实验动物 汉坦病毒检测方法 征求意见稿

GB/T14926—××××实验动物汉坦病毒检测方法本文件规定了汉坦病毒（HV）的抗体和核酸检测方法、试剂等。本文件适用于小鼠、大鼠等实验动物HV的检测。或实验接种物、实验动物环境样本和动物源性生物制品中汉坦病毒的检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本适用于本文件。GB/T14926.50实验动物酶联免疫吸附试验GB/T14926.52实验动物免疫荧光试验GB19489GB19489GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求3原理3.1抗体检测原理根据免疫学原理，采用HV抗原检测小鼠、大鼠血清中的HV抗体。3.2核酸检测原理针对汉坦病毒M片段基因设计特异的引物序列，通过RT-PCR对模板RNA进行扩增，根据RT-PCR检测结果判定该样品中是否含有汉坦病毒，套式PCR引物中的内引物可用于病毒分型。实时荧光定量PCR方法是在常规PCR的基础上，加入了一条特异性的荧光探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'→3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生并被检测仪器接受，随着PCR反应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈对应关系。因此，可以通过检测荧光信号对核酸模板进行检测。4主要试剂和器材4.1试剂：4.1.1ELISA抗原4.1.1.1特异性抗原在生物安全柜内，用Hantaan型或Seoul型毒株感染的E6细胞，当特异性荧光达到+++时，即可收获培养物。经β丙内酯灭活并冻融三次或超声波处理后，低速离心去除细胞碎片，上清液再经超速离心浓缩后制成ELISA抗原。1.14.1.1.2正常抗原E6细胞冻融破碎后，经低速离心去除细胞碎片而获得的上清液。4.1.2抗原片在生物安全柜内，用Hantaan型或Seoul型毒株感染的E6细胞，每2~3天更换维持液，培养7~10d，用IFA法测定细胞内特异性荧光，当荧光达到+++时，将细胞用胰酶分散，用PBS洗涤，涂片，室温干燥的同时，在紫外线下20cm处照射30min，冷丙酮固定10min，-20°C保存。4.1.3阳性血清免疫SPF小鼠或大鼠所获得的抗血清。4.1.4阴性血清SPFSPF小鼠或大鼠血清。4.1.5酶结合物辣根过氧化物酶标记羊或兔抗小鼠、大鼠IgG抗体。用于检测相应动物血清抗体；辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A（SPA）,用于检测小鼠血清抗体。4.1.6荧光标记物异硫氰酸荧光素标记羊或兔抗小鼠、大鼠异硫氰酸荧光素标记羊或兔抗小鼠、大鼠IgG抗体用于检测相应动物血清抗体。4.1.7核酸检测试剂4.1.7.1经DEPC处理的无核酸酶水。4.1.7.2市售病毒RNA提取试剂盒。4.1.7.3市售商品化实时荧光定量RT-PCR基础反应液。4.1.7.4阳性对照：为灭活的含有汉坦病毒的组织样本或细胞培养物。4.1.7.5阴性对照：为不含汉坦病毒的细胞培养物的组织样本。4.1.7.6根据表1和表2的序列合成引物和探针，并配制成10μmol/L储备液，-20℃保存。产物大小/bp②探针也可选用具有与FAM、HEX和BHQ2相同检测效果的其他合适的荧光报告基团和荧光淬灭基团组合。4.2器材4.2.1酶标仪。4.2.14.2.2荧光显微镜。4.2.24.2.3普通显微镜。4.2.34.2.437℃培养箱或水浴箱。4.2.5实时荧光PCR仪。4.2.54.2.6PCR仪。4.2.7电泳仪4.2.8凝胶成像分析系统5检测方法5.1采用ELISA方法（见GB/T14926.50）进行血清学检测。5.2采用IFA方法（见GB/T14926.52）进行血清学检测。5.3采用普通RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR方法（见附录A）进行汉坦病毒核酸检测。6结果判定对阳性检测结果，选用同一种方法或另一种方法复检。如仍为阳性则判为阳性。7结果报告根据判定结果，出具报告。（规范性附录）实验动物汉坦病毒核酸检测方法A.1主要设备和材料A.1.1实时荧光PCR仪A.1.2PCR仪。A.1.4凝胶成像分析系统。A.1.5Nanodrop紫外分光光度计。A.1.6高速冷冻离心机A.1.7台式离心机。A.1.8恒温孵育器。A.1.9漩涡振荡器。A.1.10组织匀浆器或手持式均质器。A.1.11生物安全柜。A.1.12PCR工作台。A.1.13-80℃冰箱，-20℃冰箱，2~8℃冰箱。A.1.14微量移液器（10μL，100μL，1000μLA.1.15无RNase和DNase的离心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL无RNase和DNase的吸头（10μL，200μL，1mL无RNase和DNase的PCR扩增反应管。A.2试剂除特别说明外，以下实验用试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。A.2.10.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO4・H20）27.6g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。A.2.1.2B液0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠NaH2PO4·7H2O53.6g（或Na2HPO4·12H2O71.6g或Na2HPO4·2H2O35.6g），先加适量去离子水溶解，最后定容至1000mL，混匀。A.2.1.30.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）的配制取A液14mL，B液36mL，加氯化钠（NaCl）8.5g，加800mL去离子水溶解稀释，用HCl调pH至7.2，最后定容至1000mL，经121℃高压灭菌15min，冷却备用。A.2.2无DNase/RNase去离子水实验用去离子水按体积比0.1%加入DEPC摇匀，室温静置过夜，121℃高压灭菌15min，冷却备用。A.2.3RNA抽提试剂TRIzol或其他等效产品。A.2.4无水乙醇。A.2.575%乙醇（无DNase/RNase去离子水配制）。A.2.6三氯甲烷（氯仿）。A.2.7异丙醇。A.2.8逆转录试剂A.2.9PCR试剂：rTaq酶、10×PCRBuffer、dNTP。A.2.10DNA分子质量标准。A.2.11TAE电泳缓冲液A.2.11.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）乙二铵四乙酸二钠（EDTA-Na2·H2O）灭菌去离子水5mol/L氢氧化钠溶液灭菌去离子加至100mL，121℃,15min灭菌备用。A.2.11.250×TAE电泳缓冲液配制羟基甲基氨基甲烷(Tris)冰乙酸0.5mol/LEDTA溶液，pH8.0灭菌去离子加至1000mL，121℃,15min灭菌备用。用时用灭菌去离子水稀释至l×使用。A.2.12溴化乙锭：10mg/mL溴化乙锭灭菌去离子水A.2.131.5%琼脂糖凝胶琼脂糖18.61g80mL调pH至8.0242gl00mL200mg20mL1×TAE电泳缓冲液加至l00mL混合后加热至完全融化,待冷至50℃~55℃时，加溴化乙锭(EB)或其他等效核酸染料，轻轻晃动摇匀后将琼脂糖溶液倒入电泳板制成凝胶。A.2.14一步法反转录-荧光定量PCR试剂盒或等效试剂盒。A.2.15引物和探针：根据表1和表2的序列合成引物和探针，引物和探针加无RNase去离子水分别配制成20μmol/L储备液，-20℃保存。A.3采样及样本的处理采样过程中样本不得交叉污染，采样及样本前处理过程中须戴一次性手套A.3.1脏器组织剖检，无菌采集动物肺脏和脾脏，剪取待检样本2.0g于无菌5mL离心管，加入4mL灭菌PBS，使用电动匀浆器充分匀浆1~2min，然后将组织悬液在4℃、3000r/min离心10min，取上清液转入另一无菌5mL离心管中，编号备用。A.3.2细胞培养物方法一：直接刮取样本接种后出现CPE或可疑的细胞培养物于15mL离心管中，3000r/min离心10min，去上清，加1mL灭菌PBS重悬细胞，然后将细胞悬液转移到无菌1.5mL离心管中，编号备用。方法二：将样本接种后出现CPE或可疑的细胞培养物反复冻融3次，细胞混悬液转移于15mL离心管中，12000r/min离心10min，去细胞碎片，上清液转移到无菌15mL离心管中，编号备用。A.3.3实验动物环境A.3.3.1实验动物饲料、垫料和饮水取适量实验动物饲料和垫料置于聚乙烯薄膜袋中，加入适量灭菌PBS(饲料和垫料需全部浸泡于液体中)。密封后浸泡5~10min，充分混匀，将混悬液转移至15mL离心管中，4℃、12000r/min离心10min，取上清液转入另一无菌5mL离心管中，编号备用。取适量实验动物饮水直接转移到无菌5mL离心管中，编号备用。A.3.3.2实验动物设施设备用灭菌棉拭子拭取实验动物设施设备出风口初效滤膜表面沉积物，将拭子置入灭菌15mL离心管，加入适量灭菌PBS，浸泡5~10min，充分混匀，取出棉拭子，将离心管于4℃、12000r/min离心10min，取上清液转入另一无菌5mL离心管中，编号备用。A.3.4样本的存放采集或处理的样本在2~8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存，须放置-80℃冰箱，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。A.4病毒核酸提取选择市售商品化RNA提取试剂盒。按照试剂盒操作说明书提取样品中的RNA。在提取RNA时应设立阳性和阴性对照样品，按同样方法提取RNA。RNA的提取操作应在生物安全柜中进行，避免RNA气溶胶的污染。制备好的RNA应尽快进行下一步PCR反应，若暂时不能进行PCR反应，应于-80℃冰箱保存备用。A.5普通RT-PCRA.5A.5.1第一轮RT-PCRA.5.1.1RT-PCR反应体系第一轮RT-PCR反应体系见表3。反应液的配制在冰浴上操作，每次反应同时设计阳性对照、阴性对照和空白对照，其中阳性对照以含有HV的组织或培养物提取的DNA作为阳性对照模板，其中阴性对照以不含有HVDNA样本（可以是正常动物组织或正常培养物）作为阴性对照模板，空白对照即为不加模板对照（NoTemplateControl，NTC即在反应中用水来代替模板。2229A.5.1.2RT-PCR反应参数RT-PCR反应参数见表4。111注：可使用其他等效的一步法或两步法RT-PCR检测试剂盒进行，反应体系和反应参数可进行相应调整。A.5.2第二轮RT-PCR取第一轮RT-PCR的扩增产物10μL作为模板，分别采用汉滩型和汉城型两对型特异性引物，参照7.4.1第一轮RT-PCR的反应体系和反应参数(省去逆转录步骤)进行第二轮PCR扩增。A.5.3PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测和拍照将适量50×TAE稀释成1×TAE溶液，配制含核酸染料溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶。PCR反应结束后，取10μLPCR产物在1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，以DNA分子质量作为参照。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在3~5V/cm，当上样染料移动到凝胶边缘时关闭电源。电泳完成后在凝胶成像系统拍照记录电泳结果。A.5.4RT-PCR结果判定A.5.4.1质控标准A.5.4.1.1第一轮RT-PCR反应(外引物)中，阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小(464bp)的扩增条带则表明反应体系运行正常。A.5.4.2第一轮RT-PCR反应(外引物)中，阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照也未出现预期大小(464bp)的扩增条带。但是第二轮PCR反应(基因型鉴别引物)中一对引物的阳性对照出现预期大小(383bp或418bp)的扩增条带则表明反应体系运行正常，且阴性对照和空白对照未出现目的条带。A.5.4.3符合上述两种情况之一，即可进行结果判定；否则此次试验无效，需重新进行普通PCR扩增。A.5.4.4结果判定A.5.4.4.1样本经琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪上观察到383bp扩增条带，判为汉滩型汉坦病毒核酸阳性。A.5.4.4.2样本经琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪上观察到418bp扩增条带，判为汉城型汉坦病毒核酸阳性。A.5.4.4.3样本经琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪上均未观察到383bp和418bp扩增条带，判为汉坦病毒核酸阴性。A.6实时荧光定量RT-PCRA.6.1实时荧光定量RT-PCR反应体系实时荧光定量RT-PCR反应体系见表5。反应液的配制在冰上操作，每次反应同时设计阳性对照、阴性对照和空白对照，其中阳性对照以含有HV的组织或细胞培养物提取的DNA作为阳性对照模板，其中阴性对照以不含有HVDNA样本(可以是正常动物组织或正常细胞培养物)作为阴性对照模板，空白对照即为不加模板对照(NoTemplateControl，NTC)，即在反应中用水来代替模板。1111111116注：试剂Rox只在具有Rox荧光校正通道的实时荧光PCR仪上进行扩增时添加，否则用水补齐。PCR反应体系也可以根据不同市售商品化实时荧光定量售商品化实时荧光定量RT-PCR基础反应液的说明书进行配置。A.6.2实时荧光PCR反应参数实时荧光PCR反应参数见表6。否11是注：注：PCR反应参数也