原理及操作流程

原理及操作流程Westernblot

原理WesternBlot采用得就是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物就是蛋白质。经过PAGE分离得蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离得多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上得蛋白质或多肽作为抗原,与对应得抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记得第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离得特异性目得基因表达得蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平得表达。

在电场得作用下将电泳分离得多肽从凝胶转移至一种固相支持体,然后用这种多肽得特异抗体来检测。Westernblot

原理WesternBlot操作流程蛋白样品得制备(蛋白抽提、定量)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS凝胶制备、上样)转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中得蛋白质。稀盐和缓冲系统得水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、就是提取蛋白质最常用得溶剂。细胞裂解液:50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40,0、05%PMSF,2μg/mLAprotinin,0、5μg/mLLeupeptin,pH8、0有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多得蛋白质可用有机溶剂提取,包括乙醇、丙酮和丁醇等。一、蛋白样品得制备蛋白样品得定量(Bradford法

)原理—考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色得形式,在一定浓度得乙醇和酸性条件下,可配成淡红色得溶液,与蛋白结合后形成蓝色化合物,该化合物在595nm处有最大吸收值,化合物颜色深浅与蛋白得浓度高低成正比。制作标准曲线(插入表格)检测样品蛋白含量:取一管考马斯亮蓝+95

l0、15mol/LNaClNaCl溶液+5

l待测蛋白样品,混匀后静置2min,倒入比色杯中测试。目前世界上最常用得蛋白浓度检测方法就是:BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA

Protein

Assay

Kit)Bradford法蛋白定量试剂盒(Bradford

Protein

Assay

Kit)

。二、蛋白定量BCA蛋白浓度测定试剂盒BCA

法与传统方法相比,更简单、更稳定、更灵敏度。

BCA法测定蛋白浓度兼容性亦很好,其不受大部分样本中其她成分得影响,对于5%以内得SDS、Triton

X-100、Tween

20、Tween

80具有很好得兼容性。BCA法测定蛋白浓度易受螯合剂、高浓度得还原剂影响。在BCA法测定蛋白浓度前,应尽量使EDTA浓度≤m10M;

DTT浓度≤1mM,2-ME≤0、01%。

BCA法在50～1000μg/ml浓度范围内有较好得线性关系,

其最小检出量为25μg/ml。

20-30ug

细胞/组织裂解物

100ng

纯化蛋白根据蛋白表达丰度调整适当得蛋白上样量上样量一致:每孔上样量保持一致上样前用loadingbuffer加热变性样本三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质带有负电荷,因此电泳时可以从负极向正极移动Anode-内槽缓冲液带有负电荷,与凝胶顶部接触外槽中缓冲液带有正电荷,与凝胶底部接触Cathode+带有负电荷得蛋白质从上到下运动(负极到正极),分开电泳进程可以根据前沿指示剂来确定,等其跑到底部上面1cm左右即可停止电泳小分子量蛋白跑得比较快、蛋白根据分子量大小分开标本加入到上样孔中10大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流-滤纸凝胶膜滤纸+四、WesternBlot

转膜

分离得蛋白通过电转膜方式从凝胶中转移到杂交膜上(PVDF或NC膜)PVDF膜:价格较贵,可重复使用,特别适合蛋白印迹,结合能力较强,但价格比较昂贵。NC膜(硝酸纤维素膜):价格比较便宜,应用较广,结合牢固性差一些,韧性也不如PVDF,不能重复使用,但蛋白吸附容量高,亲水性较好。WesternBlot得具体步骤转膜

转膜准备制作“三明治”“黑胶白膜”WesternBlot得具体步骤转膜

WesternBlot得具体步骤转膜

转膜条件:推荐:100V,1——2小时;根据蛋白大小以及胶厚度得不同而不同。WesternBlot得具体步骤转膜后检测:(立春红染色)

为检测转膜就是否成功,可用相关染料对膜进行染色。1x立春红5min染色前染色后五、封闭脱脂奶粉(含5％脱脂奶粉得TBST缓冲液)BSAWesternBlot

膜封闭液(生物试剂公司提供)不能用于磷酸化蛋白！六、一抗、二抗孵育把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中,加入一抗溶液与滤膜温育,室温小时或4℃过夜。倒掉一抗溶液,用PBS漂洗滤膜3次,每次10min。加入配制得二抗,摇床上缓慢摇动,室温一小时或4℃过夜。倒掉二抗溶液,用PBS漂洗滤膜3次,每次10min。七、二抗与底物反应显色ECL化学发光显色

比较常用,结果容易控制,但就是被催化就是灵敏度差一点DAB显色

比较灵敏,就是HRP最敏感得底物WesternBlot

需要得主要试剂主要试剂1、 1、0mol/LTris•HCl(pH6、8)Tris(MW121、14)12、114g蒸馏水100ml溶解后,(用浓盐酸调pH至6、8),室温下保存。2、 1、5mol/LTris•HCl(pH8、8)Tris(MW121、14)18、671g蒸馏水100ml溶解后,(用浓盐酸调pH至8、8),室温下保存。3、 10％SDSSDS10g蒸馏水至100ml如溶解困难,可在50℃水浴下溶解,室温保存。如在长期保存中出现沉淀,水浴溶化后,仍可使用。4、 10％过硫酸胺(AP)过硫酸胺0、1g蒸馏水1ml(现用现配,可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在1、5mlEP管中,一次性多装几管,使用时加入蒸馏水水即可,溶解后,4℃保存,保存时间为1周)5、 四甲基乙二胺原液(TEMED):4℃保存。6、 30%丙稀酰胺:4℃保存。7、5X电泳液缓冲液Tris(MW121、14)15、1g甘氨酸(MW75、07)94gSDS5、00g蒸馏水至1000ml溶解后室温保存,用时稀释5倍,通常取160ml配制成800ml即可。8、10X转膜缓冲液甘氨酸(MW75、07)151、1gTris(MW121、14)30、3g蒸馏水至1000ml溶解后室温保存,用时稀释10倍,并加入甲醇至20%。通常取80ml母液,加560ml蒸馏水,最加160ml甲醇,配制成800ml即可。(先加甲醇易产生沉淀)9、 10XTBS缓冲液Tris(MW121、14)24、2gNaCl80、0g蒸馏水至1000ml(浓盐酸调pH至7、6),溶解后室温保存。10、1XTBST缓冲液10XTBS缓冲液100ml蒸馏水900mlTween-201ml因Tween-20比较粘稠,应缓慢吸取并可把枪头剪掉一块,即可防止产生气泡。溶解后室温保存。11、封闭液/抗体稀释液(5%脱脂牛奶):

1XTBST缓冲液95-100ml脱脂奶粉5g溶解后4℃保存,可于一周内使用。WB需要试剂－膜常用得有PVDF膜,硝酸纤维素膜或者尼龙膜主要目得就是确定靶蛋白得分子量大小;使用预染得Marker还可以实时检测电泳分离情况,并可以转移到膜上。WB需要试剂－蛋白质MarkerWB需要试剂－一抗选择适合检测标本种属得一抗(说明书有验证)选择适用于WB实验方法得一抗(说明书有验证)选择单克隆抗体或者经过亲和纯化得多克隆抗体根据说明书推荐得浓度优化最佳稀释比例

Santacruz,Cellsignaling,Invitrogen,Sigma,Abcam,R&D,Abnova,Chemicon,Calbiochem,Millipore,BD,Cayman,Roche,eBioscience,etal、选择合适得一抗:杂交需要试剂－二抗二抗选择:根据一抗来源种属以及抗体Ig亚型选择合适得二抗。二抗得使用:根据说明书推荐浓度使用TBST稀释二抗。如果说明书没有推荐浓度,可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度(1:1000-1:20000)。孵育条件一般为室温1-2小时。

Santacruz,Cellsignaling,Invitrogen,