高效液相色谱使用常见问题 液相色谱如何操作

高效液相色谱使用常见问题液相色谱如何操

作

1.色谱柱中的流动相见排干吗？不少做色谱分别试验的人碰到

过这样的情形：不慎未适时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸

干了，HPLC系统由此而停止工作了。

1.色谱柱中的流动相见排干吗？

不少做色谱分别试验的人碰到过这样的情形：不慎未适时补充流动

相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。

如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中全部流动相都排

干了？色谱柱还能使用吗？事实上，假如泵将溶剂瓶中的流动相吸

干，并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充分了空气，泵也不会将

空气排入色谱柱。由于泵只能输送液体，而不能输送空气。相比之

下，另一个更可能发生的情况是忘掉盖上色谱柱两端的密封盖或盖

子太松而使色谱柱变干。同样，整个色谱柱干枯的情况不太简单发

生，多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉全部溶

剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了，也不

愿定就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶

剂（如经氮气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张

力有助于浸润填料表面；已脱气的溶剂应当能够溶解并去除滞留在

填料中的气体。色谱柱大约需要（以ImL/min的流速）冲一个小时

或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。

2.使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么

问题？

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假如常常需要更改流路或更换不同品牌的色谱柱，使用PEEK材料制

成的管路和接头会特别便利。PEEK管路简单连接；PEEK接头不仅无

需工具，手拧即可固定，而且简单调整锥箍之外的管路长度，便利

与不同品牌或规格的色谱柱相连接。

使用此类材料的管路需要注意的是：PEEK对卤代烷烧和四氢哄喃的

兼容性不好。虽然未察看到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，但

PEEK碰到上述溶剂会变脆。另一个西药考虑的因素是压力限。不锈

钢管可耐受6000psi的压力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多

数HPLC应用系统压力不会超过3000psi）。

使用PEEK接头时则无需洼念接头耐溶剂性能，由于接头几乎或很少

与溶剂直接接触。但手拧固定的PEEK接头压力限低于不锈钢管，因

而压力太高时，可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。

3.如何防备液相泵的故障:

要保持泵的良好操作性能，必需维护系统的清洁，保证溶剂和试剂的

质量，对流动相进行过滤和脱气.下面列出防备泵故障的几项措施：

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1）、用高质量试剂和HPLC级溶剂;

2）、过滤流动相和溶剂;

3）、脱气;

4）、每天开始使用时放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液;

5）、不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中;

6）、定期更换垫圈;

7）、需要时加润滑油;

8）、查阅有关泵操作手册中的其它建议。

处于良好操作状态的泵，应当能使色谱图上的基线平稳；保留时间

的重复性好。在等度洗脱时压力波动小于2%o梯度洗脱时压力变化

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应是缓慢和平稳的。

为了使故障发生后尽快排出，平常应常备密封、单向阀（入口与出

口）、泵头装置、各式接头、保险丝等部件，以及更换工具。

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色谱柱是液相色谱中紧要的一个构成部分。众所周知，色谱是一种

分别、分析手段，分别是其核心，而色谱柱担负的就是其分别作用,

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可以说，色谱柱就是液相色谱仪的心脏。保护柱则是为了降低分析

柱受污染程度，延长分析柱使用寿命的紧要构成部分。

如何使用保护柱

1、专柱专用，避开保护柱成为不同项目间的交叉污染源。

2、适时更换保护柱。当峰的理论塔板数下降15%,或是柱压上升

15%,或是关键分别度下降15%时，都应当适时更换保护柱。

3、不慎发生强污染时，可以将分析柱卸下，单独冲洗保护柱，可以

使污染物更快的从保护柱中流出。但是不行超声清洗保护柱，以免

损伤柱芯。

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保护柱使用注意事项:

1、独立式保护柱与分析柱连接时，连接管路尽可能短，且接口切面

平滑，尽量削减死体积以降低柱外展宽效应。

2、卡套式保护柱一般未标注液流方向，使用时应自行标注，并依照

标注方从来使用，以免正反向使用后，截留的杂质污染分析柱。

3、直接填装的短柱型保护柱，显现柱压上升或峰型变差时，可不接

分析柱进行反向清洗，清洗溶剂可参考分析柱清洗溶剂。

4、卡套式保护柱，柱芯替换时，注意柱芯与柱套是否存在方向上的

匹配，同时不易旋拧过紧，以防滑丝。

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5、保护柱或柱芯一般不建议超声清洗，因可能对填料表面修饰有影

响。

6、相像一保护柱配不同的分析柱使用，每次使用前，保护柱需先清

洗并用流动相平衡保护柱一段时间后，再接分析柱使用。

使用保护柱的目的在于延长分析柱的使用寿命，但选择合适的保护

柱更加紧要，选择或使用不当也可能带来截然相反的效果

自动进样器的故障简单被发觉，有时液相色谱仪系统出了故障而不

能确定是否是进样器故障，可以用手动进样几次，或用一台好的自

动进样器代替，如排出了故障，说明自动进样器有了问题。不同厂

商的自动进样器差异很大，除一些共性故障外，较好查阅操作手册。

除自动进样器机械、掌控系统可能显现故障外，在操作及方法学方

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面也可能显现相应的问题，这里紧要依据自动进样器的设计特点,

对试验过程中可能显现的问题进行说明。

一、滞后体积

高效液相色谱仪中滞后体积是指流动相混合器到柱头的体积，包括

溶剂混合器和混合器到柱头之间连接管的体积，对于低压混合系统,

也包括泵体积。滞后体积较大可能导致试验的重复性差、方法移植

困难。通常的HPLC系统中，滞后体积一般在0.2矶〜5mL之间，紧

要取决于装置的设计。

滞后体积中较紧要的部分为自动进样器的定量环体积。只有定量环

体积小于100L时，其对滞后体积的影响才可以貌似不计。当定量环

体积较大时，这种影响将表现出来。例如，接受50L的定量环时滞

后体积为300L,假如改用1mL定量环，滞后体积将变成1250L,这

种变化直接影响到色谱分别结果°在实际分别过程中，接受的色谱

柱较细时，必需考虑滞后体积的影响，解决的方法为更换较小的定

量环，减小滞后体积。

二、样品瓶过满

假如样品瓶过满，在瓶盖较紧、进样量较大的情况下，可能会导致

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进样重复性变差。其起因于样品瓶中的样品被抽出时，盖紧的瓶盖

不能使空气适时进入，造成部分真空。由于这种真空作用，注射器

不能够吸取充重量的样品体积。在极端的情况下，对于挥发性稀溶

液样品，针内甚至会显现气泡，影响分析工作的正常进行。

有些自动进样器接受加排空针的方法克服这一问题，但这种方法并

不常用。较简单的解决方法为不要使样品瓶过满。一般装样量在样

品瓶的1/2到3/4之间较为适合。

三、进针深度的调整

样品量充分多时，不必考虑这一问题。但对于痕量分析而言，进针

深度的调整问题将较为突出。理想的情况下可以使进针深入到接近

样品瓶底部，这样可以较大限度地利用样品。当可用的样品体积有

限时，可以接受微量样品瓶以加添给定体积样品的相对深度。假如

进针过深，可能插入样品瓶的底部，甚至导致针尖堵塞°假如进针

深度不足，样品只及针尖部分，针将不能抽取充重量的样品，部分

空气取而代之。

对于进针深度的调整，一般接受机械或电动的方法，目前大部分厂

商可以在液相色谱仪色谱工作站上设置。无论接受哪种方法，试验

之