生物化学 第五节 蛋白质性质

第五节

蛋白质性质一．蛋白质分子的大小，形状以及分子量的测定

1、其分子量变化范围为104—106或更高

2、其形状有纤维蛋白（肌球蛋白），球蛋白（β-脂蛋白）以及介于两者之间的椭圆形蛋白质（如清蛋白）

3、高分子特性蛋白质胶体性，变性，免疫学性质蛋白质分子量的测定方法1、蛋白质最小分子量的测定2、超离心法3、分子筛层析法4、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）1、蛋白质最小分子量的测定用化学方法测定蛋白质中某一特定成分的百分含量，根据公式可计算出最小分子量。最小分子量=原子量/组成百分数*100

如细胞色素C含铁量为0.45%，其最低分子量为：55.8/0.45%）*100=12,237CsCl2不常用，因其价格昂贵。所必需的仪器低温超速离心机，耗价不菲！2、超离心法用分析型的超速离心机测定蛋白质的分子量，转速达50,000r/min以上时，溶液中蛋白质分子发生沉淀，计算其沉降系数S，求出其分子量。公式如下：3、分子筛层析法又称凝胶过滤，主要用于测定球蛋白分子量。一般球蛋白洗脱体积取决于分子大小，在一定的分子量范围内，洗脱液的体积Ve是分子量对数的线形函数。即在一定分子量范围内，球形蛋白质洗脱体积Ve取决于分子大小M：

Ve=K1-K2lgM（其中K1，K2为常数，由实验条件确定）

4、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）

SDS指十二烷基硫酸钠

SDS：sodiumdodecyl

sulfate——

polyacrylamid

gelelectrophresis

电泳系统中，蛋白质电泳速度主要取决于它的分子量，而与电荷无关。对照标准蛋白质，可近似得到被测蛋白质的分子量。要获得其精确的分子量，要根据蛋白质的氨基酸的组成（或一级结构）计算。

蛋白质是大分子，又具有复杂的结构，所以蛋白质不稳定，外界因素可引起蛋白质的变性。二．蛋白质的变性吴宪最早提出并阐明蛋白质的变性（denaturationofprotein）概念：某些物理的和化学的因素使蛋白质分子的空间构象发生改变或者破坏，导致其生物活性的丧失和一些理化性质的改变。变性并不涉及共价键（肽键和二硫键等）的破裂，一级结构保持完好，只是蛋白质分子空间构象的改变或破坏。

变性的本质：空间结构的改变或破坏，一级结构不变。（因为肽键稳定而次级键不稳定）。变性的特征：

1、生物学活性丧失。

2、理化性质改变。变性并非是坏事，变形的蛋白质分子结构疏松，容易为蛋白水解酶水解。如食用变性蛋白质更利于消化。变性后，蛋白质溶解度降低所以容易从中沉淀下来。但遇强酸强碱时，蛋白质虽然变性但仍可保持溶解状态。酶，蛋白质性质中的实验内容。变性的意义1、医药生产，应用（灭菌：酒精，高压蒸汽，紫外线）等方面都利用蛋白质变性原理。2、保护：如重金属引起变性，可用鸡蛋清或牛奶保护3、消化吸收4、某些活性蛋白质（药用蛋白）在生产中需避免变性。三．蛋白质的两性电离与等电点

从蛋白质组成氨基酸的结构可见，氨基酸分子有-COOH，-NH2，且组成的氨基酸有酸性氨基酸和碱性氨基酸等，所以蛋白质是两性物质。

1、蛋白质具有两性性质蛋白质的组成单位是具有两性性质的氨基酸，蛋白质分子中除了N末端自由的-NH2和C末端自由的-COOH外，侧链上尚有不少可以解离的基团如-NH2

（碱性氨基酸）-COOH（酸性氨基酸），-OH（Ser）等。所以蛋白质也是两性物质。2、蛋白质的等电点（isoelectricpoint）pI

具有两性性质的蛋白质在溶液中带电情况主要取决于溶液的pH，使蛋白质所带正负电荷相等，净电荷为零时，溶液的pH，称为蛋白质的等电点(pI)。

一般地说，含酸性氨基酸较多的蛋白质为酸性蛋白，其等电点也偏酸，含碱性氨基酸较多的蛋白质为碱性蛋白，等电点偏碱。如与DNA共同构成核蛋白的组蛋白。当溶液的pH>pI时，蛋白质带负电荷，pH<pI时，蛋白质带正电荷。

注意电泳缓冲液的pH，蛋白质带何种电荷就向何方向泳动盘状电泳。

四．蛋白质的胶体性质

蛋白质分子大小约为直径1—100nm，达到胶体质点范围，因此具有胶体溶液的布朗运动，光散射现象，不能透过半透膜以及具有吸附能力，所以蛋白质水溶液是一种胶体，是一种比较稳定的亲水胶体。蛋白质形成亲水胶体有两个基本稳定因素：

1）、蛋白质表面具有水化膜

2）、蛋白质表面具有同性电荷这两个因素被破坏，则蛋白质沉淀。五．蛋白质的沉淀反应

precipitationreaction

由于蛋白质表面水化膜和蛋白质表面同性电荷发生变化，蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为蛋白质的沉淀。蛋白质的沉淀有以下几种方法：

1）中性盐沉淀、2）有机溶剂的沉淀、

3）加热沉淀、4）重金属盐沉淀、

5）等电点沉淀、6）生物碱试剂的沉淀。要强调的是denaturation与precipitation是两个不同的概念，p91中性盐沉淀反应盐溶作用：蛋白质在低盐浓度下溶解度增加的现象。盐析：高盐浓度时，因为破坏蛋白质水化膜并中和电荷，促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀，称为盐析作用。最常用的中性盐为(NH4)2SO4。盐析沉淀出的蛋白质不变性，所以多用于酶，激素等具有生物学活性的蛋白质的分离制备。有机溶剂沉淀

可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，使蛋白质沉淀。 在常温下，有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性，例如酒精消毒灭菌就是如此。但若在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备各种血浆蛋白质。

加热沉淀反应

加热可以使蛋白质变性沉淀，但偏酸或偏碱（需远离pI）加热虽然仍能使蛋白质变性，但不容易产生沉淀。

重金属盐沉淀反应碱性环境

当蛋白质在pH>pI溶液中时，带负电荷，可与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成不溶性的蛋白盐而沉淀。临床上抢救重金属盐中毒的病人时，给予大量蛋白质（生蛋清或牛奶）以生成蛋白盐以减少重金属离子的吸收。在重金属盐类沉淀蛋白质时，实验发现重金属盐不可过多，过多就会使沉淀消失，如过量CuSO4和AgNO3。生物碱试剂的沉淀反应

原理与重金属盐沉淀反应相反，即蛋白质在pH<pI的酸性环境中时，带正电荷，可以与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、三氯醋酸、鞣酸)以及某些酸(如过氯酸、硝酸)的酸根负离子结合成不溶性的盐而沉淀。六．蛋白质颜色反应P91表4-11

茚三酮反应双缩脲反应酚试剂法茚三酮反应

在pH5-7时，蛋白质与茚三酮加热产生蓝紫色，它是对α-NH2的反应，所以蛋白质、多肽、氨基酸以及伯胺类化合物均呈阳性反应。所以Glu（+）双缩脲反应

碱性条件下，蛋白质与Cu2+产生紫红色反应，它针对蛋白质分子中肽键的反应，用于定性与定量，以及测定蛋白质水解程度。比较氨基酸