高三生物二轮复习课件基因工程专题

基因工程1、什么是基因工程？2、基因工程一般步骤？3、每一个步骤的操作方法及考点分别是什么？请以20题利用农杆菌转化法将Bapt基因导入紫杉醇细胞为例来说明基因工程的一般步骤和各步骤的注意事项。[2018全国1卷]艾弗里肺炎双球菌转化实验对基因工程启示：

DNA可从一种生物个体转移到另外一种生物[2017全国1卷]DNA为什么能实现不同生物的转移，从结构和功能两个方面进行分析？DNA双螺旋结构(结构上的可能性)；

生物界共用一套遗传密码(功

能上可能性)科学家将非洲爪蟾中能表达抗菌肽的基因转入大肠杆菌，并在大肠杆菌表达相同的抗菌肽，说明了

。生物界共用一套遗传密码①质粒可以作为基因工程的载体；②重组DNA可以进入受体细胞；③不同物种之间可以实现基因交流[2018全国1卷]博耶和科恩将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌表达：重组的DNA转入大肠杆菌中，转录出相同的mRNA,说明了？①获取目的基因的方法有哪些？基因组文库从细胞中提取DNA细胞基因组DNA质粒质粒酶切DNA连接酶连接限制酶酶切导入细菌中基因组文库克隆提取酶切的DNA片段cDNA文库逆转录逆转录酶酶切的cDNA片段限制酶酶切质粒质粒酶切连接导入细菌中cDNA文库克隆提取基因组DNA限制酶酶切mRNA逆转录得cDNA，酶切拼接质粒，导入细菌中保存为文库基因组文库cDNA文库（部分基因文库）一、PCR的原理及应用1、PCR的原理；条件；扩增的过程怎样？P1472021湖北卷16.某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是（

）A.增加模板DNA的量

B.延长热变性的时间C.延长延伸的时间

D.提高复性的温度温度低时，即使引物和模版之间的匹配不完全，氢键也可能足够稳定，导致引物结合到非目标区域，而合适的高温条件下，只有完全互补的区域才能稳定结合。一、PCR的原理及应用1、PCR的原理；条件；扩增的过程怎样？2、关于PCR的考点总结：P147①PCR中引物的选择与设计：如何选择引物？会写引物序列？②PCR过程中的计算；③PCR的应用：在目的基因两端加上特定的限制酶识别序列；利用PCR获得融合基因；定点突变，改造基因。④⑤某科研团队为建立具有红色荧光的转基因小鼠，将红色荧光基因R（左图）插入表达载体（右图）中，构建基因表达载体。已知图中R基因的转录方向为从左到右，几种限制酶的识别序列和切割位点见下表。回答下列问题。(2)已知R基因转录形成的mRNA序列为5’—UGAACGCUA．.....（中间序列）…..GUCGACUCG—3’，请写出R基因进行PCR扩增时所用的2种引物序列

、

。（各写出6个碱基序列即可）P147(3)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如图所示）。第

轮循环产物中开始出现目的基因两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，第4轮循环后，产物中目的基因两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段有

个。20022240226822(n-1)2n-2n137152n-12×2n-22某科研团队为建立具有红色荧光的转基因小鼠，将红色荧光基因R（左图）插入表达载体（右图）中，构建基因表达载体。已知图中R基因的转录方向为从左到右，几种限制酶的识别序列和切割位点见下表。回答下列问题。(2)已知R基因转录形成的mRNA序列为5’—UGAACGCUA．.....（中间序列）…..GUCGACUCG—3’，请写出R基因进行PCR扩增时所用的2种引物序列

、

。（各写出6个碱基序列即可）P147(3)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如图所示）。第

轮循环产物中开始出现目的基因两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，第4轮循环后，产物中目的基因两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段有

个。ABCDEABCDEABCDEACBCDEAD引物丙引物乙引物甲若是选用不同的引物搭配，扩增结果有何不同？ABCABCDEABCDEAC引物丙引物乙引物丙引物乙BCAABCBCA引物丙引物乙若选用引物乙丙，扩增产物为乙丙之间的片段，大小为350bp。若选用引物甲丙呢？扩增产物大小为450bpBCDEADBCDEAC引物乙引物甲引物甲引物乙引物乙引物甲BCEADDC若选用甲乙两种引物呢？若是两种引物为同一方向，则最终无扩增产物。5′3′5′3′待添加的限制酶的识别序列5′5′5′5′5′3′3′5′3′3′5′3′5′3′5′3′5′3′待添加的限制酶的识别序列5′3′3′5′3′3′在目的基因两端加上特定的限制酶识别序列将限制酶酶切序列加在引物的5′端53535353第一轮第二轮20.(10分）CRISPR/Cas9基因编辑技术已被广泛应用于基因治疗等领域。其基本工具sgRNA/Cas9来源于原核细胞，包括具有导向功能的sgRNA和行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，技术原理如图甲所示。回答下列问题：（2）构建表达载体。人工合成的sgRNA基因如图丙，需要通过____________扩增，为了确保酶切后能正确连接到质粒上（相应酶切序列如图丙），需在引物1的5'端加上碱基序列

，引物2的5'端加上碱基序列

P150.10获得融合基因在基因工程时通常在目的基因的下游连上一个标记基因，如绿色荧光蛋白基因，形成融合基因，导入受体细胞，标记基因的作用是用来检验或指示我们的目的基因是否成功导入受体细胞并表达。1、标记基因要和目的基因处在同一套启动子和终止子内部；2、标记基因一般建议连在目的基因的下游；3、目的基因和标记基因的DNA水平和mRNA水平是融合的，翻译的蛋白质是两个独立的蛋白质。（八省联考20）细菌中的蛋白激酶Y感受外界刺激后，利用ATP将特异性底物A蛋白磷酸化，改变A蛋白的活性从而应答外界刺激，调控细菌的生长。研究者将Y基因（编码蛋白激酶Y）与GFP基因（编码绿色荧光蛋白）拼接成Y-GFP融合基因（Y-GFP基因），导入载体，并表达出融合蛋白（Y-GFP蛋白），以分析蛋白激酶Y的功能，实验过程如图所示。回答下列问题。(2)构建Y基因与GFP基因的融合基因时，应将Y基因中编码终止密码子的序列删除，理由是

。(4)利用表达的具有绿色荧光的Y-GFP蛋白还可开展的实验有

（答出1个即可）。

分析A蛋白被磷酸化的水平如何获得Y-GFP的融合基因呢？除了用PCR技术外，根据题意，可以如何判定Y-GFP基因成功导入大肠杆菌并表达了呢？获得融合基因3′5′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′3′5′3′5′再依靠另两种末端引物进行PCR。不同大小的扩增产物用电泳分离3′3′5′5′3′5′3′5′5′5′5′3′5′3′5′3′3′5′5′5′3′3′ABCD注意加入引物的要求，以及最后进行大量扩增的引物的选择。（4）菌株A中，X和Y基因的表达均可以提高发酵中乙醇产量。研究人员将X和Y基因融合在一起，构建了XY融合基因能表达的菌株E（如图），其在发酵中具有更高的乙醇产量。菌株E中无单独的X和Y基因，且其他基因未被破坏。简要写出由菌株A到菌株E的构建思路

。获得融合基因从菌株A获得X、Y基因，使用4种引物分别扩增X、Y基因，其中X基因后端和Y基因前端的引物末端部分序列互补配对，可形成具有重叠链的PCR产物，接着利用融合PCR技术构建融合基因，再将获得的融合基因构建基因表达载体，将基因表达载体导入菌株，进行目的基因检测与鉴定，最终获得菌株E。t-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的t-PA会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA蛋白第84位的氨基酸替换后，能显著降低出血副作用。(1)获得能显著降低出血副作用的t-PA改良蛋白的正确顺序是

(选择正确的编号并进行排序)。①t-PA蛋白功能分析和结构设计

②借助易错PCR技术对t-PA基因进行随机突变③借助定点突变改造t-PA基因序列

④检验t-PA蛋白的结构和功能⑤设计t-PA蛋白氨基酸序列和基因序列

⑥利用工程菌发酵合成t-PA蛋白(2)改造t-PA基因序列可以利用如图1、2所示的基因定点突变技术。图1表示重叠延伸PCR技术，其中第1对引物是指

,两对引物参与的PCR过程不能在同一反应系统中进行，原因是

。不选择产物A进一步延伸的原因是

。

5353ATG535353AG5353T53A第一轮第二轮G535C353AG53如何进行定点突变8.如图表示利用重叠延伸PCR技术改造目的基因的原理。下列相关叙述错误的是(

)A.图示操作结束后可继续选用引物1、4进行PCR4,以获得大量改造后的目的基因B.操作中引物2和引物3序列应含有拟突变位点,且可以互补C.应选用引物1和引物4进行PCR3,以获得大量目的基因序列D.此过程实现的基因序列改变属于基因突变,未发生基因重组答案:C重叠延伸PCR重点在于引物的选择和产物的选择9.定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子,进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法,操作过程如图甲。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存,该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点,结构如图乙。回答下列问题。(1)利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR(PCR1和PCR2),在PCR1中,至少需要

个循环才能获得图甲所示的大引物。在PCR2中,要获得带有突变位点的改良基因,引物应选用大引物两条链中的

(填“①”或“②”)。2②大引物PCRt-PA蛋白能高效降解血栓，是心梗和脑血栓的急救药。然而，为心梗患者注射大剂量的t-PA会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA蛋白第84位的氨基酸替换后，能显著降低出血副作用。(1)获得能显著降低出血副作用的t-PA改良蛋白的正确顺序是

(选择正确的编号并进行排序)。①t-PA蛋白功能分析和结构设计

②借助易错PCR技术对t-PA基因进行随机突变③借助定点突变改造t-PA基因序列

④检验t-PA蛋白的结构和功能⑤设计t-PA蛋白氨基酸序列和基因序列

⑥利用工程菌发酵合成t-PA蛋白(2)改造t-PA基因序列可以利用如图1、2所示的基因定点突变技术。图1表示重叠延伸PCR技术，其中第1对引物是指

,两对引物参与的PCR过程不能在同一反应系统中进行，原因是

。不选择产物A进一步延伸的原因是

。

(3)图2表示CBE单碱基编辑系统，该系统由三个元件构成，其中“dCas9蛋白+胞苷脱氨酶”在sgRNA的引导下，对结合区域第4-8位点的碱基C脱氨反应变成U,最终实现C→T的不可逆编辑。过程②

(发生/未发生)磷酸二酯键的断裂和形成。CBE

单碱基编辑系统将靶位点胞嘧啶脱氨基后，细胞复制

次，子代DNA中靶位点碱基对由C-G彻底替换成A-T,实现单碱基编辑。4.常规PCR只能扩增两引物间的DNA区段,要扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列,可用反向PCR技术。反向PCR技术扩增的原理如图所示。下列叙述正确的是(

)考法3利用反向PCR技术扩增已知DNA序列两侧的未知DNA序列A.酶切阶段,L中不能含有酶切时所选限制酶的识别序列B.环化阶段,可选E.coliDNA连接酶而不能选T4DNA连接酶C.应选择引物2和引物3进行PCR,且二者不能互补配对D.PCR扩增,每轮循环前应加入限制酶将环状DNA切割成线状①获取目的基因的方法有哪些？①需要用到哪些工具酶？选择上有何要求？载体有何要求？二、基因工程的基本工具磷酸二酯键T4DNA连接酶P143pBI121载体多克隆位点是目的基因插入部位，一般具有多种限制酶的酶切位点RNA聚合酶识别位点，启动转录。具有物种和组织细胞特异性可转移至细胞的染色体DNA上抗卡那霉素基因，用于重组质粒的筛选T-DNAT-DNA动子启标R记基因Kan多克隆位点复制原点终子止转录终止信号启动子位于基因上游，是RNA聚合酶识别和结合位点，驱动基因转录。组成型启动子（一直干活）组织特异性启动子（特定组织中干活）诱导性启动子（特定诱导物下干活）终止子位于基因下游，提供转录终止的信号。P1432024河北卷22.新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题：（1）实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为______启动子。Nos为终止子，其作用为_______。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。（2）利用________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测________________，通过________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，该工程菌株产生的BC膜可通过特定图案的光照处理后形成所需黑色图案，这为新型纺织原料的有机制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。回答下列问题：(2)研究者利用T7噬菌体的DNA构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体，这是由于T7噬菌体的DNA可以表达一种RNA聚合酶（T7RNAP），利用该酶作为“开关”可控制载体上有关基因的表达。蓝光调控载体的原理如下图二：①原本T7RNAP两部分分离时不具有活性，在蓝光照射下，蓝光光敏蛋白标签nMag与pMag相识别进而促成T7RNAP的N端与T7RNAP的C端结合，使T7RNAP具有活性；②有活性的T7RNAP会识别特异型启动子PT7，然后与基因表达载体特定位点结合开启有关基因的表达。所构建的基因表达载体的部分序列如图三，该序列含有基因Ⅰ、基因Ⅱ、基因Ⅲ，这些基因的表达均需有关的RNA聚合酶识别并结合相关的启动子后才能开启，该载体中的启动子有两种：一种是通用型启动子PBAD，能被工程菌的RNA聚合酶识别，另一种是特异型启动子PT7，仅能被T7RNAP识别。请根据图示中基因表达的物质进行分析，在构建载体时，为实现蓝光控制染色，启动子①②③依次为_____（填“PBAD”或“PT7”），理由是_____________。(3)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是蓝光照射后_______。关于限制酶的选择1、限制酶的选择要求；P1422、不同题目里限定条件要看清。（绵阳一诊20）某科研团队为建立具有红色荧光的转基因小鼠，将红色荧光基因R（左图）插入表达载体（右图）中，构建基因表达载体。已知图中R基因的转录方向为从左到右，几种限制酶的识别序列和切割位点见下表。回答下列问题。限制酶BamHIMfeIEcoRIHindⅢ识别序列和切割位点G↓GATCCC↓AATTGG↓AATTCA↓AGCTT(1)使用限制酶

切割含R基因的DNA片段，使用限制酶

切割图中的质粒，再用

酶连接成重组质粒。(4

)图3分别表示通过基因定点突变技术获得并酶切后的t-PA

改良基因、质粒pCLY11与一些限制酶的识别序列和酶切位点。要想将t-PA

改良基因与质粒pCLY11高效连接，需用限制酶

切割质粒。解题关键：一定看清题干信息，找到突破点。①获取目的基因的方法有哪些？①需要用到哪些工具酶？选择上有何要求？载体有何要求？①如何将目的基因导入受体细胞？如何检测目的基因是否导入了受体细胞双抗法和蓝白班法

某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，