生药活性成分的高通量筛选技术

生药活性成分的高通量筛选技术高通量筛选(Highthroughputscreening，HTS)技术是20世纪80年代后期发展起来的一种药物筛选新技术。它集计算机控制、自动化操作、高灵敏度检测、数据结果自动采集和处理于一体，实现了药物筛选的快速、微量、灵敏和大规律，日筛选量达到数万甚至数十万样品次，是新药发现技术和方法的一大进步。

传统的药物筛选方法是采用药理学的实验方法，通过体内、体外的多种实验方法，评价药用样品的药理活性。但是，由于传统的药理实验方法需要消耗大量样品，使用大量实验动物，参加实验的技术人员具有较熟练的操作技能，而且筛选样品量有限，劳动强度大，不能适应大量样品的同时筛选。高通量药物筛选是在传统的筛选技术基础上，应用先进的分子生物学、细胞生物学、计算机、自动化控制等高新技术，建立的一套更适合于药物筛选的技术体系。

本文试对高通量筛选技术的基本原理及其在生药活性成分筛选中的应用做一简单论述。

1．基本原理

高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系，它以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理。它的正常开展需要有一个高容量的化合物库、自动化的操作系统、高灵敏度的检测系统、高效率的数据处理系统以及高特异性的药物筛选模型。

1.1化合物样品库

高通量筛选是一种利用已有的化合物进行的体外随机筛选。因此通过高通量药物筛选发现先导化合物(leadingcompounds)的有效性取决于化合物样品库中化合物的数量及其质量。化合物样品的数量是指不同样品的数量。化合物样品的质量主要由化合物结构的多样性决定的。许多活性反应基团(reactivegroups)使初筛的假阳性大量增加，剔除这些化合物可以提高化合物样品库的质量。

化合物样品主要有人工合成和从天然产物中分离纯化两个来源。

人工合成又可分为常规化学合成和组合化学合成两种方法。采用常规化学合成的纯化合物一直是国外制药企业建立化合物样品库的主要来源。它们通过长年积累的化合物建立化合物样品库，通过购买和化合物交流使化合物样品库的数量和质量大幅度提高。

组合化学(combinatorialchemistry)的出现为大量增加化合物的数量提供另外一种来源。组合化学的基本原理是采用适当的化学方法，在特定的分子母核上加入不同的基团，在同样条件下，产生大量的新化合物。这种方法在化合物的结构改造和优化方面已经表现出强大的优势。但是，由于该方法是基于母核结构的改造，因此产生的大量化合物在结构多样性方面尚有极大的不足。解决组合化学产物结构多样性的问题，已经成为化学研究人员的研究课题。

从天然产物中分离出来的化合物，母核结构和活性基团是长期的自然选择形成的，它们通过高通量筛选所表现出来的生物活性在药物发现中具有人工合成化合物所不能比拟的优势。因此，增加样品库中具结构多样性的天然化合物及其衍生物是提高样品库质量的一个重要途径。跨国制药企业为了增加高通量筛选的阳性率，已经或正在寻求助买我国的天然产物单体。

1.2自动操作系统

高通量药物筛选每天要对数千化台物样品进行检测，工作枯燥、步骤单一，人工操作容易疲劳、出错。自动化操作系统采用微孔板作为反应容器，具有固定的分布模式(format)；不同的微孔板通过条形码加以标记。自动化操作系统通过光电阅读器对特定的微孔板上的特定位置进行操作，并将操作结果及相关数据存贮在计算机内，使筛选结果准确，实验过程快速。

自动化操作系统利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。操作软件采用实物图像代表实验用具，简洁明了的图示代表机器的动作。编程过程简洁明了，可操作性强。自动化操作系统的工作能力取决于系统的组成都分，根据需要可配置加样、冲洗、温解、离心等设备以进行相应的工作。

除了实验步骤的需要以外，自动化的加样方式是决定筛选速度的重要因素。目前主要有单孔、8孔、96孔、384孔等几种方式。单孔一般用于对照样品以及复筛中零散样品的转移。96孔、384孔在酶活性检测以及需同时开始、同时终止反应的筛选模型中是必需的。

自动化操作系统的一个重要组成部分是堆栈(hotel)。所谓堆栈是指在操作过程中用来放置样品板、反应板以及对它们进行转移所需的腾挪空间。因此，高通量筛选的样品数量取决于堆栈的容量。

由此可见，高通量药物筛选的自动化操作系统由计算机及其操作软件、自动化加样设备、温孵离心等设备、堆栈4个部分组成。不同的单位可根据主要筛选模型类型、筛选规模选购不同的部分整合成为一个完整的操作系统。

1.3检测系统

快速、高灵敏度的检测技术是高通量药物筛选的关键技术之一。在高通量药物筛选中，检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。检测仪器灵敏度的不断提高，即使对微量样品的检测，也可以得到很好的检测效果。

1.3.1液闪计数放射性同位素广泛用于受体结合测定、细胞毒性、细胞增殖实验、药物代谢示踪以及基因分析中。由于采用了双光电倍增管及时间分辨偶合回路(time-resolvedcoincidencecircuit)技术，有效地降低了背景信号的干扰，使测定灵敏度提高，同位素用量少。在96孔板的分析检测中，背景信号可控制在10cpm左右。

亲和闪烁分析(scintil1ationproximityassay，SPA)是一种新的液闪分析法。该方法在细胞表面受体药物筛选中应用较为普遍。在高通量筛选测定细胞表面受体亲合结合作用时，放射配体标记滤过分析技术由于需要进行分离，现已被亲合闪烁分析所取代。亲合闪烁分析技术通过亲合结合，将放射性配基结合到具有受体的闪烁球上，从而产生光子，减少了放射配体标记分析中的游离配基与结合配基的分离过程，使得放射配基分析可完全以自动化的方式进行，适于进行高通量筛选。产生低能量放射粒子的同位素可被用来进行放射性标记，而这种低能量放射粒子在短距离内可被重吸收，以确保只有结合到受体表面的配基才被检测到。SPA技术被广泛的应用到激酶、核酸处理酶分析以及受体配体的相互作用分析中。

1.3.2分光光度法为了适应高通量药物筛选，许多公司都生产了具备计算机接口并能对多孔板进行同时检测的分光光度计。以MolecularDevice公司的spectra190为例，它采用8条光导纤维同时对8孔进行测定。测定波长以2nm为间隔，可以在190nm一850nm间进行选择。对未知物质，可在该范围内进行扫描以确定其特征吸收光谱。因此，大大增加了建立模型的多样性。检测数据以不同文件格式输出，可用随机软件或通用数据处理软件进行处理。方便、快速、准确、自动化程度高。分光光度法高灵敏仪器同自动化操作系统的连接，使得基于紫外、可见光谱的高通量药物筛选模型成为主要模型种类。

1.3.3化学发光检测化学发光指生色物质在酶促作用下，化学能以光子的形式释放出来。化学发光根据发光的形式和种类分为辉光型和闪光型发光两种。辉光型化学发光如以AMPPD、CDPS、ECL、Diagoxigein等为基础的发光反应。其发光时间较长且稳定。而以发光蛋白、ATP、荧光素酶等为底物的发光反应则是闪光型发光反应，其发光时间较短。由于时间分辨及偶合回路技术的使用，对于背景的去除更为有效，使得化学发光的检测灵敏度达到0.1pg数量级。在单孔Erusalimsky等建立了新型细胞凋亡调节物的高通量筛选方法。细胞预先用3Ｈ胸苷标记，与凋亡诱导物孵育后，连续经过两种玻璃滤器。一个是中性的，捕获完整的染色质和高分子量ＤＮＡ。另一个装有DEAE活性基团，捕获低分子量DNA碎片。通过对滤器上放射性的测量，可以对DNA的破碎情况定量。

1.5.5.3抗肿瘤活性Lu等建立了用高通量“生物活性指纹”筛选抗肺癌药物的方法，考察受试分子(类维生素Ａ及类维生素Ａ相关分子)对许多不同细胞系的效应特点。检测指标包括：(1)肺癌细胞生长抑制检测。选择了约50种肿瘤和非肿瘤细胞，包括了大量不同的组织和(或)肿瘤来源。细胞暴露于受试化合物5ｄ后，用标准比色法测定存活细胞百分率。20%生长抑制率指示有活性。(2)集落形成抑制检测，用以区分细胞生长抑制作用和细胞杀伤作用。6孔板上加NCI-H292非小细胞肺癌细胞，暴露于受试物一定时间。然后对细胞进行清洗，植于无受试物的培养介质共7d。用结晶紫对细胞染色，考察集落形成情况。(3)凋亡检测，用ELISA方法测量细胞DNA破碎。(4)转录调控检测，用以考察受试化合物是否有类维生素Ａ受体介导的转录抑制作用。方法是将HeLaTK-细胞用73Col-CAT报告基因连同受体的表达载体转染，与受试物一起培养，用ELISA方法检测CAT活性。

1.5.5.4G2Roberge等建立了G2期检查点抑制剂的高通量筛选方法。将MCF-7mp53细胞培养，种在96孔聚苯乙烯组织培养板上。照射使细胞进入G2静止期，加入受试化合物用ELISA方法检测核仁蛋白(nucleolin)的磷酸化形式，从而得到从G2期释放进入Ｍ期的细胞数量，即抑制G2检查点程度。

1.5.5.5信号转导通路Su等建立了TGFβ3通路作用物的高通量筛选方法。构建融合报告基因，转染细胞，选择虫荧光素酶表达能被TGFβ高诱导的克隆。将细胞植于96孔板，与受试化合物孵育后，稀释并加入Steady-Glo底物测虫荧光素酶活力，与对照比较，计算相对酶活性增加值。

1.5.5.6细菌蛋白分泌Alksne等建立了以抑制细菌蛋白分泌为作用方式的新型抗生素的高通量筛选方法。该方法基于SecA-lacZ融合报告基因。SecA是一种自我调控翻译的蛋白，当细菌蛋白分泌被干扰时，该报告基因被诱导。

1.5.5.7细菌生长Chung等建立了抑制分枝杆菌生长化合物的高通量筛选方法。选择了一种腐生性分枝杆菌代替结核分枝杆菌，因其具有生长迅速以及非感染性的特点。通过测定细胞摄入放射性标记的尿嘧啶，考察受试化合物对分枝杆菌活力的作用。用96孔板的形式，1d内可以测试数千个样品。

2．生药活性成分的高通量筛选

样品是高通量药物筛选的物质基础，样品库来源的化学多样性是决定高通量筛选技术能否成功的关键因素之一。前面我们谈到，化合物样品主要有常规化学合成、组合化学合成和从天然产物中分离纯化几个来源。而从天然产物中分离出来的化合物，由于其母核结构和活性基团是长期的自然选择形成的，它们通过高通量筛选所表现出来的生物活性在药物发现中具有人工合成化合物所不能比拟的优势。

我国拥有非常丰富的药材资源，几十年来，我们应用药理学手段，对我国的传统药物进行了大规模的研究和筛选，取得了巨大成就。但是，仅仅依靠传统的药理实验方法，既耗时，劳动强度又大，还需要使用大量实验动物，显然不能适应大量样品的同时筛选。虽然经过努力，已从生药中分离、提取、纯化出大量化合物，但由于研究手段的落后，使大量分离出的化合物得不到充分的利用，造成了化合物资源的极大浪费。

因此，将高通量筛选技术应用于生药的活性成分研究，既是对高通量筛选技术的不断完善，又是将这一技术应用于中药现代化研究的有益尝试。

如何对生药的活性成分进行高通量筛选呢？其原理、方法和人工合成化合物的高通量筛选基本一致，区别主要在于筛选前需要从生药中将化合物提取出来并进行适当的分离和化学多样性的评价。相同的就不再赘述，这里主要谈一下提取、分离和多样性评价的问题。

2.1提取由于高通量筛选需要大量的样品来源，所以常规的提取方法显然不能满足这一要求。寻找一个快速、高效、连续、自动化的提取方法显得迫在眉睫。加速溶剂提取技术是近年来发展起来的一个新的提取技术，在准备好样品和对提取方法（或程序）进行设定后，自动进样和自动收集装置就可以连续对最多24个不同样品自动完成样品的提取和提取液的收集，简单方便。应用这一技术，可以得到大量的生药的提取物。

2.2分离及化学多样性评价我们都知道，生药的化学成分相当复杂，通过提取得到的提取物往往是大量单体组成的混合物，所以筛选前需要对生药的提取物进行适当的分离。在众多的分离手段中，制备型HPLC应该是最为理想的，它具有快速、高效、自动化等诸多优点。

分离完成后还需要对分离的物质进行化学多样性的评价，以提高高通量筛选的效率。以前，这种评价多是基于物种的地理分布、生物学分类、化学分类以及基源等关系，近年来，随着科技的进步，多种现代化手段开始应用于化学多样性的评价。其中，色谱-电喷雾质谱联用（HPLC-ESI-MS）技术在这方面做出了有力的尝试。首先，它做出成分的离子信号（m/z）对保留时间的平面图，然后对这些数据进行统计学的相似度评估从而对样品的多样性进行定量的评价。接着，三维的HPLC数据被转换为CDF文件格式并传输到UNIX工作站。数据文件中的每一个离子（包括保留时间、质量、离子强度等数据）被定位在一个二维图谱中，保留时间和质量分占一个轴，离子强度数据储存在位点中。滤除噪声以后，离