微生物的培养技术及应用（第一课时）（教学课件）高二生物（人教版2019选择性必修3）

选择性必修三《生物技术与工程》第1章

发酵工程

第2节

微生物的培养技术及应用微生物的基本培养技术（第一课时）目录课堂小结探究新知04情境导入030201课堂练习二.无菌技术一.培养基的配制三.微生物的纯培养情境导入怎样才能保证无处不在杂菌不混入发酵物中呢？酸奶食用自制酸奶导致肠胃不适的事例屡见不鲜，主要原因是在制作过程中有杂菌混入。微生物需要应用无菌技术和微生物的培养技术。微生物是什么呢？微生物微生物

注：

本章提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。

难以用肉眼观察的微小生物

的统称。

等。包括

：病毒大肠杆菌细菌、真菌、病毒及一些原生生物草履草酵母菌微生物结构简单、形体微小，眼睛看不到，若想得到纯净的微生物，就须对其进行培养和分离。2.实验室培养微生物基本要求：①提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件②确保其他微生物无法混入③并将需要的微生物分离出来1.研究和应用微生物的前提（发酵工程的重要基础）是：

、

。防止杂菌污染获得纯净的微生物培养物微生物培养基无菌技术纯化培养1.定义:人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出其生长繁殖的营养基质叫作培养基。①培养、分离、鉴定、保存微生物。②积累其代谢物。2.用途:3.种类:划分标准培养基种类特点应用按照物理性质分类一.培养基的配制

培养基的定义、用途、种类1微生物在固体培养基的表面或内部生长，形成肉眼可见菌落。有无琼脂液体培养基固体培养基藻类中提取一类以半乳糖为主一种高分子多糖、不能提供能量和碳源。液体培养基固体培养基不含凝固剂，呈液体状态含凝固剂(如琼脂)，呈固体状态扩大培养、工业生产等微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种等标准培养基种类培养基特点作用物理性质功能成分来源一.培养基的配制小结：

培养基的类型及用途固体半固体液体培养基加凝固剂，如琼脂加凝固剂,容器放倒不致流出，剧烈震动则破散不加凝固剂分离与鉴定，活菌计数，保藏菌种观察微生物的运动、分类鉴定常用于扩大培养，工业生产选择培养基鉴别培养基天然培养基合成培养基允许特定微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长培养基加入某种指示剂或化学药品,以鉴别不同种类微生物化学成分不明确的天然物质培养基成分明确培养、分离出特定微生物鉴别不同种类微生物工业生产分类、鉴定②氮源：

培养基的成分2①碳源：一.培养基的配制（1）主要营养物质：

。

碳源、氮源、水、无机盐提供碳元素的物质无机碳源：有机碳源：例如CO2、CO32-、HCO3-等（自养微生物的碳源）（异养微生物的碳源）提供氮元素的物质无机氮源：有机氮源：例如N2、NO3-、NH3、NH4＋等例如牛肉膏、蛋白胨、尿素等不添加氮源可用来培养固氮微生物；NH3氧化释放化学能（可提供能量）例如葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等同一种物质既可做作碳源又做氮源。

注：

④水：

培养基的成分2③无机盐：一.培养基的配制大量元素：微量元素：有些无机盐离子可以作为化能合成菌的能源（如铁细菌）Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo等K、Ca、Mg等调节酸碱平衡、维持一定的渗透压培养基常用：K2HPO4MgSO4NaClCa(NO3)2FeSO4良好的溶剂，参与细胞内的多项反应。微生物碳源氮源能源蓝细菌硝化细菌根瘤菌大肠杆菌CO2NH4＋、NO3-等光能CO2NH3NH3的氧化糖类等有机物N2有机物糖类、蛋白质等有机物蛋白质等有机物1.自养型微生物与异养型微生物培养基的主要差别在于

；2.无机氮源不但能给自养型微生物提供

，也能作为

，3.含有C、H、O、N的有机物可作为

微生物的碳源、氮源、能源；碳源氮源能源物质异养型一.培养基的配制

培养基的成分2培养基成分提供的主要营养牛肉膏5g碳源、氮源、磷酸盐和维生素蛋白胨10g碳源、氮源和维生素NaCl

5g无机盐H2O定容1000mL氢元素、氧元素牛肉膏蛋白胨培养基（应用最广泛细菌基础培养基）牛肉膏蛋白胨一.培养基的配制

培养基的成分2

1.分析该培养基的营养构成，上述实例属于固体/液体培养基？液体培养基2.为什么培养基需要氮源？培养基中的氮元素是微生物合成蛋白质、核酸等物质所必需的。未加琼脂牛肉膏牛肉膏和蛋白胨来源动物，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。

微生物乳酸杆菌霉菌细菌厌氧微生物

特殊需求添加维生素pH调至酸性pH调至中性或弱碱性提供无氧环境细菌为7.0~8.0，放线菌为7.5~8.5，酵母菌为3.8~6.0，霉菌为4.0~5.8。（2）特殊条件：

。

pH、特殊营养物质以及O2的需求一.培养基的配制

培养基的成分2主要指生长因子：如:维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。思考：所有微生物是否都可以用培养基进行培养?否。病毒没有细胞结构微生物,必须在活细胞内寄生。无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么作用？无菌技术能有效避免操作者被微生物感染。1.无菌技术：获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。围绕着如何避免杂菌污染展开。两个方面：消毒对操作的空间、操作者的衣着和手灭菌培养细菌用的培养基与培养皿玻棒、试管、烧瓶、吸管和接种环等二.无菌技术

无菌技术2.常用方法：类型操作方法适用范围100℃煮沸5~6min63~65℃消毒30min或72~76℃处理15s或80~85℃处理10~15s用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等紫外线照射30min生物活体、水源等煮沸消毒巴氏消毒化学药物紫外线生物消毒法指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。净化污水、污泥二.无菌技术

消毒11.概念：使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。家庭餐具等生活用品不耐高温的液体，如牛奶接种室、接种箱、超净工作台杀死牛奶中绝大多数微生物，并基本不破坏牛奶营养成分。1.概念：用强烈的理化方法杀死物体内外的所有的微生物，包括芽孢和孢子。某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成的抗逆性强的休眠体。芽孢萌发可形成细菌体。芽孢孢子细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞，能直接发育成新个体。芽孢和孢子具有高度的耐热性，可抗化学药物和抗辐射。应用场景:将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。二.无菌技术

无菌2③优点：操作简便，效果可靠，在杀灭所有的生物的同时基本保持培养基的营养成分不被破坏。高压蒸汽灭菌锅高压蒸汽灭菌法（效果最好）：100kPa、121℃下维持15-30min。①原理：高温蒸汽破坏蛋白质、核酸等结构使其变性。②对象：常用于培养基、无菌水等的灭菌。使用后的培养基必须灭菌后才能丢弃，以免污染环境。2.灭菌的方法：二.无菌技术

无菌2(1)湿热灭菌：利用沸水、流通蒸汽进行灭菌的方法。注意：①使用前必须先将锅内冷空气排尽，才能达到预设的压力和温度。②灭菌完成时，待锅内压力自然降到０时，再打开气阀。01

使微生物细胞膜破坏、蛋白质变性和原生质干燥等。

(2)干热灭菌：②对象：

①原理：160~170℃的热空气中，2~3h进行灭菌的方法。耐高温，需保持干燥的物品，适用于玻璃器皿

(如试管、培养皿、吸管、注射器)金属器具

(如针头、镊子、剪刀等)的灭菌二.无菌技术

无菌2

（3）灼烧灭菌：酒精灯火焰灼烧①效果：最彻底②原理：③对象：01充分燃烧层（外焰）使微生物燃烧接种工具如接种环、接种针，以及接种过程中的试管口或瓶口等易被污染部位。二.无菌技术

无菌2①避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。②为避免周围微生物污染，实验操作都应在超净工作台并在酒精灯火焰旁进行。类型理化因素作用强度消灭微生物数量芽孢和孢子能否被消灭消毒灭菌

较为温和强烈部分微生物全部微生物一般不能能二.无菌技术

消毒和灭菌比较32.消毒和灭菌工作之后：1.比较消毒和灭菌对微生物作用效果的差异:将接种于培养基内，在合适条件下形成的含有特定种类微生物的群体。制备培养基三.微生物的纯培养培养物由单一个体繁殖所获得的微生物群体。纯培养物获得纯培养物的过程。纯培养配制培养基灭菌倒平板接种和分离培养

微生物的纯培养1一.实验原理分散或稀释繁殖单个细胞微生物群单个菌落①分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落。念珠菌显色培养基大肠杆菌培养基酵母菌培养基金黄色葡萄球菌和枯草杆菌培养基鉴别菌种：菌落的大小、形状、颜色、透明度、光泽度等是鉴定菌种的重要依据。三.微生物的纯培养

酵母菌的纯培养2一个菌落就是一个种群。平板划线法

稀释涂布平板法②采用平板划线法和稀释涂布平板法能将单个微生物分散在固体培养基上，经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物。获得单菌落的方法：酵母菌菌落：湿润，粘稠，易挑起，表面光华，比细菌的菌落大而厚。三.微生物的纯培养

酵母菌的纯培养2一.实验原理去皮切块加水(1000mL)加热煮沸软烂马铃薯纱布过滤加琼脂（15～20g）酵母菌培养基加水定容(1000mL)称取马铃薯(200g)马铃薯块滤液加葡萄糖/蔗糖（20g）

调pH①

②

二、方法步骤：①制备培养基

：配制培养基制备培养基接种与分离培养三.微生物的纯培养

酵母菌的纯培养2转移

灭菌15~30min皮筋勒紧包牛皮纸放入高压蒸汽灭菌锅中（100kPa、121℃）酵母菌培养基锥形瓶加棉塞高压蒸汽灭菌锅1.避免因水蒸气凝结而浸湿棉塞。2.

避免再次污染②

灭菌

培养基——高压蒸汽灭菌注意：先调pH再灭菌三.微生物的纯培养

酵母菌的纯培养2培养皿——干热灭菌灭菌2h几层牛皮纸包紧放入干热灭菌箱（160～170℃）5～8套培养皿干热灭菌箱②

灭菌

三.微生物的纯培养

酵母菌的纯培养2培养基冷却到50℃左右，在酒精灯火焰附近倒平板。1拔出锥形瓶的棉塞。2将瓶口迅速通过火焰。3用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将培养基倒入培养皿（10～20mL），立即盖上皿盖。4等待培养基冷却凝固后，将培养皿倒过来放置。1.防止培养基水分蒸发。2.防止皿盖上冷凝水滴落，造成污染。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。不能完全打开，以免杂菌污染培养基。③

倒平板：

三.微生物的纯培养

酵母菌的纯培养2倒平板

（1）冷却至50℃左右时才能倒平板：

【倒平板的注意事项】①温度：50℃左右②操作：在酒精灯火焰附近③冷凝后平板倒置三.微生物的纯培养

酵母菌的纯培养2（3）怎么确定所倒平板未被杂菌污染或灭菌彻底？将所倒平板放入37℃的恒温箱中培养12h～24h，观察是否有菌落存在以确定是否被污染或灭菌是否彻底。（2）倒平板时不要将培养基溅在皿盖与皿底之间，否则此培养基不能用来培养微生物，因空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。

温度过高会烫手，温度过低培养基又会凝固。——平板划线法

通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经过数次划线后培养，可以分离到单菌落。连续划线法分区划线法④接种和分离酵母菌三.微生物的纯培养

酵母菌的纯培养2分离的方法1将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。2在火焰旁冷却接种环。同时，拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞。将试管口通过火焰。34在火焰附近用接种环蘸取一环菌液。平板划线法的具体操作：防止温度太高杀死菌种。三.微生物的纯培养

酵母菌的纯培养2接种环：灼烧灭菌5将试管口通过火焰，并塞上棉塞。在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖。6

灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意：不要将最后一次的划线与第一次的划线相连。7注意不要划破培养基。a.划破，会造成划线不均匀，难以分离单菌落；b.存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落。使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少。三.微生物的纯培养

酵母菌的纯培养2最后一次划线已稀释成单个细胞，如与第一次相连则增加细菌数目，达不到纯化的效果。第1区划线接种环灭菌第2区划线接种环灭菌第3区划线接种环灭菌接种环灭菌12345①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次.

②划线首尾不能相接③每次划线前接种环进行灭菌。在5个区域划线，接种环灼烧灭菌共6次。④划线后,培养皿倒置培养分区划线法（最常用）平板划线法注意事项:三.微生物的纯培养

酵母菌的纯培养2灼烧时期目的取菌种前每次划线前接种结束后思考：为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端，从而使每次划线时菌种数目逐渐减少，直至得到单个细胞杀死接种环上原有微生物接种环共需灼烧几次？6次三.微生物的纯培养

酵母菌的纯培养2完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板(一般做三组，重复实验)和一个未接种的平板倒置，放入

28℃左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养24~48h。平板划线法可以对菌种进行分离，能否对培养液中菌种进行计数呢？不能计数⑤培养酵母菌1.为什么要将平板倒置？2.为什么要同时放入未接种的平板？既可以防止培养基表面的水分挥发；又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。作空白对照，该培养皿无菌落说明培养基没有污染三.微生物的纯培养

酵母菌的纯培养2（2）接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落颜色、形状和

大小是否一致？如果观察到了不同形态的菌落，分析可能由哪些原因引起？可观察到单菌落。菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点；如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。（3）你是如何记录实验结果的？可在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加等。三、结果分析与评价：（1）在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？在未接种的培养基表面应该没有菌落生