.8m1，大鼠1～4m1，灌胃后3h以上再给动物喂食，然后观察7～14天内动物死亡数并记录死亡时间。2．灌胃方法1)大鼠及小鼠：左手固定大鼠、小鼠头颈背部及尾部，尽量使其体位垂直，右手持连针灌胃导管的注射器，使弯曲面向腹侧，将导管由口腔正中沿咽后壁徐徐插入，遇有阻力时将导管稍许后退，再徐徐前进，一般小鼠插入2.0～2.5cm、大鼠进3～4cm即可，此时可以将注射器向外抽气，如无气体抽出则可将毒物注入。2)大动物：如狗、猫、家免等，可用弹性橡皮管（如导尿管），沿咽后壁插入食道，然后将毒物抽到注射器内，经导管注入胃内，再注入一些清水，将导管内毒物洗净．插导管时要注意，不要插入呼吸道内，以免引起动物窒息。（五）实验观察实验动物灌胃后应详细地观察动物的中毒症状，发生和发展过程及规律，死亡前症状特点，死亡时间等，具体观察内容见表二。表二啮齿类动物化合物中毒主要观察内容系统和器官中毒后常见的表现中枢神系统和神经肌肉系统体位异常、叫声异常、不安、呆滞、痉挛、抽搐麻痹、运动失调、对外反应过敏或迟钝；植物神系统瞳孔扩大或缩小、流涎或流泪；呼吸系统鼻孔流液、鼻孔流液、鼻翼煸动、血性分泌物、呼吸深缓、呼吸过速、仰头呼吸、蜂腰；泌尿生殖系统会阴部污秽、有分泌物、阴道或乳房肿胀；皮肤和毛皮肤充血、紫绀、被毛蓬松、污秽；眼眼球突出、结膜充血、角膜浑浊、血性分泌物；消化系统腹泻、厌食对于中毒死亡的动物，有条件的做病理组织学检查观察记录应尽量准确、具体、完整、主要表现及死亡记录时间，并拟定必要的记录表格。表三急性中毒症状观察记录表化合物名称结构式纯度试验时间室温湿度记录者实脸动物种系来源组别剂量mg/kg动物号性别体重症状及出现时间死亡时间三、LD50计算用查表和统计学方法计算LD50值和95%可信限。（课本page100，表6-13）四、结果评价依据实验动物中毒症状、死亡时间、LD50及急性毒作用带，初步判断该受试化合物的毒性大小及毒性特征。五、注意事项，（一）灌胃时操作要熟练，以免损伤食道或误入气管，如果动物口腔出血应将其废弃，否则影响结果。（二）正确捉拿动物，防止咬伤且避免动物担伤。（三）灌入量计算和操作要准确，否则形响结果的堆确性。（四）防止操作者中毒。当受试化合物为气体或易挥发液体时，配制时应在通风柜内操作，入化合物可损伤皮肤或经皮肤吸收，应注意保护操作者手、脸皮肤和防止溅入眼内。实验二毒物对实验动物生理功能影响试验一、实验目的(一)了解毒物对实验动物生理功能的影响。包括肌肉活动和肌力、神经系统变化等，并以此为指征确定外来化合物的阈剂量。（二）掌握几种简单的生理功能测定方法．（三）对生理功能测定结果作出适当评价。二、测定方法，（一）游泳试验将大鼠或小鼠放入水中，迫使其游泳．小鼠游泳时身体平直贴于水面之下，头微仰，口鼻及眼耳均在水面之上，前肢不动，后肢划水．如小鼠接触外来化合物之后，出现前肢划水，头部不能露出水面、游泳困难，或坚持游泳时间缩短，与正常对照组游泳时间比较，以二者的平均游泳时间的百分差进行评价。2.器材(1)游泳水槽，可用直径约60cm，深约40cm的塑料盆（2）秒表(3）温度计(4）铅皮3.方法与步骤(1)游泳水槽要求有一定的面积（每只小鼠约需100cm2）和深度（大于动物身长约3.5倍），以减少动物之间相互碰撞及保持一定水的压力，水温一般在28-30℃(2)给动物增加一定负荷（负荷重量为体重的2.5-5％为宜），或适当降低水温度，以将小白鼠游泳时向控制在15min到1h左右．（3）动物放入水中，观察记录每只动物沉入水底死亡的时间，为游泳时间。(4）每组动物数不应少于10只。可单一性别或雌雄各半。4.评价对照组与染毒组平行测定，以对照组各动物的平均游泳时间为100，计算出试验组平均游泳时间的百分比值。比值愈小说明毒作用影响愈大。5.注意事项(1)负荷重量对游泳时间有明显影响，因此每只动物的负荷重量（占体重的百分比）应一致。(2)动物游泳时间个体差异很大，并且体重有一定影响。此选择体重近似的小鼠进行分组试验。(3）每次试验条件应一致，包括水温、水深度、饱腹情况．实验三毒物对血清巯基含量影响的测定一、实验目的（一）通过实验学会血清巯基含量的测定方法。（二）通过实验了解毒物对血清巯基含量的影响和意义。二、实验原理血清中的游离巯基可将5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸(DTNB)还原成2-硝基5-巯基苯甲酸而显黄色。反应式：三、试剂与器材（一）试剂1．0.1mol/LTiris-HC1缓冲液(PH8.2)：称取三（羟甲基）氨基甲烷12.11g,EDTANa2（乙二胺四乙酸二钠盐)7.445g加蒸馏水溶解并稀释至1L2.0.0lmol/LDTNB显色剂：称取DTNB(英国进口)39.6mg,溶于10ml无水乙醇中，置棕色瓶内，冰箱保存。3.4mol/L尿素：称取尿素240.24g，加上述缓冲液溶解并稀释至1L。4.巯基标准液(1mmol/L-SH)：称取L－半胱氨酸盐酸盐15.76mg，溶于上述缓冲液至100m1，用前新鲜配制。（二）器材1．721分光光度计2.离心机3.恒温水浴箱。四、方法与步骤（一）按下表进行表一操作内容加入物（ml）测定管(V)调零管（B）血清0.10.14mol/L尿素4.04.0DTNB显色剂0.1无水乙醇0.1混匀后置37℃水浴20min，用721型分光光度计，波长412nm，1cm工作曲线，按下表绘制。表二工作曲线内容及数值加入物（ml）1234567巯基标准液00.050.100.150.200.250.304mol/L尿素4.104.054.003.953.903.853.80DTNB显色剂0.10相当于巯基（mmol/L）00.51.01.52.02.53.0混匀后置37℃（二）样品采集取氯丙烯中毒及正常大鼠血各2m1，离心3000转／分15min取血清。五、评价蛋白质巯基是体内蛋白质具有活性所必需基团之一，它的含量除受某些疾病（如传染病、癌、放射病）影响外，也受许多毒物的影响，如铅、汞、苯、氯丙烯、环氧氯丙烷等中毒时。血清中巯基含量明显降低。因此，测定血清巯基含量，对了解毒物的毒作用有一定的意义。六、注意事项（一）采血时要防止溶血，溶血样品可导致血清巯基含量明显升高。（二）加入液体时注意不要滴在管壁上，以保证加入量的准确．（三）每次比色前，比色杯的透光面要用擦镜纸擦干净。〔四）夏季室温高时，显色15min后应将试管放入冰箱中，以保持显色稳定。实验四微核试验一、实验目的（一）学习小鼠骨髓嗜多染红细胞微核测定方法及评价。（二）了解环磷酰胺对骨髓细胞染色体的损伤作用。二、实验原理微核是指细胞中主核之外的颗粒，染色与细胞核一致，相当于细胞直径的1/20-1/5，呈圆形或杏仁状。微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂时滞留在胞核外的遗传物质。因而，微核试验能检测化学或其它物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。微核可出现于多种细胞，但在有核细胞中难于与正常核的分叶及核突出物区分，故常计数嗜多染红细胞中的微核，因为红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时将主核排出，但仍保留微核于细胞中。三、试剂与器材（一）试剂1.小牛血清（灭活）将滤菌后的血清放入50℃2.甲醇（分析纯）。3.吉姆萨染液4.环磷酰胺（二）器材1.手术剪刀、镊子，2.注射器、针头3.载玻片、盖玻片4:显徽镜、离心机、离心管5.细胞计数器四、操作步骤（一）动物染毒及取材时间选7-12周龄的小鼠，用环磷酰胺(50mg/kg)腹腔注射二次，两次间隔24h，于第二次给药后6h取材。（二）骨髓液的制备小鼠脱颈椎处死，取双侧股骨，用滤纸擦掉附在股骨上的血污和肌肉、剪掉股骨头，暴露骨髓腔，用2m1注射器吸取小牛血清1ml，将针头插入另一端的骨髓腔少许，冲洗入离J心管内，然后，用毛细滴管吹打骨髓团块，使其成为细胞混悬液。（三）离心以1000转／min离心6min，然后弃上清液，留少许血清及沉淀，混匀。（四）涂片、固定、染色吸取混悬液一滴于载玻片一端，按血常规法涂片，将推好晾干的标本玻片放入染色缸中用甲醇固定15min，取出晾干，再用新鲜配制的10%Giemsa染液染色10-15min，冲洗后晾干。五、计算与评价每只动物计数1000个嗜多染红细胞，观察其中含有微核的嗜多染红细胞数，畸变率以千分率表示．如果一个嗜多染红细胞中出现两个或更多的微核，仍按一个细抱计。六、注意事项（一）涂片要薄而均匀，细胞之间互不重叠。（二）涂片染色后冲洗最好用蒸馏水。（三）Giemsa染液应过滤后再应用。（四）实验过程中使用器具应注意清洁。实验五精子畸变试验一、实验目的（一）通过实验学习小鼠精子畸变的检查方法。（二）进一步观察小鼠在染毒后引起精子畸变的类型及意义。二、实验原理化学物引起精子畸变的机理目前尚未清楚，但一般认为，可能是化学物质诱变剂使与精子形成有关的