程序性细胞死亡与细胞衰老课件

第一节程序性细胞死亡第二节细胞衰老

第一节程序性细胞死亡

细胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）是指个体发育中发生的某类细胞的大量死亡，而这种死亡要求特定的基因表达。一、动物细胞的程序性死亡

二、植物细胞与酵母细胞的程序性死亡

（一）细胞凋亡（二）细胞坏死（三）细胞自噬1.细胞凋亡的概念和特征细胞凋亡是受基因调控的主动的生理性细胞自杀行为。凋亡细胞的特征性表现，包括染色质固缩，DNA裂解为200bp左右的片段，细胞皱缩，然后形成由细胞膜包裹的凋亡小体，最后，这些凋亡小体被其他细胞所吞噬。最重要特征：凋亡过程中细胞质膜始终保持完整，形成凋亡小体，不引发炎症反应。细胞凋亡的过程及特征1、正常细胞；2、染色质固缩、片段化并沿核膜分布，细胞质也发生浓缩；3、凋亡中的细胞，细胞质膜内陷，包围染色质片段和细胞器等，形成芽状突起并逐渐分隔，形成凋亡小体；4、凋亡小体被邻近吞噬细胞吞噬。吞噬细胞凋亡小体12342、细胞凋亡的生理意义细胞凋亡和细胞增殖都是生命的基本现象，是维持体内细胞数量动态平衡的基本措施。1）保证胚胎的正常发育。

如蝌蚪尾的消失，指或趾间细胞的凋亡。2）调节细胞数量。如调节神经细胞的数量使之与靶细胞的数量相当。3）机体免疫。杀伤免疫细胞攻击被感染细胞并引起其死亡。4）在成年阶段清除衰老和病变的细胞。细胞凋亡与人类疾病细胞凋亡受抑制有关的疾病

恶性肿瘤:滤泡性淋巴瘤、乳腺癌等细胞凋亡增多有关的疾病自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、肾炎早老性迟呆、帕金森病、小脑退化病骨髓发育不全性疾病

3.细胞凋亡的检测方法1）细胞凋亡的形态学检测2）DNA电泳检测

3）TUNEL法4）彗星电泳法5）流式细胞仪法

细胞凋亡的形态学检测未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。染色细胞：常用吉姆萨染色、台盼兰染色。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。光学显微镜检测一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：

DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）DAPI与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。荧光显微镜检测DAPI染色法观察细胞凋亡NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess

（488nm

400）DNA片段化分析

细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成180

200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNAladder)。1:DNAladder2:没有用喜树碱（CAM）处理的淋巴癌细胞397株系。3：用喜树碱（CAM）处理的淋巴癌细胞397株系。4：阳性对照。喜树碱诱导细胞凋亡的检测末端脱氧核苷转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法，能对DNA分子断裂口中的3’-OH进行原位标记。借助于荧光标记物，可用荧光显微镜进行观察。TUNEL荧光标记法观察细胞凋亡过程中的DNA片段化4.细胞凋亡的分子机制诱导凋亡的因子：物理因子：射线、温度刺激化学因子：活性氧基团和分子、蛋白质合成抑制剂凋亡因子：蛋白酶Caspase、肿瘤坏死因子凋亡方式：1、Caspase依赖性的细胞凋亡2、不依赖于Caspase的细胞凋亡（1）CaspaseCaspase是天冬氨酸特异性的半光氨酸蛋白水解酶，使靶蛋白活化或失活。它的活性位点包含半胱氨酸残基，切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键，因此又称之为Caspases(取英文CysteineC，asparticacid的词头，Asp，proteases的词尾)。Caspase家族的特点以酶原的形式存在，需要活化，

C端同源区存在半光氨酸激活位点。

Caspase分为两类：起始酶和执行酶

（2）Caspase依赖性的细胞凋亡

外源性细胞凋亡产生有活性的caspase3切割凋亡家族蛋白Bid切割执行者caspase3酶原胞质中游离的caspase8聚集到细胞质膜上，形成死亡诱导信号复合物凋亡诱导复合物（DISC）FASL（FAS的配体）+FAS（死亡受体）+FADD（接头蛋白）剪切的Bid从胞质到线粒体线粒体向胞质释放CtyC内源性细胞凋亡在细胞凋亡的内源途径中，线粒体处于中心地位。线粒体释放凋亡因子（包括细胞色素C，Smac/DIABLO蛋白,凋亡诱导因子AIF，限制性核酸内切酶G等），其中最关键的是释放细胞色素c。细胞色素c+凋亡因子Apaf-1+caspase9酶原→凋亡复合体，活化caspase9活化Caspase3细胞凋亡的外源和内源信号途径

(3)

Caspase非依赖性的细胞凋亡限制性核酸内切酶G凋亡诱导因子（4）细胞凋亡的调控细胞中的Caspase酶原分子像埋藏的定时炸弹，时刻准备被外界信号引发，摧毁细胞。细胞中存在Caspase抑制因子（IPA),能够与Caspase结合，阻抑其对底物的切割作用。IPA家族的抗凋亡作用能被特异的凋亡激活因子如Smac/DIABLO蛋白解除。在细胞凋亡的内源途径中，B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcelllymphoma/leukemia-2Bcl-2）家族通过调控调控线粒体外膜通透性而影响细胞色素C的释放。Bcl-2家族：对细胞凋亡起调控作用。分为两组：抑制细胞凋亡：

Bcl-2,Bcl-xL,Bcl-w。促进细胞凋亡:Bax,Bad，Bid影响APAF1的功能影响线粒体的结构与功能

P53与细胞凋亡P53是肿瘤抑制因子和促凋亡因子。其产物主要存在于细胞核内。在依赖P53蛋白的细胞凋亡中，P53蛋白能特异地抑制Bc1-2的表达，而活化Bax的转录表达。P53基因是人类肿瘤有关基因中突变频率最高的基因。（二）细胞坏死细胞坏死是细胞程序性死亡的另一种形式，具有包括炎症反应在内的重要生理功能。当细胞凋亡不能正常发生而细胞必须死亡时，坏死作为凋亡的“替补”方式被细胞采用。

细胞凋亡与细胞坏死的区别细胞凋亡细胞坏死诱导因子物理、化学及生物因子极端的物理、化学刺激及严重的病理刺激膜完整性完整不完整细胞体积减小增大染色质凝聚（成半月状）不凝集(稀疏成网状）溶酶体完整破裂基因组DNA降解成200bp整数倍片段随机降解凋亡小体形成不形成炎症反应不引发引发（三）细胞自噬通常，寿命较短的蛋白质通过泛素—蛋白酶体系统进行降解，而寿命较长的细胞结构及蛋白质则通过细胞自噬途径，由溶酶体进行降解。细胞自噬的特征是细胞中出现大的双层膜包裹的自噬泡。细胞自噬参与了细胞死亡过程，是与细胞凋亡不同的另一种程序性死亡。细胞自噬主要发生在个体遭遇营养危机的时候以及胚胎发育期间。二、植物细胞与酵母细胞的程序性死亡（一）植物细胞的程序性死亡（二）酵母细胞的程序性死亡（一）植物细胞的程序性死亡在正常的植物发育进程，如导管的分化、通气组织的形成等过程，以及对缺氧、高盐环境等胁迫的反应，和病原体诱发的过敏反应中，均存在细胞程序性死亡。能诱发植物过敏反应的因素主要有活性氧和植物激素等。水杨酸、一氧化氮能协同促进植物过敏反应中的细胞程序性死亡；乙烯、赤霉素能促进细胞程序性死亡；细胞分裂素和脱落酸能抑制细胞程序性死亡。（二）酵母细胞的程序性死亡酵母程序性死亡的机制以及形态学特征与动物细胞凋亡类似；在酵母中发现了Caspase的类似物。生物学意义：清除适应不良个体，控制群体数量。第二节细胞衰老一、细胞衰老的概念及特征细胞衰老的一般含义是复制衰老（RS)。指体外培养的正常细胞经过有限次数的分裂后，停止分裂，细胞形态和生理代谢活动发生显著改变的现象。Hayflick界限：美国生物学家Hayflick指出正常体外培养细胞具有有限分裂次数，称为Hayflick界限。细胞停止分裂是由细胞自身因素决定的，与环境条件无关，而癌细胞能够在体外无限增殖。细胞衰老过程的形态结构变化（一）细胞核变大（二）内质网弥散分布于核周（三）线粒体数量减少，体积变大（四）致密体生成（五）细胞膜由流动相变为凝胶相或固相（六）细胞间隙连接减少二、细胞衰老的分子机制（一）复制衰老的机制端粒的缩短能导致细胞复制衰老。其机制是：肿瘤抑制蛋白P53