DB35∕T 1854-2019 蜜蜂以色列急性麻痹病毒病诊断技术

DB35DB35/T1854—2019蜜蜂以色列急性麻痹病毒病诊断技术DiagnostictechniquesforIsraeliacuteparalysisvirusofhoneybees福建省市场监督管理局发布I 1 1 1 1 2 2 5 7 8 91GB/T6682—2008分析实验室RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（ReverseTranscriptionPolymeraTBE：三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸（TrihydroxymethylAminomethane-BoricAcid-以色列急性麻痹病毒病是由IAPV引起的一种常见的蜜蜂病毒病，可侵染各个发育时期的蜜蜂个体IAPV属于小核糖核酸病毒总科（Picornaviridae），病毒基因组是由9的两个开放读码框被一个由184个核苷酸组成的基因间区域分开。靠5′端的开放读码框编码翻译与RNA译用于加工不同衣壳蛋白的、由944个氨基酸组成的结构性多聚蛋白。IAPV有两个内核糖体进入位点，一个位于5′端非翻译区，另一个位于两个开放阅读框之间的基因间区域，在衣壳蛋白的起始翻译合成25.1.2在巢脾上只剩下蜂王、幼虫和一些未成年工蜂以及花粉等残留食物，且在蜂箱内并无5.1.3蜜蜂个体感染早期腹部、胸部逐渐变黑，翅膀颤抖，在蜂箱外的空地上转圈，既不采6.1.1.8冰箱（2℃~8℃和-80℃)。3探针IAPV-P序列为5′-FAM-CGGAACGCCGCATGTGTTACCA-BHQ1-3′。应2℃~8℃保存；若样品24h内不能送达实验室，则应-20℃或更低温度保存。选取不超过200mg～300mg待鉴定幼虫虫体或成蜂蜂体，置于D清洗；4℃,10000r/min离心10min，弃上清液，沉淀室温干燥5min；加20μLDEPC水溶解RNA沉4/3/后加入样品孔中进行电泳。在电泳时设立D使用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果，经核酸扩增电泳后如出现一条大小约270bp的DNA片段，应对其切胶回收后进行测序，也可直接送PCR产物进行测序，参考序列参见附录B，同源性达待检样品经核酸扩增电泳后，在大小约270bpDN5//变性2min；之后95℃变性15s，60℃退火30s，收集荧光阳性对照样品有对数扩增曲线，而且Ct值≤30；阴性对照和空白对照无扩增曲线，而且Ct值＞4067溶液的配制三羟甲基氨基甲烷（Tris）54.0g8 aaggctcagctaggatgacacgcctgtacactgtcgacattagttaagttacaattacacgtcttttgccggtcaactgattatgatttttgtataacgacaaacagtgatgaactgtataactcatcaataacaaaatggattctatcttgatcgaagtctagtagatccccaatatagccctgaaaagcttgagggacgagatagctctataaatactagtggacgaagcgagttccgtattgtgtacgttgggagtattgctttcttgttgtgaatcaccagg