实验动物 布鲁杆菌检测方法 征求意见稿

本文件规定了实验动物布鲁杆菌的检测方法。本文件适用于犬、猪、牛、羊等实验动物布鲁杆菌的检测。或实验接种物、实验动物环境样本和动物源性生物制品中布鲁杆菌的检测。2规范性引用文件下列标准所包含的条文，通过在标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。GB/T14926.42实验动物细菌学检测标本采集GB/T18646动物布鲁杆菌病诊断技术GB19489实验室生物安全通用要求WS269布鲁杆菌病诊断NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范SN/T1088布鲁杆菌病检疫技术规范3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4临床症状与病理变化按照SN/T1088执行。5生物安全措施实验操作及处理按照GB19489的规定，应由具备相关资质的工作人员进行布鲁杆菌病原鉴定和血清学检验，所有培养物和废弃物应经高压灭菌后处置。病原分离培养工作应在生物安全三级实验室中进行。6检测方法6.1通用要求先进行初筛试验，可任选一项或多项进行初筛试验，初筛试验阳性动物需进行确诊试验；可任选一项或多项进行确诊试验。6.2样本采集、保存与运输日常检测样本采集、保存与运输按照NY/T541执行。对于出现布鲁杆菌病症状或死亡的动物，样品采集按照GB/T18646执行。6.3初筛试验-虎红平板凝集试验（RBT）6.3.1样本血清。6.3.2试剂商品化粗糙型和平滑型布鲁杆菌虎红平板凝集试验抗原、粗糙型和平滑型布鲁杆菌标准阳性血清、布鲁杆菌标准阴性血清。6.3.3主要设备离心机、涡旋振荡仪。6.3.4材料移液器、无菌移液器吸头、计时器、牙签或混匀棒、洁净玻璃板。6.3.5操作方法6.3.5.1将待检血清、粗糙型和平滑型布鲁杆菌阴、阳性血清和抗原从冰箱中取出，平衡至室6.3.5.2震荡混匀血清和抗原，分别吸取25μL血清和抗原，加到玻璃板上，猪、牛、羊仅需用平滑型布鲁杆菌虎红凝集抗原进行检测，犬需要同时用粗糙型和平滑型布鲁杆菌虎红凝集抗原进行检测。6.3.5.3用牙签或者混匀棒快速混匀血清和抗原，不断摇动玻璃板，4min内观察结果。6.3.5.4试验需设阴、阳血清对照，分别为布鲁杆菌标准阴性、阳性血清。6.3.6结果判定6.3.6.1标准阴性血清不出现凝集、阳性血清出现凝集时，试验成立，方可对受检血清进行判定。6.3.6.2出现肉眼可见凝集现象者判定为阳性（+无凝集现象且血清虎红混合液呈均匀粉红色者判为阴性（-）。6.4初筛试验-胶体金免疫层析试验（GICA）6.4.1样本血清或血浆。6.4.2试剂商品化粗糙型和平滑型布鲁杆菌病抗体检测卡（胶体金法）、粗糙型和平滑型布鲁杆菌标准阳性血清、布鲁杆菌标准阴性血清。6.4.3材料移液器、无菌移液器吸头、计时器。6.4.4操作方法6.4.4.1取出检测卡，平放于桌面上。6.4.4.2用试剂盒自带的吸管吸取样本，滴入1滴于预装有稀释液的样品管中，颠倒混匀。6.4.4.3吸取稀释后样本，垂直加入3滴于加样孔中。6.4.4.4等待15分钟判读结果，20分钟后的结果视为无效。6.4.4.5需设置标准阴阳血清对照，牛、羊、猪仅用平滑型布鲁杆菌阳性血清作为对照即可，犬需同时设置平滑型和粗糙型布鲁杆菌对照。6.4.5结果判定阳性：检测线（T线）和对照线（C线）都出现线条。阴性：检测线（T线）上没有线条，只在对照线（C线）上出现线条。无效：在观察窗内，对照线区（C）和检测区（T）都不出现线条，或仅检测区（T）出现线条。6.5初筛试验-间接酶联免疫吸附试验（iELISA）6.5.1样本血清或血浆。6.5.2试剂商品化布鲁杆菌病ELISA检测试剂盒、粗糙型和平滑型布鲁杆菌标准阳性血清、布鲁杆菌标准阴性血清。6.5.3设备材料恒温培养箱、离心机、移液器、移液器吸头。6.5.4操作方法6.5.4.1将待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清用样品稀释液作1:50稀释。6.5.4.2将稀释好的待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清分别加入ELISA板相应孔中，每孔100µL，每份待检血清加样1孔，阳性对照血清和阴性对照血清各加2孔。加样结束后，37℃作用30分钟。取出反应板，弃去反应液，每孔加入1×洗涤液300µL，洗涤3次，最后1次甩干或拍干。6.5.4.3将HRP标记IgG用稀释液作1:200稀释后每孔加入100µL，37℃作用30分钟。洗涤3次，最后1次甩干或拍干。6.5.4.4将底物溶液A和B按1:1混合后,立即加入ELISA反应板中,每孔100µL,室温避光显6.5.4.5每孔加入终止液50µL，终止反应。6.5.4.6反应终止后，15分钟内用酶标仪测定OD450nm值。6.5.5结果判定标准阴阳血清对照成立时，按照试剂盒说明书进行结果判定。6.6确诊试验-试管凝集试验（SAT）6.6.1样本血清。6.6.2试剂商品化粗糙型和平滑型布鲁杆菌试管凝集抗原、布鲁杆菌标准阳性血清和布鲁杆菌标准阴性血清、稀释液为含0.5%石碳酸的生理盐水（或）含0.5%石碳酸的10%氯化钠溶液（用于检验羊血清时稀释血清和抗原）6.6.3设备材料恒温培养箱、离心机、移液器、移液器吸头。6.6.4操作方法6.6.4.1血清稀释a)每份血清用4支凝集管；b)标记样本编号后，第1管加入920μL稀释液；c)第2管～4管加入500μL稀释液；d)然后取待检血清80μL，加入第1管中，混合均匀；e)取第1管中的500μL混合液加入第2管并混合均匀，如此倍比稀释至第4管，从第4管中吸取500μL混合液，弃掉。f)稀释完毕，从第1～第4管的血清稀释度分别为1:12.5、1:25、1:50和1:100。6.6.4.2按说明书要求稀释抗原液，上述第1管～第4管中分别加入500μL稀释后抗原液，并混合均匀，此时各管血清稀释倍数为1﹕25、1﹕50、1﹕100、1﹕200。。6.6.4.3大规模检疫时也可只用2个血清稀释度（加抗原后的终稀释度即猪、羊和犬用1:256.6.4.4每次试验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照，即：a)阴性血清对照：阴性血清按说明书稀释到规定容量后，对照试验中稀释和加抗原的方法与待检血清相同；b)阳性血清对照：阳性血清按说明书稀释到规定容量后，对照试验中稀释和加抗原的方法与待检血清相同；c)抗原对照：按说明书要求稀释抗原液500μL，再加500μL稀释液，观察抗原是否有自凝现象。6.6.4.5将加样后的试管置于37℃±1℃培养箱中孵育18h～24h，取出观察并记录结果。6.6.5比浊管制作每次试验需配制比浊管作为判定清亮程度（凝集反应程度）的依据，先将已经稀释好的工作抗原用等量稀释液做对倍稀释，然后按表1配制比浊管。管号对倍稀释后的抗原液稀释液清亮度记录标记1++++2250μL750μL75%+++3500μL500μL50%++4750μL250μL25%+50%-6.6.6结果判定6.6.6.1判定标准a)++++：液体完全透明，管底出现大片的伞状沉淀。b)+++：液体几乎透明，管底出现明显的伞状沉淀。c)++：液体不甚透明，管底出现片状沉淀，振荡时易碎成小絮片状。d)+：液体不透明，管底有松散沉淀。e)－：液体不透明，管底无伞状沉淀，菌体下沉呈圆点状。6.6.6.2试验成立条件当阳性对照血清出现完全凝集阴性对照血清无凝集抗原对照无自凝（－）现象时，试验成立，可对结果进行如下判定：a)血清稀释度1:50，出现“”及以上凝集现象时，判定为阳性；c)可疑动物，间隔3~4周须重新采血，再次检验，如凝集价不断上升，可判为阳性，若重检仍为可疑反应，同时该群实验动物中既无本病流行情况，又无临床病例时，则可判为阴性。6.7确诊试验-竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)6.7.1样本血清或血浆。6.7.2试剂布鲁杆菌病竞争ELISA检测试剂盒、粗糙型和平滑型布鲁杆菌标准阳性血清、布鲁杆菌标准阴性血清。6.7.3设备材料恒温培养箱、离心机、移液器、移液器吸头。6.7.4操作方法6.7.4.1将待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清用样品稀释液作1:10稀释。6.7.4.2将稀释好的待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清分别加入ELISA板相应孔中，每孔50µL，再按50µL/孔加入单抗工作液和酶标记物的混合物，加完后震荡混匀。6.7.4.3盖上封板膜，甩掉板孔中的溶液，每孔加入300µL工作浓度洗涤液，洗涤5次，最后1次甩干或拍干。6.7.4.4每孔加显色液100µL，轻微震荡混匀，盖上封板膜室温25℃±5℃避光显色15分钟。6.7.4.5每孔加入终止液50µL，终止反应。6.7.4.6反应终止后，10分钟内用酶标仪测定OD450nm值。6.7.5结果判定标准阴阳血清对照成立时，按照试剂盒说明书进行结果判定。6.8确诊试验-聚合酶链式反应（BCSP31-PCR）6.8.1样本可采集EDTA抗凝血、生殖道分泌物、流产胎儿、胎盘、精液和体液的一种或多种，用商品化基因组DNA提取试剂盒进行提取。6.8.2试剂耗材多重PCR试剂、无RNA酶水、琼脂糖、Maker、PCR管等。6.8.3主要设备离心机、PCR仪、水浴箱/金属浴、电泳仪、凝胶成像系统。6.8.4操作方法6.8.4.1引物序列参照WS269-2019布鲁杆菌病诊断附录D2.5.1，引物序列见表2。表2PCR引物序列引物名称引物序列B4TGGCTCGGTTGCCAATATCAAB5CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG6.8.4.2反应体系反应体系见表3。表3反应体系反应组分用量/µLdNTPsMixture（各2.5mM）10×PCRBuffer（Mg2+plus）2TaqHS酶（5U/µL）0.5B4引物(l0µmol/L)1B5引物(10µmol/L)1DNA模板2Nuclease-FreeWater总体积206.8.4.3PCR对照同时设立阴性和阳性对照，阴性对照为无RNA酶水，阳性对照为标准菌株DNA。6.8.4.4扩增程序将上述加入DNA模板的PCR管，置于PCR仪内进行反应。反应条件如下：94℃4min预变性；然后进行35个循环的扩增（94℃1min，58℃退火1min，72℃延伸1min最后72℃延伸5min。配置1.5%琼脂糖凝胶，同时加入核酸染料，取PCR产物10µL与适量6×LoddiongBuffer混合，上样，每孔10µL，同时设Maker-100bpDNAladder，110V电泳40min，凝胶成像系统中观察扩增条带。6.8.6结果判定当阴性对照不出现条带、阳性对照出现224bp扩增条带，试验成立，样本扩增出224bp条带，判为布鲁杆菌阳性。6.9确诊试验-实时荧光聚合酶链式反应参照SN/T1088布鲁杆菌病检疫技术规范。6.9.1样本可采集EDTA抗凝血、生殖道分泌物、流产胎儿、胎盘、精液和体液的一种或多种，用商品化基因组DNA提取试剂盒进行提取。6.9.2试剂耗材荧光定量PCR试剂、无RNA酶水、PCR管等。6.9.3主要设备离心机、荧光定量PCR仪、水浴箱/金属浴。6.9.4操作方法6.9.4.1引物探针序列见表4。表4引物探针序列引物探针名称引物序列6.9.4.2反应体系反应体系见表5。表5反应体系反应组分20µL体系2xMix正向引物(l0µmol/L)0.4反向引物(10µmol/L)0.4探针(10µmol/L)0.2cDNA模板2Nuclease-FreeWater76.9.4.3反应条件将上述加入DNA模板的PCR管，置于荧光定量PCR仪内进行反应。反应条件如下：95℃10min预变性；然后进行40个循环的扩增（95℃15s，60℃退火1min）。上述反应条件是以Promega荧光定量PCR试剂为例，实际反应条件需根据试剂说明书进行调整。6.9.5结果判定6.9.5.1结果分析条件设定综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准，具体根据仪器噪音情况进行调整。选择FAM通道进行分析。6.9.5.2质控标准阳性对照样品有对数扩增曲线，而且Ct值＜30。阴性对照