生物制药 第二篇 第一章基因工程制药4节基因表达学习资料

上节课内容回顾制备基因工程药物的一般程序？获得目的基因组建重组质粒构件基因工程菌或细胞培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装生物制药所用菌种的获得途径有哪些？诱变育种、基因工程构建、细胞工程、自然界分离从真核中获得目的基因的基本方法有哪些？主要方法有：异转录法、RT-PCR法、化学合成法(编码序列富集法、岛屿获救PCR法、动物杂交法、功能克隆法、构建cDNA文库、差异显示技术的应用，对已发现基因的改造)第四节基因表达

基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。

基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。

最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易分离纯化。（四点）一、宿主细胞的选择（1）适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要求:

（1）容易获得较高浓度的细胞；（2）能利用易得廉价原料；（3）不致病、不产生内毒素；一、宿主细胞的选择（2）（4）发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；（5）容易进行代谢调控；（6）容易进行DNA重组技术操作；（7）产物的产量、产率高，产物容易提取纯化。一、宿主细胞的选择（3）

宿主细胞分为两大类：

第一类为原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；

第二类为真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。⒈原核细胞⑴大肠杆菌

因为大肠杆菌的分子遗传学研究深入，生长迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。

大肠杆菌用于基因表达的特点♦表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。极少数情况下还可分泌到细胞外表达。

♦大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取时需要破碎细胞，故细胞质内其它蛋白质也释放出来，造成提取困难。

♦因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复其生物活性。♦蛋白质产物不能糖基化。只适于表达不经塘基化等翻译后修饰仍具有生物功能的真核蛋白♦产物蛋白质N端多余一个甲硫氨酸残基，容易引起免疫反应。♦其内毒素很难除去。♦产生蛋白酶而破坏目的蛋白质。⑵枯草芽胞杆菌

分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。从而使其应用受到影响。

⑶链霉菌

作为外源性基因表达受到重视。特点：不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物直接分泌到培养基中、表达产物可糖基化。⒉真核细胞

⑴酵母

酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能胞外分泌表达产物，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。如干扰素、乙肝表面抗原基因等。

⑵丝状真菌

优点：分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切、糖基化），糖基化方式与高等真核生物相似。有成熟的发酵和后处理工艺。

⑶哺乳动物细胞

优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。

缺点：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度稀。目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母,已建立了许多适合它们的克隆载体和DNA导入方法。许多外源基因已获得成功表达。大肠杆菌（E.coli）酵母菌的结构二、大肠杆菌中的基因表达大肠杆菌做为外源基因的表达宿主，遗传背景清楚，技术操作简便，培养条件简单，大规模发酵经济，因此倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛、最成功的表达体系，并常常作为高效表达研究的首选体系。原核细胞的基因组特点：①染色质为环状双股DNA分子②具有操纵子结构③结构基因多为单拷贝④特定区域分布特异DNA顺序因此外源DNA分子可以插入原核细胞DNA复制体系的特定区段

1、载体基因工程的目的和基本手段：是选用合适的载体把供体DNA（外源基因）运载到受体细胞内，从而复制扩增大量的目的DNA分子或转录表达为相应的产物。

基因工程载体分为：

克隆载体转录载体

表达载体

克隆载体转录载体

DNADNARNA蛋白质

表达载体

基因工程制药克隆载体的特点：

①具有复制子，能独立地复制

②有单一限制内切酶酶切位点或多克隆位点

③有选择性遗传标记如抗药基因

④拷贝数高⑤生物安全性好目前使用的载体按特性可分为：①质粒②λ噬菌体③黏性质粒④M13噬菌体⑤酵母⑥真核细胞、病毒载体

细菌质粒的生物学特性

质粒（Plasmid）的定义：

质粒是存在于细菌等微生物细胞染色质以外的共价闭环的双股DNA分子，具有独立自主复制和调控能力，可赋予宿主细胞一定的生物性状。质粒的生物学特性①大小小型质粒1.5～15kb,大型质粒60～120kb②复制类型:严紧型质粒,松弛型质粒③拷贝数④电泳特点⑤不相容性

质粒（Plasmid）

是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子,大小约为数千碱基对。常有1~3个抗药性基因，以利于筛选。

质粒的分类:⒈

按复制型式：①严紧型②松弛型⒉

按基因转移性：①传递性质粒②非传递性质粒⒊按遗传性状产物分类：

①抗生素抗性②限制酶修饰酶系统

真核基因在大肠杆菌中复制与表达必须有合适的表达载体把它导入宿主菌中，然后将其表达成蛋白质。基因工程制药所用的表达载体

必须具备的条件（1）（1）载体能够独立地复制。载体本身是一个复制子，具有复制起点。（2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。而且克隆位点应位于启动子序列后，以便克隆的外源基因得以表达。（

3）具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别。表达载体必须具备的条件（2）（4）应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当阻遏时才能进行转录。外源基因的高效表达往往会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可使宿主细胞免除此不良影响。先使宿主细胞较快地增殖积累到相当量，再通过瞬时消除此阻遏使所表达蛋白质在短时间内大量积累，从而减弱表达产物的降解。同时启动子受调节因素调节后，表达质粒的拷贝数将大大提高，外源基因量的增大，对提高外源基因总体表达水平非常有利。表达载体必须具备的条件（3）（5）应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其它无关基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列（Shine–Dalgarnosequence）,以便转录后能顺利翻译。常用表达载体

⑴pBV220系统

质粒pBV220的结构pBV220系统国内使用最多的载体,其组成:①来源于pUC8多克隆位点②核糖体rrnB基因终止信号③pBR322第4225～3735位④pUC18第2066～680位⑤λ噬菌体cIts857抑制子基因及PR启动子⑥pRC23的PL启动子及SD序列共3665bp

pBV220系统优点：

①cIts857抑制子基因与PL启动子同在一个载体上，可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较低的宿主细胞，使表达产物不易降解。

②SD序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始ATG的外源基因，可表达非融合蛋白；

③强的转录终止信号可防止出现“通读”现象，有利于质粒-宿主系统的稳定；④整个质粒仅为3.66kb，有利于增加其拷贝数及容量，可以插入大片段外源基因；⑤PR和PL启动子串联，可以增强启动作用。♥

pBV220系统宿主菌可以是大肠杆菌HB101、JM103、C600，质粒拷贝数较多，因此小量简便快速提取即可满足研究及生产过程中检测和鉴定的需要。♥

pBV220系统为温度诱导，外源基因表达量可达细胞总蛋白的20%～30%；♥产物以包含体形式存在于细胞内，表达产物不易降解，均一性好。

pBG-2是由pBV220系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。

该质粒在PR、PL启动子下游插入proteinG的IgG

Fc结合区基因片段180个碱基对，下游是多克隆位点，引入剪切融合蛋白的切点，具有与IgG结合的活性，可进行亲和层析，简化了下游处理工艺。质粒中有目的基因融合位点及蛋白剪切位点，使目的基因产物纯化后能恢复到天然状态。融合表达质粒pBG-2的结构⒉影响目的基因

在大肠杆菌中表达的因素

外源基因表达产量与细胞浓度和细胞表达产量呈正相关。细胞浓度与生长速率、外源基因拷贝数和表达产物产量之间存在着一个动态平衡，只有保持最佳的动态平衡才能获得最高产量。产量⑴外源基因的拷贝数⑵

外源基因的表达效率⑶表达产物的稳定性⑷细胞代谢负荷⑸工程菌的培养条件取决于：⑴外源基因的拷贝数将外源基因克隆到高拷贝数的表达质粒上，含外源基因的重组表达质粒拷贝数的增加，必然导致外源基因拷贝数的提高。⑵

外源基因的表达效率

①启动子的强弱②核糖体接合位点的有效性

③SD序列和起始密码ATG的间距

④密码子组成

都会不同程度地影响外源基因的表达效率①启动子的强弱需强的启动子。由于真核基因启动子不能被大肠杆菌RNA聚合酶识别，因此在进行真核基因高效表达时，必须将真核基因编码区置于大肠杆菌RNA聚合酶能识别的强启动子控制下，选择具有强启动子的表达裁体。常用的强启动子有lac、trp、tac、λPL、bla等。将目的基因插入表达载体启动子的下游，可以增加基因的表达。②核糖体结合位点的有效性大肠杆菌核糖体结合位点对真核基因在细菌中的高效表达十分重要。所以必须增加核糖体结合点的有效性，消除在核糖体结合位点及其附近的潜在二级结构。③SD序列和起始密码ATG的间距表达非融合蛋白的关键是原核SD序列和真核起始密码ATG之间的距离，距离过长或过短都会影响真核基因的表达。④密码子组成真核系统中“喜欢用”的密码子，在原核细胞中的翻译效率有可能下降。为了提高表达水平，在根据蛋白质结构来设计引物或合成基因时，应选择使用大肠杆菌“偏爱”的密码子。

⑶表达产物的稳定性为提高表达产物在菌体内的稳定性（蛋白酶），可以采用下列四种方法：①组建融合基因，产生融合蛋白。许多融合蛋白与天然的真核蛋白相比较，在细菌体内比较稳定，不易被细菌酶类所降解。②利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的信号肽，把真核基因产物运输到胞浆周质的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解。③采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性。④选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞，有可能减弱表达产物的降解。黄嘌呤核苷(Ion)是大肠杆菌合成蛋白酶的主要底物，

Ion-营养缺陷型大肠杆菌不能合成黄嘌呤核苷，从而不能合成蛋白酶，减少了表达产物在细胞体内的降解。⑷细胞代谢负荷必须进行合理的调节，使宿主细胞的代谢负荷不至过重，又能使外源基因高效表达。分成两个阶段培养，当细胞的生物量积累到一定水平后，再诱导细胞中重组质粒的复制，增加质粒拷贝数。但是，在外源基因大量表达的同时，质粒上其他基因的表达水平也相应增加不利于基因产物的分离纯化。某些蛋白质在真核系统中是可溶性的，但在大肠杆菌中表达后却成为不溶性蛋白质。这很可能是由于外源蛋白质在大肠杆菌中大量表达时，它们的构象发生了改变，或由于存在不合适的二硫键，或由于不能自由折叠，因而不能形成具有生物活性的蛋白质，而形成不溶性的包含体，这种包含体的形成大大降低了表达产物对宿主的毒害作用。⑸工程菌的培养条件外源基因的高效表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因三者之间的相互关系，而且基因工程菌的培养条件有关，必须优化培养条件，提高基因表达水平。⒊真核基因在大肠杆菌中

的表达形式来源于真核细胞的药物基因在大肠杆菌中的表达方式有3种：

⑴

以融合蛋白的形式表达药物基因⑵以非融合蛋白的形式表达药物基因⑶分泌型表达药物基因⑴以融合蛋白的形式表达药物基因

真核基因在大肠杆菌中表达的简便方法是使其表达为融合蛋白的一部分，该融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，这样的蛋白质是以原核多肽和真核蛋白结合在一起的，故称融合蛋白。

优点：基因操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达；

缺点：只能作抗原用。因为融合蛋白中含有一段原核多肽序列，可能会影响真核蛋白的免疫原性，所以一般不能作为人体注射用药。经特殊设计，使融合蛋白经特异蛋白酶(如凝血因子X、胶原酶、肠激肽酶等)或化学处理(如CNBr水解)可以切除融合蛋白氨基端的原核多肽，获得具有生物活性的真核天然蛋白分子。

⑵以非融合蛋白的形式表达药物基因

非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。

优点：保持原有蛋白活性；

缺点：易被蛋白酶破坏，N末端常常带有甲硫氨酸，在人体内用药时可能引起人体免疫反应。

⑶分泌型表达蛋白药物基因外源蛋白的分泌表达是通过将外源基因融合到编码原核蛋白信号肽序列的下游来实现的。利用大肠杆菌的信号肽，构建分泌型表达质粒，常用的信号肽有碱性磷酸酶信号肽(phoA)、膜外周质蛋白信号肽(OmpA)等。将外源基因接在信号肽之后，使之在胞质内有效地转录和翻译，当表达的蛋白质进人细胞内膜与细胞外膜之间的周质后时，被信号肽酶识别而切掉信号肽，从而释放出有生物活性的外源基因表达产物。

优点：一些可被细胞内蛋白酶所降解的蛋白质在周质中稳定，由于有些蛋白质能按一定的方式折叠，所以在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌表达时却具有活性；蛋白质信号肽和编码序列之间能被切割，因而分泌后的蛋白质产物不含起始密码ATG所编码的甲硫氨酸等（不含蛋氨酸残基）。缺点：产量不高，信号肽不被切割或不在特定位置上切割。三、酵母中的基因表达和其他表达系统一样，酵母表达系统也包括载体、启动子等控制序列和宿主细胞3个主要部分。⒈

载体

酵母载体是可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的DNA和RNA单位。⑴载体的复制序列根据来自酵母的复制序列的构成和特性，载体可分为四大类：

①YEp类（yeastepisomalplasmid，酵母附加体质粒）

②YRp类（yeastreplicationplasmid，酵母复制型质粒）

③YCp类（yeastcentromericplasmid，酵母着丝粒质粒）

④YIp类（yeastintegrativeplasmid，酵母整合型质粒）①YEp类（yeastepisomalplasmid，酵母附加体质粒）此类载体的复制序列为酵母2µ质粒成分。2µ质粒是多数酿酒酵母中天然存在的质粒，长6.3kb，可独立复制。将2µ质粒中的复制起点区及YEp3基因区的序列引入载体，就足以维持在大多数酵母株系中的复制能力。但对于某些无内源2µ质粒的酵母菌株，就需要将更长的2µ序列引入载体中，才能使它顺利地复制和扩增。YEp类载体相对比较稳定，在细胞中的拷贝数约为5-50，某些高拷贝的载体可达100-200，转化频率为103一105／µgDNA。以2µ质粒为基础的载体，因具有较高的拷贝数、转化频率和稳定性而被广泛地应用。②YRp类（yeastreplicationplasmid，酵母复制型质粒）此类载体的复制序列是非2µ来源的自主复制序列(autonomousreplicationsequence,ARS)，可来自酵母染色体，也可来自其他生物。这类载体特点：稳定性差，拷贝数也少，一般在5-10，转化频率为103—105／µgDNA

。③YCp类（yeastcentromericplasmid，酵母着丝粒质粒）此类裁体的复制序列也属于ARS，并且含有酵母染色体中心粒成分，有的还引入酵母染色体端粒成分。它们作为一种类似染色体的单位参与细胞有丝分裂和减数分裂，在子代细胞中精确地分配，因此有很好的稳定性。不过它们的拷贝数只有1个，转化频率为103—104／µgDNA。④YIp类（yeastintegrativeplasmid，酵母整合型质粒）此类载体含有可与酵母染色体重组的序列，可以完全整合到染色体中。因此，它依靠酵母染色体进行复制，具有很好的稳定性。拷贝数只有1个，转化频率为1-100／µgDNA

。

⑵克隆载体克隆载体既能在细菌中进行质粒复制和表型选择，又能在酵母中进行质粒复制和表型选择。目前已成功地构建了一系列可供基因工程使用的酵母克隆载体。

⑶表达载体将酵母菌的启动子和终止子等有关控制序列引入载体的适当位点后，就构成了酵母菌的表达载体。酵母菌的表达载体有两类：

①普通表达载体②精确表达载体①普通表达载体此类载体只能方便地引入外源基因并进行表达，对表达产物的组成，特别是对其N末端氨基酸是否增减并无严格要求。②精确表达载体此类载体要求在启动子或前导肽编码序列的适当部位有内切酶位点，以利于接入外源基因，并使它在表达和加工后N末端氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸。α-因子分泌型表达载体

H：HindⅢ位点B:BamHI

位点

T:酵母主要蛋白酶加工位点⒉影响目的基因在酵母菌中

表达的因素⑴外源基因的拷贝数⑵外源基因的表达效率

⑶外源蛋白的糖基化⑷宿主菌株的影响⑴外源基因的拷贝数由于外源基因通常是由多拷贝的质粒载体导人宿主细胞的，所以质粒的拷贝数及其在宿主细胞内的稳定性对外源基因的表达起决定作用。有些质粒在导人宿主细胞后，在传代培养中很快丢失，不能用于工业生产。通过整合质粒，将外源基因整合到宿主染色体上，虽然很稳定，但通常只有一个拷贝，不能高效表达。高度稳定的高拷贝数的质粒可使外源基因高效表达，但高拷贝数的质粒常会引起细胞生长量的降低；而单拷贝的质粒对细胞的最大生长没有影响，因而也能达到较高效的表达。⑵外源基因的表达效率

①启动子必须将外源基因克隆到酵母菌表达载体的启动子和终止子之间，构成“表达框架”。近端启动子含有一个转录所必需的TATA序列和mRNA起始转录位点——起始密码子。终止子区含有终止mRNA转录所需的信号。

在酵母菌中经常利用的启动子有组成型启动子和诱导型启动子(下表)。不同启动子对不同外源基因的表达水平的调节作用明显不同，因此在表达目的基因对应选择合适的启动子。常用的酵母启动子组成型启动子原则上在酵母的生长各个时期都能发挥作用，但是，当外源基因产物对酵母细胞有不利影响时，过早表达该基因常使酵母菌生长不良以致达不到所需的细胞密度，从而影响了总表达产量。通常采用代谢控制方法来部分缓解这类问题，如改换碳源、改变温度等。诱导型启动子的表达受诱导物或诱导条件的特异性影响，可以在较大范围内改变表达效率。寻找高效的诱导型启动于是提高酵母表达效率的重要途径。②分泌信号的效率分泌信号包括信号肽部分以及前导肽部分的编码序列，它帮助后面的表达产物分泌出酵母细胞，并在适当的部位由胞内蛋白酶加工切断表达产物与前导肽之间的肽键，产生正确的表达产物。由子酵母表达的蛋白的加工、转运和分泌途径都与高等真核生物相似，所以，许多哺乳动物的蛋白都能在酵母中正确加工并分泌到胞外。③终止序列的影响终止序列保证了转录产物(mRNA)在适当部位终止和加上polyA尾部，这样形成的mRNA可能比较稳定并被有效地翻译。