应用微生物技术课件

绪论

-应用微生物学概述

-）应用微生物学的发展简史

前6000年，古巴比伦人酿啤酒；利用酵母等微生物的糖化和发酵机理产生乙醉：

埃及人酿葡萄酒；

仰韶文化遗址出土陶制酒具；

4000多年前的龙山文化时期，酿酒更为普遍；

前4000年，埃及人制作面包；

商代，一定时间储存的粪便来肥田；春秋战国时期混制肥粪；前一世纪《汜胜之书》肥田需

熟粪；

瓜类与小豆间作；后魏（公元6世纪）贾思勰《齐民要术》，种过豆类植物的土地特别肥沃，

提倡轮作，利用根瘤的固氮作用为农业生产服务；西方人18世纪30年代轮作

前6世纪用酿酒微生物治腹泄病；

3世纪“取脑（疯狗）傅之”治狂犬病；

998-1022年宋真宗时代种痘；《医宗金鉴》“种痘之法起于江右，达于京傲；究其源，为宋

真宗时峨眉山有神人出为丞相王达之子种痘而愈，其法遂传于世；用天花病人身上的痘痂，

接种在儿童的鼻孔中预防天花；明代1628年《种痘十全》；1796年英国医生Jenner接种牛

痘解决了天花的预防；1904年传入中国：

1900—1940年，发酵主要产物：酵母菌体，甘油，柠檬酸，乳酸，丙酮丁醇；

进展：丙酮丁醉发酵罐：低碳钢制造，圆柱形，加压蒸汽灭菌，无菌接种；

青霉素：

深层通气培养，通入无菌空气，搅拌使空气均匀分布；

培养基灭菌，无菌接种，温度，pH,通气量，营养物受到严格控制；

改良菌种；

60年代，微生物菌体；扩大生产规模，80-150m3,3000m3；烧；加压喷射发酵罐，加压

循环发酵罐；气升式发酵罐；连续培养；

70年代，基因工程；细胞融合技术；胰岛素，干扰素；计算机控制发酵，新的生物反应器,

传感器；固定化细胞；基因工程，细胞工程，酶工程，发酵工程，生化工程；

三）应用微生物研究的领域

1应用微生物学与环境保护

1）微生物完成重要的生态功能

分解者：如果没有微生物，物质循环中断，动植物尸体和废物堆积如山；

2）微生物的环境净化功能

①环境污染的生物修复

利用微生物及其他生物，将土壤，地下水或海洋中的危险性污染物现场降解成二氧化碳和水

或转化为无害物质；

土著微生物，外来微生物，基因工程菌；

基因工程技术构建的能同时降解芳香烬，多环芳煌，葩煌，脂肪烧的多质料超级菌，能将天

然菌一年多消除的浮油，缩短到几个小时，获得美国专利；

国外采取输送营养物刺激天然菌株降解活性治理地卜冰甲苯污染；

我国采用微生物技术治理石油化工含酚废水，印染废水脱色，有机磷家药厂等工业废水污染

工农业废弃物的资源化及建立清洁生产工艺的环境微生物工程

人畜粪便处理，城市污泥，生活垃圾堆肥，沼气发酵；

如利用有机废物生产甲烷，

应用酵母和光合细菌净化高浓度有机无毒废水生产细胞蛋白，同时生产饲料饵料；

利用废纤维素生产燃料乙醇；

利用木柴废弃物所含半纤维素生产木糖及木糖醇

③微生物技术治理农田污染

分解农作物秸杆，农畜粪便，残留农药，具效率高，速度快，成本低，反应条件温和，无二

次污染等优点：

2应用微生物学与农业

1）微生物肥料的开发利用

菌肥：利用微生物的生命活动来增加土壤中氮磷钾含量，或将不能利用的物质，转化成可被

吸收利用的营养物质，或提供作物的生长刺激物质，或抑制植物病原菌的活动；

固氮：根瘤菌肥，固氮菌肥，固氮蓝藻；

有机磷细菌肥料，钾细菌，磷细菌肥料；

刺激植物生长防治病虫害的PGPR菌肥：

菌根菌肥料；

2）微生物农药

微生物杀虫剂：细菌制剂如苏云金杆菌，放线菌制剂，真菌制剂如白僵菌，霉菌制剂，病毒

制剂；

农用抗生素：链霉素，土霉素，灰黄霉素，放线酮，灭瘟素；

微生物除草剂：如鲁保一号

3）微生物在畜牧业的应用

推广使用微生物饲料,实施健康养殖可提升现有动物产品的商品价值，开发名特优动物产品，

完善动物产品价格结构体系，满足我国发达地区对高品质动物产品需求：

推广使用微生态添加剂，开发新型安全优质的动物产品，降低养猪场的氨硫化氢二氧化硫浓

度，净化养猪场污水：

①微生物饲料：

微生物发酵饲料：人工接种微生物或饲料本身存在的微生物，将青饲料，粗饲料，少量精饲

料，其他废弃物，在一定温度，湿度和通气条件下，通过微生物的作用，将饲料中不易消化

吸收的成分，转化为易消化，并适合家畜口味的营养料，如利用秸杆，壳类，木屑，糠渣，

畜禽粪便等发酵饲料；

光合细菌在20世纪80年代以来用于处理高浓度有机废水；日本使用光合细菌处理制革，罐

头，酒精厂废水，废水处理后菌体蛋白含量6%,是鱼虾鸡猪优质饲料添加剂；

微生物活菌制剂：通过直接饲喂来改善畜禽肠道微生物菌群平衡，而对动物肠道施加有利影

响的活微生物饲料添加剂，促生长，除疾病，除臭气；

③高效微生物酶制剂

如淀粉酶，葡聚糖酶，糖化酶，纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶，脂肪酶；分解农作物秸杆

中木质素，纤维素，即可提高饲料利用率，减少环境污染，又可开发非传统的饲料资源；

4）提高农作物抗性

不少微生物具抗虫抗病耐盐碱耐高低温等抗逆特性；

抗花叶病毒黄瓜，抗病毒马铃薯，抗腐烂西红柿，抗虫玉米甘蓝；

5）微生物激素的开发利用

赤霉素，硫磺胺，VB12,组氨酸，尿嘴唾；

如利用赤霉素涂抹，浸种，拌种，蘸根，喷雾；

对喂食植物性饲料为主的小鸡，加VB12,刺激生长作用；

应用亚剂量的金霉素或其他菌丝残渣喂猪，猪食欲旺盛，体重增长明显，皮毛光泽，并有预

防和治疗疾病的良好效果；

6）微生物食品：酿酒，制醋，制酱；食用菌，冬虫夏草；有益微生物制剂;

3微生物与能源开发

甲烷，氢，乙醇，甲醇；

利用微生物直接发酵甘蔗木薯制造乙醇，目前，美国，巴西，日本，德国将这种乙醉代替汽

油用于汽车燃料进入实用化；

4应用微生物学与生物工程技术

将合成治疗糖尿病的胰岛素基因重组于大肠杆菌，生产胰岛素；

将生产能促进人生长的生长素近制基因重组于大肠杆菌中，生产生长素；

将能治疗癌症及抗击病毒侵染人体细胞的干扰素基因重组于大肠杆菌中，生产干扰素；

美籍印度人柴拉巴将分解芳煌，菇烧，多环芳烧的细菌质料转到能降解脂燃的菌体内获得具

4种质粒，能降解多种煌类的新菌种；能将一般菌在海上处理浮油时间从1年缩短到几个小

时；

第一章应用微生物学基本技术

第二节微生物基本操作技术

一无菌操作技术

-）灭菌方法

1干热灭菌

1）灼烧灭菌法：接种环，接种针或其他金属用具，试管和三角瓶口；

2）干热空气灭菌法：烘箱，干燥箱的热空气170℃杀死微生物；玻璃器皿如吸管平板，金

属用具等，凡不适于用其他方法灭菌而又能耐高温的物品：

2湿热灭菌

1）常压蒸汽灭菌：

常压条件下，在不能密闭的容器内灭菌；

不具备高压蒸汽灭菌情况下，或不宜高压蒸煮的物质如糖液，牛奶，明胶；

温度不超过100C,大多数微生物被杀死，芽抱细菌短时间不能杀死；

常压蒸汽持续灭菌：持续加热6-8h；

间歇灭菌：芽抱io（rc短时间内不会失活而微生物营养体半小时即被杀死，芽抱萌发后耐热

性消失，通过反复培养反复灭菌；操作：先用100℃,30-60min杀死营养体，然后将含芽泡

的培养基室温24h,使其萌发，再灭菌一次；经2次培养3次反复蒸煮，达到完全无菌；

2）高压蒸汽灭菌：

穿透力强，效果最好；

常用于培养基的灭菌；

培养基中某些成分分解氧化，酸度增加，pH下降0.2-0.3；

葡萄糖等营养物质破坏，并形成•引起浑浊和沉淀；葡萄糖溶液分别灭菌，压力尽可能低些；

3过滤除菌

含菌液体或气体通过细菌滤器，使杂菌留在滤器或滤板上；

细菌过滤器是由孔径极小，能阻挡细菌的陶瓷，硅藻土，石棉或玻璃粉制成；

为加快过滤，抽气减压；

用于多汁不宜用湿热灭菌的液体物质，如抗生素，血清，糖；发酵工业中无菌空气的制备

4紫外线杀菌

260nm波长的紫外线；

穿透力弱，只用于表面杀菌和空气灭菌；实验室，接种室，接种箱，手术室，药厂的包装室;

对眼黏膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用；

5化学药剂消毒杀菌

杀菌剂：如重金属离子，某此强氧化剂；

抑菌剂：磺胺类，抗生素制剂；

~）灭菌在微生物工业的应用

1培养基的灭菌

1）温度

高温湿热短时灭菌；

不但灭菌时间短，而且培养基成分破坏小；

但温度高，对设备要求严格；120℃；

2）操作方式

分批灭菌：配制好的培养基置发酵罐中，通入蒸汽，达到预定温度后维持一段时间，再冷却

到发酵所需温度；又称实罐火菌，间歇火菌；

适于小型发酵工厂；不须专门灭菌设备，操作简单易行，投资少，灭菌效果好；

缺点：加热和冷却所需时间长，营养破坏大；发酵罐利用率低，不适合大规模生产过程的火

菌；

连续灭菌：在发酵罐外连续不断地加温，保温，再冷却，把灭菌培养基加入己灭菌发酵罐的

灭菌方式；如培养基输入加热塔，灭菌温度132C,塔内停留20—30秒；维持罐5—7min：

优点：高温短时灭菌，对营养破坏小；加热快，冷却快，灭菌时间短，设备利用率高；

缺点：设备投资大，当培养基含固体颗料或易产生较多泡沫时，易造成局部灭菌不充分与管

道堵塞；

pH：6-8时，微生物最耐热；小于6时，氢离子易渗入细胞内，促使其死亡；pH越低，灭

菌时间越短；

培养基中污染菌的数量，菌龄，耐热性：杂菌数量多，灭菌时间长；营养体，酵母，霉菌的

菌丝体对热敏感，抱子和芽泡耐热性强；

泡沫：泡沫的空气形成隔热层，空气导热差，包裹在泡沫中的微生物不易被杀死；因此灭菌

操作注意泡沫的产生，防止压力骤降而起泡；

pH：6-8时，微生物最耐热；小于6时，氢离子易渗入细胞内，促使其死亡；pH越低，灭

菌时间越短；

培养基中污染菌的数量，菌龄，耐热性：杂菌数量多，灭菌时间长；营养体，酵母，霉菌的

菌丝体对热敏感，抱子和芽泡耐热性强；

泡沫：泡沫的空气形成隔热层，空气导热差，包裹在泡沫中的微生物不易被杀死；因此灭菌

操作注意泡沫的产生，防止压力骤降而起泡；

2发酵设备及管道和附属设备的灭菌

发酵罐：空罐灭菌；实罐灭菌；

管道：蒸汽灭菌；

过滤器：蒸汽灭菌；蒸汽压力0.2Mpa左右，不可过大，45-60min,然后通入压缩空气吹干;

3空气除菌

过滤除菌：让含菌空气通过过滤介质时，利用介质阻截空气中的微生物，取得无菌空气；

过滤介质：棉花，活性炭，玻璃介质，有机合成纤维，烧结材料

空气除菌设备流程；

粗过滤器，压缩机，贮罐，冷却器，旋风分离器，冷却器，丝网过滤器，加热器，过滤器；

1）采气：含菌少的空气：采气口距地面20-30m；郊区；

2）粗过滤器：捕集较大的灰尘颗粒；

3）空压机：能耗大；

4）储气罐：高温除菌；

5）冷却器：空气经压缩机后可达120℃高温，若不冷却会烧焦过滤介质；立式列管式热交

换器，沉浸式热交换器，喷淋式热交换器；

6）油水分离器：空气经压缩机后会带上一些润滑油；空气冷却后，水汽凝结成水滴；

7）加热器：空气湿度仍较大；通过加热，降低空气湿度；

8）总过滤器，分过滤器

三）微生物的接种技术

斜面接种，液体接种，固体接种；

接种环，接种针，玻璃刮铲，移液管，移液枪；

小规模：无菌接种箱，超净工作台；

大规模：无菌室；

工业：

管道压力差接种法，

即利用压力泵，

把种子液从种子罐

抽入发酵罐；

1无菌室的灭菌

1）熏蒸：

先将室内打扫干净，通风干燥后，重新关闭，熏蒸灭菌：福尔马林（37-40%甲醛水溶液），

取6-10ml/m3,盛于铁制容器中，利用电炉或酒精灯直接加热，或加高毓酸钾，通过氧化作

用加热，使福尔马林蒸发；熏蒸后密闭12h以上；使用无菌室前l-2h,取与甲醛溶液等量

的氨水，倒入搪瓷盘内挥发中和，以减轻刺激作用；或用乳酸，硫磺熏蒸灭菌；

2）紫外线灭菌：接种前后，打开紫外灯0.5h；

3）石炭酸喷雾：每次操作前，取5%石炭酸喷于接种室台面和地面；

2接种方法

1）试管接种

2）液体接种

斜面菌种接种液体培养基：

液体培养物接种液体培养基：

液体菌种接种固体平板：

3）固体接种

菌液接种固体料•：

固体种子接种固体料：

抢温接种：在固体料灭菌后不要使料温降得过低才接种，而在料温高于培养温度5-10C接

种；可使培养基在接种后得到适宜的温度条件，能迅速生长繁殖，长势好，杂菌不易滋生；

适于芽抱菌和产生抱子的菌接种；

堆积起温：大量的固体曲料接种后，不要立即分装曲盘或上帘，先堆积起来，上加覆盖物，

防止散热，使培养菌适应新环境条件，逐渐生长旺盛，产生较大热量使料温升高，再分装•

定容器中培养；这样可避免一开始培养菌繁殖慢，料温上不去，拖延培养时间，水分蒸发大,

杂菌易发展等缺点；

二培养基及其制备

一）培养基的成分及来源

1碳源：

糖：多数微生物利用糖作碳源；

单糖优于双糖多糖，已糖优于戊糖，葡萄糖果糖优于甘露糖，半乳糖；纯多糖优于杂多糖：

葡萄糖是最易利用的碳源，速效碳源：但高浓度葡萄糖加速菌体代谢，溶解氧不能满足需要,

中间代谢物如乳酸丙酮酸不能完全氧化积累在菌体或培养基中，pH下降，微生物受到抑制;

淀粉为长效碳源，利用较慢，高浓度不会对微生物产生不利影响；

油脂：豆油，菜籽油；某些霉菌和放线菌可利用油脂作碳源；

有机酸：单细胞蛋白，氨基酸，维生素和某些抗生素的生产可利用乙酸盐，柠檬酸盐作碳源;

醇，烧：一些甲烷氧化菌只利用甲烷和甲醇作碳源；

2氮源

有机氮：黄豆饼粉，花生饼粉，棉籽饼粉，玉米浆，蛋白豚，酵母粉，鱼粉；

含丰富蛋白质，氨基酸，含少量糖类，脂肪，生长因子；微生物在有机氮源培养基中生长旺

盛；

无机氮：氨水，硫酸锈，氯化镀，硝酸盐；

速效氮源；

引起pH变化；铁盐利用后，pH下降，称生理酸性盐；硝酸盐利用后pH上升，称生理碱性

盐；氨水作补充氮源，调节pH；

玉米浆：是制玉米淀粉的副产物；

将玉米粒先用亚硫酸浸泡，浸泡液浓缩即制成黄褐色的液体，叫玉米浆

3无机盐和微量元素

磷酸盐，硫酸盐，氯化钠，氯化钾，微量元素如镁铁钻锌钵：

低浓度时对微生物有促进作用，高浓度则表现出明显的抑制作用；

功能：构成菌体原生质的成分（磷硫等）；作为酶的组分或某些醐的辅酶或酶的激活剂，如

镁铁镒锌钻；调节细胞的渗透压和影响细胞膜的通透性，如氯化钠，氯化钾；参与产物的生

物合成；

需求量很低；天然培养基的碳氮源本身含•定量的微量元素，配制时一般不需单独加入；

4生长因子

维生素，氨基酸，噂吟，喀碇的衍生物及脂肪酸；

维生素是辅醐的组成成分；喋吟喀咤及其衍生物主要功能是构成核酸和辅能；

5水

构成菌体细胞，营养物质传递的介质；

深井水，自来水，地表水，蒸储水；

6产物形成的前体，促进剂，抑制剂

1）前体

加入培养基后，能直接被微生物在生物合成中结合到产物中去，提高产量的物质：

如苯乙酸是合成青霉素G的前体，丙酸是合成久霉素的前体；

有些前体高浓度时对菌体有毒害作用；少量多次；

2）促进剂

机制：

促进生长，提高菌体抗自溶能力，缩短发酵周期，增加产物积累；如巴比妥增加链霉素产生

菌的抗自溶能力；

降低产生菌的呼吸来加快产物的合成，提高产量；

改变培养基的物理条件，达到改善通气效果，增加细胞渗透性的目的，从而提高产物合成；

与产物形成不溶性复盐，在发酵液中沉淀，降低产物浓度，解除反馈抑制作用；

3）抑制剂

抑制某些不需要的产物形成；

酵母厌氧发酵时加亚硫酸盐或碱，使酒精发酵变为甘油发酵；

四环素发酵中，加澳化物抑制金霉素的形成；

常压蒸汽灭菌时，为杀死芽泡，可用的方法有

和;

高压蒸汽灭菌后，培养基的pH一般会；

葡萄糖高压灭菌后会受到破坏，解决办法有一;

微生物工业上，培养基灭菌一般采用—温—时；

培养基中含有机物浓度高时，灭菌时间应_」

微生物工业上，空气除菌流程包括

固体料要抢温接种，堆积起温，原因是什么；

葡萄糖是速效碳源，使用时应注意什么；

举例：生理酸性盐，生理碱性盐；

绘制通风搅拌式发酵罐结构模式图；

二）培养基的类型

1）选择性培养基

根据某种微生物的特殊营养需求或其对某化学物理因素的抗性而设计的培养基，使混合菌样

中的劣势菌变优势菌；

如分离能分解纤维素或石蜡油的微生物，以纤维素或石蜡油为唯一碳源的选择培养基；

分离产胞外蛋白酚的微生物，以蛋白质做唯•氮源的选择培养基；

分离酵母菌，霉菌，培养基中加青霉素，四环素，链霉素，抑制细菌放线菌；

分离革兰氏阴性细菌，加染料亮绿或结晶紫，抑制革兰氏阳性细菌；

2）鉴别培养基

添加能与某菌的无色代谢物发生显色反应的指示剂；如伊红美蓝乳糖培养基；

2按培养基用途划分

1）胞子培养基

使微生物形成大量的抱子；

营养不能太丰富，特别是有机氮源要低些；

秋皮培养基，大（小）米培养基，葡萄糖（淀粉）无机盐蛋白豚培养基

2）种子培养基

供抱子萌发生长的培养基；

营养成分丰富完全；包括有机无机氮源，有机氮源有利于刺激抱子萌发，无机氮源易利用，

利于菌体快速生长；

3）发酵培养基

供菌体生长繁殖合成产物的培养基；

速效与迟效营养搭配，速效少用，迟效多用，流加或补料；因为菌体在半饥饿状态下更有利

于产物合成；

三）培养基配制基本原则

1适宜营养成分

根据微生物类型选择：

牛肉膏蛋白豚培养基（普通肉汤培养基）培养细菌；

高氏一号合成培养基培养放线菌；

麦芽汁培养基部养酵母菌；

查氏合成培养基培养霉菌；

经济：

生产单细胞蛋白时，常利用糖蜜（制糖工业中含蔗糖的废液），乳清（乳制品工业中含乳糖

的废液），豆制品工业废液及黑废液（造纸工业的亚硫酸纸浆）；

甲烷发酵利用废水废渣，人畜粪便及禾草；农副产品或制品，如数皮，米糠，玉米浆，酵母

浸膏，酒糟，豆饼，花生饼，蛋白豚；

2浓度及配比合适

浓度过低时不能满足生长，浓度过高抑制生长，如高浓度糖类物质，无机盐，重金属离子抑

菌或杀菌；C/N；

3物理化学条件适宜

细菌适宜pH7-8；

放线菌适宜pH7.5-8.5；

酵母适宜PH3.8-6；

霉菌适宜pH4-5.8；

加缓冲剂：磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，在PH6.4-7.2范围内起调节作用；

乳酸菌产酸，加碳酸钙调节；

4其他

灭菌的影响：长时间高温引起磷酸盐，碳酸盐与某些阳离子（钙镁铁）结合形成难溶性复盐:

含钙镁铁的成分与磷酸盐碳酸盐分开灭菌，再混合：

四）培养基的制备

1原料的预处理

用来培养食用真菌的秸杆，粪土，棉籽壳，先建堆发酵；

生产酒精，丙酮时，淀粉先蒸煮，糖化：

酒精发酵时，糖蜜先稀释，酸化，灭菌，澄清，加营养盐；

柠檬酸生产中，使用糖蜜做原料时，加黄血盐去除铁离子；

2配制流程

1）称量，溶解：

2）调pH：固体培养基pH调整在加琼脂前进行；

3）过滤澄清：纱布过滤，棉花过滤；

4）分装，加棉塞：斜面装1/4,平板15-18mL三角瓶172-2/3,装棉塞，牛皮纸包扎；

5）灭菌，倒皿，摆斜面：

三微生物分离培养技术

•）固体培养基分离纯化

1稀释平板分离

2划线法分离

3稀释摇管法：分离厌氧菌；

二）液体培养基分离纯化

并不是所有微生物都能在固体培养基上生长，许多原生动物和藻类，细菌，需用液体培养基

分离；

稀释法，每一试管中分配不到一个微生物；

三）单细胞分离

较大的藻类，原生动物较容易，较小的细菌较难；

解剖显微镜，显微操作仪；

四）选择培养分离

1选择培养基

从土壤中筛选蛋白酶产生菌时，培养基中加牛奶或酪素制备培养基，微生物产蛋白酶水解牛

奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白质水解圈；

分离高温菌，在高温条件下培养；

分离抗生素抗性菌株，在加有抗生素的平板卜一分离；

2富集培养

制定特定环境条件，第三节微生物发酵过程以及控制

一常见微生物发酵类型及设备

-）微生物发酵类型

1按终产品分

1）微生物菌体发酵

酵母发酵；

微生物菌体蛋白发酵；

药用真菌发酵，可通过发酵培养手段生产出与天然产品具相同疗效的产物；

微生物杀虫剂，如苏云金杆菌，蜡样芽抱杆菌，白僵菌，绿僵菌；

使仅适应于该条件的微生物旺盛生长；

五）二元培养

保存病毒；银耳与香灰菌丝

2）微生物能发酵

微生物生产的淀粉酶和糖化酶用于生产葡萄糖；

胆固醇氧化的用于检查血清中胆固醉的含量；

葡萄糖氧化酶用于检查血中葡萄糖的含量；

3）微生物代谢产物发酵

初级代谢产物：氨基酸，核甘酸，蛋白质，核酸，糖类；

次级代谢产物：抗生素，生物碱，细菌毒素，植物生长因子；

4）微生物转化发酵

利用菌体将乙醇转化成乙酸的醋酸发酵；

将异丙醇转化成丙醇，甘油转化成二羟基丙酮，密类转化，抗生素的生物转化；

5）生物工程细胞的发酵

基因工程菌生产胰岛素，干扰素，青霉素酰化酶，用杂交瘤细胞生产用于治疗和诊断的各种

单克隆抗体；

2按物料和产物的进出方式分

1）分批发酵

发酵过程中所有物料（除空气，消泡剂，酸碱）一次加入发酵罐，灭菌，接种，培养，产物

回收；

柠檬酸，氨基酸，抗生素，维生素

2）连续发酵

发酵过程中，以一定的速度向罐内连续加入新鲜培养基，以相同速度排出含有产品的培养液;

发酵周期长，菌种易变异；

3）补料分批发酵

流加；微生物分批培养过程中向反应器中间歇或连续补加•种或一种以上特定的限制性底

物，反应后一次排出培养液；

使基质浓度保持在较低水平，解除或减小了底物与产物的抑制与阻遏作用；不会产生菌种变

异，物料污染问题，终产物浓度高；

单细胞蛋白，氨基酸，生长激素，抗生素，维生素，酶制剂，有机酸，有机溶剂，核甘酸；

-）发酵设备

1固态发酵设备

蘑菇栽培的发酵架，发酵室；酿酒用的发酵缸；制曲的曲盘；通风制曲设备；

发酵工艺控制难

2液态发酵设备

1）厌氧发酵设备

啤酒，酒精发酵；不通氧，不搅拌；

第一章应用微生物学基本技术

第二节微生物基本操作技术

一无菌操作技术

一）灭菌方法

I干热灭菌

1）灼烧灭菌法：接种环，接种针或其他金属用具，试管和三角瓶口；

2）干热空气灭菌法：烘箱，干燥箱的热空气170℃杀死微生物；玻璃器皿如吸管平板，金

属用具等，凡不适于用其他方法灭菌而又能耐高温的物品；

2湿热灭菌

1）常压蒸汽灭菌：

常压条件下，在不能密闭的容器内灭菌；

不具备高压蒸汽灭菌情况下，或不宜高压蒸煮的物质如糖液，牛奶，明胶：

温度不超过100℃,大多数微生物被杀死，芽抱细菌短时间不能杀死

常压蒸汽持续灭菌：持续加热6-8h；

间歇灭菌：芽泡100℃短时间内不会失活而微生物营养体半小时即被杀死，芽抱萌发后耐热

性消失，通过反复培养反复灭菌；操作：先用100℃,30-60min杀死营养体，然后将含芽抱

的培养基室温24h,使其萌发，再灭菌•次；经2次培养3次反复蒸煮，达到完全无菌；

2）高压蒸汽灭菌：

穿透力强，效果最好；

常用于培养基的灭菌；

培养基中某些成分分解氧化，酸度增加，pH下降0.2-0.3；

葡萄糖等营养物质破坏，并形成一引起浑浊和沉淀；葡萄糖溶液分别灭菌，压力尽可能低些

3过滤除菌

含菌液体或气体通过细菌滤器，使杂菌留在滤器或滤板上；

细菌过滤器是由孔径极小，能阻挡细菌的陶瓷，硅藻土，石棉或玻璃粉制成；

为加快过滤，抽气减压；

用于多汁不宜用湿热灭菌的液体物质，如抗生素，血清，糖；发酵工业中无菌空气的制备；

4紫外线杀菌

260nm波长的紫外线；

穿透力弱，只用于表面杀菌和空气灭菌；实验室，接种室，接种箱，手术室，药厂的包装室;

对眼黏膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用；

5化学药剂消毒杀菌

杀菌剂：如重金属离子，某此强氧化剂；

抑菌剂：磺胺类，抗生素制剂；

表1-1；

二）灭菌在微生物工业的应用

1培养基的灭菌

1）温度

高温湿热短时灭菌；

不但灭菌时间短，而且培养基成分破坏小；

但温度高，对设备要求严格：120℃：

2）操作方式

分批灭菌：配制好的培养基置发酵罐中，通入蒸汽，达到预定温度后维持一段时间，再冷却

到发酵所需温度：又称实罐灭菌，间歇灭菌；

适于小型发酵工厂；不须专门灭菌设备，操作简单易行，投资少，灭菌效果好；

缺点：加热和冷却所需时间长，营养破坏大；发酵罐利用率低，不适合大规模生产过程的灭

菌；

连续灭菌：在发酵罐外连续不断地加温，保温，再冷却，把灭菌培养基加入已灭菌发酵罐的

灭菌方式；

如培养基输入加热塔，灭菌温度132℃,塔内停留20—30秒；维持罐5-7min；图1-4；

优点：高温短时灭菌，对营养破坏小；加热快，冷却快，灭菌时间短，设备利用率高；

缺点：设备投资大，当培养基含固体颗料或易产生较多泡沫时，易造成局部灭菌不充分与管

道堵塞；

3）影响灭菌的因素

培养基成分：

培养基中所含糖类，油脂，蛋白质含量高，微生物死亡速率慢；高浓度有机物增加培养基

的黏度，影响热的传入，因而需较高的灭菌温度；

高浓度的盐增加渗透压，促进热的传导，降低微生物的耐热性，易于灭菌；

培养基的物理状态：

颗粒大和结块的传热效果差，灭菌困难，有时需提高灭菌温度，延长灭菌时间；

pH：

6-8H-J',微生物最耐热；小于6时，氢离子易渗入细胞内，促使其死亡；pH越低，灭菌

时间越短；

培养基中污染菌的数量，菌龄，耐热性：

杂菌数量多，灭菌时间长；营养体，酵母，霉菌的菌丝体对热敏感，抱子和芽泡耐热性强;

泡沫：

泡沫的空气形成隔热层，空气导热差，包裹在泡沫中的微生物不易被杀死；因此灭菌操作

注意泡沫的产生，防止压力骤降而起泡

2发酵设备及管道和附属设备的灭菌

发酵罐：空罐灭菌；实罐灭菌；

管道：蒸汽灭菌；

过滤器：蒸汽灭菌；蒸汽压力0.2Mpa左右，不可过大，45-60min,然后通入压缩空气吹干;

3空气除菌

过滤除菌：让含菌空气通过过滤介质时，利用介质阻截空气中的微生物，取得无菌空气；

过滤介质：棉花，活性炭，玻璃介质，有机合成纤维，烧结材料

空气除菌设备流程；

粗过滤器，压缩机，贮罐，冷却器，旋风分离器，冷却器，丝网过滤器，加热器，过滤器；

1）采气：含菌少的空气：采气口距地面20-30m；郊区；

2）粗过滤器：捕集较大的灰尘颗粒；

3）空压机：能耗大；

4）储气罐：高温除菌；

5）冷却器：空气经压缩机后可达120℃高温，若不冷却会烧焦过滤介质；立式列管式热交

换器，沉浸式热交换器，喷淋式热交换器；

6）油水分离器：空气经压缩机后会带上一些润滑油；空气冷却后，水汽凝结成水滴；

7）加热器：空气湿度仍较大；通过加热，降低空气湿度；

8）总过滤器，分过滤器

三）微生物的接种技术

斜面接种，液体接种，固体接种；

接种环，接种针，玻璃刮铲，移液管，移液枪；

小规模：无菌接种箱，超净工作台；

大规模：无菌室；

工业：

管道压力差接种法，

即利用压力泵，

把种子液从种子罐

抽入发酵罐；

1无菌室的灭菌

1）熏蒸：

先将室内打扫干净，通风干燥后，重新关闭，熏蒸灭菌：福尔马林（37-40%甲醛水溶液），

取6-10ml/m3,盛于铁制容器中，利用电炉或酒精灯直接加热，或加高毓酸钾，通过氧化作

用加热，使福尔马林蒸发；熏蒸后密闭12h以上；使用无菌室前l-2h,取与甲醛溶液等量

的氨水，倒入搪瓷盘内挥发中和，以减轻刺激作用；或用乳酸，硫磺熏蒸灭菌；

2）紫外线灭菌：接种前后，打开紫外灯0.5h；

3）石炭酸喷雾：每次操作前，取5%石炭酸喷于接种室台面和地面；

2接种方法

1）试管接种

2）液体接种

斜面菌种接种液体培养基：

液体培养物接种液体培养基：

液体菌种接种固体平板：

3）固体接种

菌液接种固体料•：

固体种子接种固体料：

抢温接种：在固体料灭菌后不要使料温降得过低才接种，而在料温高于培养温度5-10C接

种；可使培养基在接种后得到适宜的温度条件，能迅速生长繁殖，长势好，杂菌不易滋生；

适于芽抱菌和产生抱子的菌接种；

堆积起温：大量的固体曲料接种后，不要立即分装曲盘或上帘，先堆积起来，上加覆盖物，

防止散热，使培养菌适应新环境条件，逐渐生长旺盛，产生较大热量使料温升高，再分装•

定容器中培养；这样可避免一开始培养菌繁殖慢，料温上不去，拖延培养时间，水分蒸发大,

杂菌易发展等缺点；

常压蒸汽灭菌时，为杀死芽泡，方法有；

高压蒸汽灭菌后，培养基的pH一般会—；

葡萄糖高压灭菌后会受到破坏，解决办法有；

微生物工业上，培养基灭菌采用—温—时；

培养基中含有机物浓度高时，灭菌时间应；

绘制通风搅拌式发酵罐结构模式图；

绘制连续灭菌流程图；

微生物工业上，空气除菌流程包括-

如何对无菌室进行灭菌：

固体料要抢温接种，堆积起温，原因是什么；

二培养基及其制备

-）培养基的成分及来源

1碳源：

糖：多数微生物利用糖作碳源；

单糖优于双糖多糖，已糖优于戊糖，葡萄糖果糖优于甘露糖，半乳糖；纯多糖优于杂多糖；

葡萄糖是最易利用的碳源，速效碳源；

但高浓度葡萄糖加速菌体代谢，溶解氧不能满足需要；

中间代谢物如乳酸丙酮酸不能完全氧化积累在菌体或培养基中，pH下降，微生物受到抑

制；

淀粉为长效碳源，利用较慢，高浓度不会对微生物产生不利影响

油脂：豆油，菜籽油：某些霉菌和放线菌可利用油脂作碳源；

有机酸：单细胞蛋白，氨基酸，维生素和某些抗生素的生产可利用乙酸盐，柠檬酸盐作碳源;

醇，烧：一些甲烷氧化菌只利用甲烷和甲醇作碳源；

2氮源

有机氮：

黄豆饼粉，花生饼粉，棉籽饼粉，玉米浆，蛋白豚，酵母粉，鱼粉；

含丰富蛋白质，氨基酸，含少量糖类，脂肪，生长因子；微生物在有机氮源培养基中生长

旺盛；

无机氮：

氨水，硫酸筱，氯化筱，硝酸盐；

速效氮源；

引起pH变化；钱盐利用后，pH下降，称生理酸性盐；硝酸盐利用后pH上升，称生理碱

性盐；氨水作补充氮源，调节pH；

玉米浆：是制玉米淀粉的副产物；

将玉米粒先用亚硫酸浸泡，浸泡液浓缩即制成黄褐色的液体，叫玉米浆；

3无机盐和微量元素

磷酸盐，硫酸盐，氯化钠，氯化钾，微量元素如镁铁钻锌镒；低浓度时对微生物有促进作用，

高浓度则表现出明显的抑制作用；

功能：

构成菌体原生质的成分（磷硫等）；

作为酶的组分或某些酶的辅酶或酶的激活剂，如镁铁锦锌钻；

调节细胞的渗透压和影响细胞膜的通透性，如氯化钠，氯化钾；

参与产物的生物合成；

需求量很低；天然培养基的碳氮源本身含一定量的微量元素，配制时一般不需单独加入；磷

酸氢二钾，硫酸镁；

3无机盐和微量元素

磷酸盐，硫酸盐，氯化钠，氯化钾，微量元素如镁铁钻锌镒；低浓度时对微生物有促进作用，

高浓度则表现出明显的抑制作用；

功能：

构成菌体原生质的成分（磷硫等）；

作为酶的组分或某些酶的辅醐或酶的激活剂，如镁铁镒锌钻；

调节细胞的渗透压和影响细胞膜的通透性，如氯化钠，氯化钾；

参与产物的生物合成；

需求量很低；天然培养基的碳氮源本身含一定量的微量元素，配制时一般不需单独加入；磷

酸氢二钾，硫酸镁；

4生长因子

维生素，氨基酸，喋吟，嗑咤的衍生物及脂肪酸；

维生素是辅酶的组成成分；

噤哈喀咤及其衍生物主要功能是构成核酸和辅酶；

5水

构成菌体细胞，营养物质传递的介质；

深井水，自来水，地表水，蒸锵水；

6产物形成的前体，促进剂，抑制剂

1）前体

加入培养基后，能直接被微生物在生物合成中结合到产物中去，提高产量的物质；

如苯乙酸是合成青霉素G的前体，丙酸是合成红霉素的前体；

有些前体高浓度时对菌体有毒害作用；少量多次；

2）促进剂

机制：

促进生长；

提高菌体抗自溶能力，缩短发酵周期，增加产物积累；如巴比妥增加链霉素产生菌的抗自溶

能力；

降低产生菌的呼吸来加快产物的合成，提高产量；

改变培养基的物理条件，达到改善通气效果，增加细胞渗透性的目的，从而提高产物合成；

与产物形成不溶性复盐，在发酵液中沉淀，降低产物浓度，解除反馈抑制作用

3）抑制剂

抑制某些不需要的产物形成；

酵母厌氧发酵时加亚硫酸盐或碱，使酒精发酵变为甘油发酵；

四环素发酵中，加浪化物抑制金霉素的形成；

表1-3；

二）培养基的类型

1）选择性培养基

根据某种微生物的特殊营养需求或其对某化学物理因素的抗性而设计的培养基，使混合菌样

中的劣势菌变优势菌；

如分离能分解纤维素或石蜡油的微生物，以纤维素或石蜡油为唯一碳源的选择培养基；

分离产胞外蛋白酶的微生物，以蛋白质做唯一氮源的选择培养基；

分离酵母菌，霉菌，培养基中加青霉素，四环素，链霉素，抑制细菌放线菌；

分离革兰氏阴性细菌，加染料亮绿或结晶紫，抑制革兰氏阳性细菌；

2）鉴别培养基

添加能与某菌的无色代谢物发生显色反应的指示剂；如伊红美蓝乳糖培养基；

2按培养基用途划分

1）抱子培养基

使微生物形成大量的泡子；

营养不能太丰富，特别是有机氮源要低些；

秋皮培养基，大（小）米培养基，葡萄糖（淀粉）无机盐蛋白陈培养基

2）种子培养基

供抱子萌发生长的培养基；

营养成分丰富完全；包括有机无机氮源，有机氮源有利于刺激抱子萌发，无机氮源易利用，

利于菌体快速生长；

3）发酵培养基

供菌体生长繁殖合成产物的培养基；

菌体在半饥饿状态下更有利于产物合成；

速效与迟效营养搭配，速效少用，迟效多用；

流加或补料；

三）培养基配制基本原则

1适宜营养成分

根据微生物类型选择：

牛肉膏蛋白豚培养基（普通肉汤培养基）培养细菌；

高氏一号合成培养基培养放线菌；

麦芽汁培养基培养酵母菌；

查氏合成培养基培养霉菌；

经济：

生产单细胞蛋白时，常利用糖蜜（制糖工业中含蔗糖的废液），乳清（乳制品工业中含乳糖

的废液），豆制品工业废液及造纸工业的亚硫酸纸浆；

甲烷发酵利用废水废渣，人畜粪便及禾草；农副产品或制品，如戴皮，米糠，玉米浆，酵母

浸膏，酒糟，豆饼，花生饼，蛋白陈；

2浓度及配比合适

浓度过低时不能满足生长，浓度过高抑制生长，如高浓度糖类物质，无机盐，重金属离子抑

菌或杀菌；C/N：

3物理化学条件适宜

细菌适宜pH7-8；

放线菌适宜pH7.5-8.5；

酵母适宜pH3.8-6；

霉菌适宜pH4-5.8；

加缓冲剂：磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，在PH6.4-7.2范围内起调节作用；

乳酸菌产酸，加碳酸钙调节；

4其他

灭菌的影响：长时间高温引起磷酸盐，碳酸盐与某些阳离子（钙镁铁）结合形成难溶性复盐;

含钙镁铁的成分与磷酸盐碳酸盐分开灭菌，再混合；

四）培养基的制备

1原料的预处理

用来培养食用菌的秸杆，粪土，棉籽壳，先建堆发酵；

生产酒精，丙酮时，淀粉先蒸煮，糖化；

酒精发酵时，糖蜜先稀释，酸化，灭菌，澄清，加营养盐；

柠檬酸生产中，使用糖蜜做原料时，加黄血盐去除铁离子；

2配制流程

1）称量，溶解：

2）调pH：固体培养基pH调整在加琼脂前进行；

3）过滤澄清：纱布过滤，棉花过滤；

4）分装，加棉塞：斜面装1/4,平板15-18ml,三角瓶172-2/3,装棉塞，牛皮纸包扎：

5）灭菌，倒皿，摆斜面

葡萄糖是速效碳源，使用时应注意什么；

配制培养基时，常加入的无机盐有;

举例：生理酸性盐，生理碱性盐；

三微生物分离培养技术

-）固体培养基分离纯化

1稀释平板分离

2划线法分离

3稀释摇管法：分离厌氧菌；

二）液体培养基分离纯化

并不是所有微生物都能在固体培养基上生长，许多原生动物和藻类，细菌，需用液体培养基

分离；

稀释法，每一试管中分配不到一个微生物；

三）单细胞分离

较大的藻类，原生动物较容易，较小的细菌较难；

解剖显微镜，显微操作仪；

四）选择培养分离

1选择培养基

从土壤中筛选蛋白能产生菌时，培养基中加牛奶或酪素制备培养基，微生物产蛋白醐水解牛

奶或酪素，在平板上形成透明的蛋白质水解圈；

分离高温菌，在高温条件下培养；

分离抗生素抗性菌株，在加有抗生素的平板上分离；

2富集培养

制定特定环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长；

五）二元培养

保存病毒；银耳与香灰菌丝；

第三节微生物发酵过程以及控制

-常见微生物发酵类型及设备

-）微生物发酵类型

1按终产品分

1）微生物菌体发酵

酵母发酵；

微生物菌体蛋白发酵；

药用真菌发酵，可通过发酵培养手段生产出与天然产品具相同疗效的产物；

微生物杀虫剂，如苏云金杆菌，蜡样芽抱杆菌，白僵菌，绿僵菌；

2）微生物酶发酵

微生物生产的淀粉酶和糖化酶用于生产葡萄糖；

胆固醇氧化酶用于检查血清中胆固醇的含量；

葡萄糖氧化酶用于检查血中葡萄糖的含量；

3）微生物代谢产物发酵

初级代谢产物：氨基酸，核甘酸，蛋白质，核酸，糖类：

次级代谢产物：抗生素，生物碱，细菌毒素，植物生长因子；

4）微生物转化发酵

利用菌体将乙醇转化成乙酸的醋酸发酵：

将异丙醇转化成丙醇，甘油转化成二羟基丙酮，密类转化，抗生素的生物转化；

5）生物工程细胞的发酵

基因工程菌生产胰岛素，干扰素，青霉素酰化酶，用杂交瘤细胞生产用于治疗和诊断的各种

单克隆抗体

2按物料和产物的进出方式分

1）分批发酵

发酵过程中所有物料（除空气，消泡剂，酸碱）•次加入发酵罐，灭菌，接种，培养，产物

回收；柠檬酸，氨基酸，抗生素，维生素；

2）连续发酵

发酵过程中，以一定的速度向罐内连续加入新鲜培养基，以相同速度排出含有产品的培养液;

发酵周期长，菌种易变异；

3）补料分批发酵

流加：微生物分批培养过程中向反应器中间歇或连续补加一种或一种以上特定的限制性底

物，反应后一次排出培养液；

使基质浓度保持在较低水平，解除或减小了底物与产物的抑制与阻遏作用；不会产生菌种变

异，物料污染问题，终产物浓度高；

单细胞蛋白，氨基酸，生长激素，抗生素，维生素，的制剂，有机酸，有机溶剂，核昔酸；

二）发酵设备

1固态发酵设备

蘑菇栽培的发酵架，发酵室；酿酒用的发酵缸；制曲的曲盘；通风制曲设备；

发酵工艺控制难

2）好氧发酵设备

机械搅拌式发酵罐：通用式，自吸式，伍氏；

外部液体搅拌式发酵罐：罐外的循环泵搅动；

空气喷射提升式发酵罐：靠压缩空气搅动发酵液，使气液混合增加溶氧；

2工艺要点

1）接种

保藏种到斜面到摇瓶：接种环；

摇瓶到种子罐：火焰接种；打开种子罐接种孔，接种孔周围放酒精棉球，点着，把摇瓶口在

火焰上灼烧后，把里面种子液迅速倒入发酵罐中；用火烧接种口盖子内侧，盖上，拧紧；

种子罐到种子罐：管道化压差接种法；罐之间用管道连接，利用压力差把一个罐中液体加入

另一罐中；

接种量：1-20%；视菌种生长速度而定；

接种龄：对数生长期；生长速度最快，生活力最强；

3培养条件

1）温度

最适生长温度附近，可缩短缓慢期；

2）pH

生长最适pH；保持pH稳定：加酸碱，缓冲液，生理酸性碱性盐；

3）通气

不同生理时期需氧量不同；搅拌；

4）泡沫

影响微生物对氧的吸收，妨碍二氧化碳的排除；

4种子罐的级数

菌种性质：菌种传代后的稳定性，产生的胞子数，菌丝繁殖速度；

发酵罐中种子的最低接种量，种子罐与发酵罐的容积比；

三微生物发酵控制

-）温度

1变化

前低中高，后回落；

发酵热=生物热+搅拌热-蒸发热-辐射热

2影响

1）菌体生长最适温度：温度升高，酶反应速度加快，呼吸代谢加强，微生物生长繁殖加快;

但酶失活速度加快，蛋白质变性加快，死亡加快；

2）产物合成最适温度：影响产物合成速度；影响产物合成方向：

如四环素发酵中，金色链霉菌低于30℃时，合成金霉素能力强；超过35℃时，合成四环素;

3选择

分段选择；

青霉素产生菌最佳生长温度30℃,合成青霉素最适温度24C；

生长初期：使菌体大量繁殖，最佳生长温度；

生产期：产物合成温度：

4控制

一般需降温；冷却装置；

二）pH

1影响

2变化

对基质的利用：碳源过多导致pH下降；C/N高，培养基偏酸性；反之，偏碱性；尿素被分

解时镂离子浓度增加，pH上升；

代谢产物的产生；

规律：生长期pH上升或下降，产物合成期pH稳定，自溶阶段pH上升；

3选择

生长最适pH：产物合成最适pH；

4控制

控制原始pH：控制培养基中各成分配比C/N；加缓冲液；

发酵过程中加酸碱；

通过补料控制；

三）氧气

1影响

生产菌种；

菌体浓度增加，需氧量增大；

菌龄：对数期和稳定期需氧量大，延滞期和衰亡期需氧量较小；

3控制

搅拌效率；

增加通气量；

通入纯氧；

提高罐压；

补水稀释培养液；

降低培养温度；

四）基质浓度

1影响

生长-基质关系：图1-13；如葡萄糖浓度低于100-150g/L时，不出现生长抑制;大于350-500g/L

时，多数生物不能生长；

培养基过于丰富对产物合成不利：

2控制

补料控制：如谷氨酸的生产中，控制低水平的基质浓度，流加尿素；青霉素生产中，流加葡

萄糖；

五）泡沫

蛋白质与气泡混合成泡沫；

1影响

大量逃液，减少发酵液的体积，增加杂菌污染的机会；

2控制

机械消泡：

化学消泡：油脂；合成消泡剂如聚氧丙基甘油酸，聚氧乙烷丙烷甘油酸，十八醇，聚二醇，

硅树脂类，二甲基硅树脂油；

六）发酵终点

产物产量，

过滤速度，

发酵液外观与黏度，

pH,

菌体形态；

七）染菌

1染菌的检查

1）将样品在无菌平板上划线，37℃,28℃培养，8h后观察；

2）显微镜观察：革兰氏染色；

3）肉汤培养法：噬菌体检查，培养基及无菌空气无菌检查；

异常现象：

溶解氧：感染细菌，噬菌体；

pH变化：杂菌产酸；

排气组分：

酶的变化：

糖代谢异常：

如噬菌体污染：糖氮消耗迟缓，pH异常，产大量泡沫，发酵液黏稠，产物减少或停止，菌

体自溶

2原因

培养基灭菌不彻底；

种子带菌；

发酵设备灭菌不彻底或设备泄漏；

空气带菌；

第四节发酵产物提取与加工

发酵液预处理与固液分离，提取，精制，成品加工；

根据：目的物分子量，结构，极性，两性电解质性质，溶解性，沸点，对pH温度溶剂的敏

感性；

一发酵液的预处理与固液分离

-）预处理

1杂蛋白：等电点法，热沉淀，盐析法，有机溶剂沉淀；

2高价金属离子：钙镁：草酸，磷酸：铁：黄血盐；

二）过滤

助滤剂：硅藻土，珍珠岩粉，活性炭：

反应剂：加磷酸氢钠，氯化钙，形成磷酸三钙，将菌体及其他悬浮的粒子凝聚沉降；

三）细胞破碎

化学（碱或去污剂裂解，溶剂浸出），酶法，物理法（冻融，加热裂解，渗透压破裂法，超

声波破碎），机械法，脱水干燥法（溶剂干燥，气流干燥，冷冻干燥）；

二提取与精制

-）沉淀法

等电点，有机溶剂沉淀法，盐析法，不溶性盐沉淀：

-）色谱分离法

1吸附色谱

硅胶，氧化铝，活性炭，聚酰胺，聚苯乙烯，碳酸钙；

颗粒度越小，吸附速度越快；

极性吸附剂易吸附极性物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质；

与pH有关；

硅胶使用前150-200℃活化；活性炭使用前150℃加热4-5h；

极性大的洗脱剂洗脱能力大，因此先用极性小的做洗脱剂，再换用极性大的溶剂；

2离子交换色谱

3凝胶色谱：的制剂的脱盐，核酸，蛋白质与核昔酸的分离

三）萃取法

溶剂萃取：利用物质在亲水性溶液和疏水性溶液中的溶解度不同而分离纯化；

双水相萃取：利用两种亲水聚合物的水溶液混合时;形成两相；适于提取易失活的，亲水性

强的生物大分子物质；

三）萃取法

溶剂萃取：利用物质在亲水性溶液和疏水性溶液中的溶解度不同而分离纯化；

双水相萃取：利用两种亲水聚合物的水溶液混合时，形成两相；适于提取易失活的，亲水性

强的生物大分子物质；

四）膜分离

依据溶质分子的大小，形状，性质差别，对各种薄膜表现的不同的可透性而达到分离；

小分子通过，把较大分子挡除；

透析，超滤，电渗析，反渗透；

五）结晶法

过饱和：调pH,冷却或蒸发；浓缩结晶，冷却结晶，化学反应结晶，盐析结晶；

三成品加工

浓缩，无菌过滤，加稳定剂；

浓缩：薄膜蒸发，膜过滤；

干燥：真空干燥，红外线干燥，沸腾干燥，气流干燥，喷雾干燥，冷冻干燥；

如何分离纤维素酶产生菌；

按用途划分，培养基分为,,:

按终产物分，微生物发酵分为;按物料进出方式分，分为;

绘制通风发酵池示意图：

发酵的一般流程是:

常用的泡子培养基有;

培养细菌，放线菌，霉菌，酵母菌常用的培养基分别是;适宜的pH分别

是;

稳定培养基pH的方法有；

发酵产物提取纯化的流程是;

第二章微生物肥料

第一节概述

微生物肥料：Microbialfertilizers；

由单一或多种特定功能菌株，通过发酵工艺生产的能为植物提供有效养分，或防治植物病虫

害的微生物接种剂；

-种类

-）按微生物种类划分

细菌肥料：如根瘤菌，固氮菌，磷细菌，钾细菌，光合细菌；

放线菌肥料：抗生菌类；

真菌类肥料-：外生菌根菌剂，内生菌根菌剂，如VA菌根菌剂，兰科菌根菌剂；

藻类肥料：固氮蓝藻；

复合生物肥料•：几种微生物混合在一起；

三）按其功能和肥效划分

1增加土壤氮素：如根瘤菌肥，固氮菌肥，固氮蓝藻；

2分解土壤有机质：如有机磷细菌肥料，综合性菌肥；

3分解土壤难溶性矿物质：如无机磷细菌肥料-，钾细菌菌肥；

4刺激植物生长：如抗生菌肥料，促生菌肥；

5增加作物根系吸收营养能力：如菌根菌肥料•；

四）按其产品剂型划分

液剂：菌种投放到无菌罐中进行工业深层发酵；粉剂：液体微生物肥料和草炭土混合产生,

运输方便，含菌量高，增产效果明显；

颗粒：微生物肥料经造粒设备进行喷雾，造粒，低温烘干产生；

二作用

一）增进土壤肥力，协助农作物吸收营养

1

自生，联合或共生的固氮微生物肥料•，可以增加土壤中的氮素来源；

多种溶磷，解钾微生物，如芽泡杆菌，假单胞菌的应用，可将土壤中难溶的磷钾分解，转变

为作物能吸收利用的磷钾；

2菌根：

土壤真菌，与多种植物根系共生；菌丝可吸收更多的营养供给植物吸收利用，对磷的吸收最

明显，对在土壤中活动性，移动缓慢的元素如锌铜钙等有加强吸收的作用：

国内外以大量的菌根培养物用于名贵花卉，药材；大量生产的外生菌根接种剂用于林业取得

明显效果；

3分泌一些刺激素，维生素：

固氮菌能产生多种维生素类物质，如生长素，肌爵，盐酸，泛酸，毗哆醉，硫胺素，刺激作

物生长；

二）增强植物抗病虫抗逆性

1肥料中有益微生物生长繁殖，在作物根际土壤微生物系统内形成优势种群，限制了其他病

原微生物的生长繁殖机会，拮抗病原微生物；如植物根圈促生细菌PGPR,包括了好多科的

多种细菌；

2诱导作物产生超氧化物歧化醐，在植物受到病害，虫害，干旱，哀老时，消除因逆境产生

的自由基；

三）减少化肥使用量

可提高土壤养分含量，因此在相同地力水平土壤上可减少化肥用量，并获得增产效果；

可提高农产品品质，如蛋白质，糖，维生素含量提高；

三微生物肥料的施用条件

土壤持水量30%以上，低于30%时要浇水，及时中耕以保持土壤墙情；

温度在10-40℃,

PH5.5-8.5；

含微生物繁殖所必需的营养；

选择阴天或晴天傍晚使用，并结合盖土，盖粪，浇水措施；避免在高温干旱条件使用，避免

受阳光直射；

四应用前景及发展趋势

一）应用前景

1施用广泛，市场容量大

适宜施用微生物肥料的作物种类：各种豆科作物，粮食作物，经济作物，蔬菜瓜果；

我国微生物肥料年产量10-40X104t,化肥1.2X108t：

大豆种植面积1000X104hm2,花生33OX104hm2,而实际应用微生物肥料接种的大豆面积

1%,花生更少，其他大面积豆科绿肥，牧草极少应用；因此，市场容量大；

2生产成本低，应用效果好

美国和加拿大这样重茬种植大豆的国家，农民单靠接种剂可获高产；

化肥生产成本的提高，价格上涨幅度过快，已令农民难以接受，增加有机肥，微生物肥料的

施用不再是权宜之计，而是降低农民投入，提高产品品质，减少环境污染，取得较大经济，

社会和生态效益；

3生产无公害绿色食品，减少环境污染的需求

生产安全无公害的绿色食品是一个发展趋势；

土壤物理性质恶化，土壤质量下降问题日益突出；

城市，农村对废弃物消纳的压力越来越大，要求无害化，肥料化；

二）现状与问题

1在工厂化生产中，普遍缺乏高效菌株，菌种资源缺乏

2生产设备陈旧

很多是由已倒闭的小型酶制剂厂，味精厂，柠檬酸厂改造而成，效率低，能耗高；

3技术工艺落后

生产过程中缺乏监控和检测手段，有的甚至是小作坊式生产；

4市场上鱼目混珠，假冒伪劣屡禁不止

四）发展趋势

1由单一菌种向复合菌种发展：固氮菌，磷细菌，钾细菌复合；由单功能向多功能发展；

2使用芽抱杆菌：芽抱菌耐高温，干燥，抗逆性强，利于制作颗粒剂，干粉；

3采用生物技术对菌种进行基因重组，选取高效菌种

4在生物肥剂型上，由粉状转向挤压条状，颗粒状

5田间应用上，向经济作物倾斜，和绿色食品生产相结合

第三节微生物肥料生产

-单一微生物肥料

根瘤菌肥料的出现已有100年的历史，普遍应用也有70年的历史，是世界上公认效果最稳

定，最好的微生物肥料；

菌种：花生根瘤菌，大豆根瘤菌，华癸根瘤菌，苕子，蚕豆，豌豆根瘤菌，苜蓿根瘤菌，菜

豆根瘤菌，沙打旺根瘤菌；三叶草根瘤菌肥，百脉根根瘤菌肥，胡枝子根瘤菌肥，绿豆根瘤

菌肥；

大豆根瘤菌菌种的筛选

挖取带根瘤的根系，装入塑料袋中以备分离根瘤菌；

用流水反复冲洗根瘤，至无附着土壤，吸干水分，置75%酒精中浸3—5min,放0.1%升汞

中消毒3-5min,再用无菌水冲洗根瘤，除去残存消毒液，切开根瘤，用接种环蘸瘤汁在培

养基上划线；28—30℃培养；

培养基：虫露醇，酵母膏，磷酸氢二钾，硫酸镁，氯化钠；刚果红；

菌落：菌落黏稠，乳白色，在平板上不吸色或早期不吸色，杂菌易吸色；选取典典型菌落在

刚果红平板上划线纯化，保存；

菌株鉴定；根瘤菌杆状，革兰氏阴性，2—6根鞭毛或一根端生或侧生，没有芽抱；

-）菌种的制作

斜面培养

豆芽汁培养基：0.5kg绿豆芽，洗净放入锅里加水1kg煮沸20-30min,过滤即得豆芽汁，加

20g琼脂加水0.5kg煮溶，过滤，混合后加糖，加碳酸钙，补水到1000ml,调pH6.8-7.2,

121℃30min,趁热取出摆斜面;

28℃2-4d,菌苔长满取出放冰箱保存；

二）扩大培养

1固体扩大培养

用克氏瓶制成斜面，作斜面菌种或液体种子接种，菌苔长满；

2液体扩大培养

三角瓶摇床培养；

500ml三角瓶装150ml培养基，28℃旋转式摇床230rpm,2-3d,每毫升含菌几H乙到一百

亿；做种子；

3发酵罐培养

培养基，罐体，管道消毒，接种量2-3%,28-30℃,罐压，通气量0.8-1：1,搅拌速度360rpm,

培养两天；

三）吸附剂的准备和接种

草炭，含丰富有机质，保水力强，疏松不黏结，通气良好；晒干，打碎，过筛，除去石头，

杂草，调pH6.8-7.6,用石灰或过磷酸钙调节；装瓶2/3或3/4,126e2-3h；

接种：

接种室：接种前一天关闭门窗，用福尔马林熏蒸，紫外灯照射；

加压喷射法装瓶，或装袋（塑料袋用福尔马林熏）：

造粒方式：圆盘分开造粒；

四）根瘤菌肥的应用

将选好的种子倒入内壁光洁的瓷盆或木盆，用凉水将菌剂用水250-500g调成浆糊状，再把

种子倒入拌匀，使每粒种子沾上菌剂，阴凉处摊开，稍阴干，使根瘤菌剂牢固地吸附在种子

上，播种时也易于撒开时，立即播种，随即覆土；

应用原理：

肥料通过拌种，土壤接种后在相应的豆科种子周围存活，繁殖，当豆科植物萌发长出幼根后，

肥料中的相应根瘤菌通过根部，侵入，并在较短时间后即形成根瘤，依靠豆科植物的营养，

实现生物固氮；

注意事项：

1专一性；

2用来拌种，不能做基肥或追肥：

3不能在太阳光直射或高温条件存放，应常温保藏；存放不超半年；

4不要在晴天中午播种，宜在傍晚和阴天撒播，拌种后稍阴干就播种；

5最好一次用完；

6拌种不要与农药，过磷酸钙•起拌，可与钙磷镁肥一起拌，先拌菌，后拌钙磷镁肥；使用

适量磷肥可提高根瘤菌的结瘤率；用含0.1%稀土化合物吸附根瘤菌；

7根瘤菌生长要求湿润疏松的土壤，含水量在20-30%；稻田水要放干晒l-2d再播种，旱田

要在下雨前后条播，盖一层薄土；

8土壤pH,对于酸性土壤，作物种子和根瘤菌剂拌和后，再与泥浆，钙镁磷肥或石灰拌和，

形成丸衣；

在初开垦土地使用根瘤菌后，豆科植物增产效果明显；如新开垦的土地种植花生，若不使用

花生根瘤菌肥，则花生结果率低；

无论是连年或轮作豆科植物的土壤，还是已施用过根瘤菌的土壤，经常使用高效根瘤菌制剂

非常必要；如在栽种过紫云英，花生，大豆的老区使用高效菌肥拌种，产量可继续提高；

生产流程：

斜面菌种，固体种子培养或液体种子培养，扩大培养；

草炭肥土晒干，粉碎，过筛，灭菌，混合吸附；包装，成品；

剂型:

粉状（草炭，蛭石或其他载体），液体，种衣剂，冻干菌；

自生固氮菌

常用菌种：圆褐固氮菌，维涅兰德固氮菌，阴沟肠杆菌，肺炎克氏杆菌：

特点：

化合态氮丰富的肥沃土壤中，利用有效氮，不固定分子态氮；

固定的氮在满足自身需要时，多余的氮会抑制固氮作用，效率低，只是普通根瘤菌固氮量的

几十分之一；

土壤中有机质含量低，影响其生长和固氮作用；

结合秸杆还田，有机肥料施用；

可分泌阻躲乙酸类似物和赤霉素，产生维生素，异生长素，降解难溶性磷化物；

对禾本科作物，1/3表现增产作用；

对蔬菜作用效果明显；

生产：

固态：

液体：菌种，斜面，种子罐，发酵罐，草炭吸附，分装塑料袋；

联合固氮菌及其应用

微生物：拜叶林克氏菌，肺炎克氏杆菌，雀稗固氮菌，浸麻类芽抱杆菌，多黏类芽泡杆菌，

巴西固氮螺菌，产脂固氮螺菌，阴沟肠杆菌；

固氮细菌在植物根际，根表，根的皮层，黏质鞘内生活，取得定居环境和生长所需的能量和

碳源固氮；

固氮能力低，对农业意义不大；

产促生物质，提高根毛密度和长度，增加侧根数量，使根系表面积增大，吸收能力提高，促

进植物对无机养料和水分吸收；

生产：草炭做载体：

施用技术：

一般在禾木科作物上使用；小麦，克鲁伯菌；水稻，粪产碱菌；

拌种，或基肥，液体肥料；

硅酸盐细菌（钾细菌）

农作物对钾需求量比磷的需求量大1—2倍，与氮的需求量接近；钾使根系发达，茎杆粗壮,

籽粒增多，粒重增加，促进成熟，增强抗逆性，减轻病害；

土壤中含丰富钾资源；比氮和磷储藏量高10—20倍；但绝大部分以长石，云母等铝硅酸盐

形态存在于土壤中，不能被直接利用：丰富的钾宝库中，但仍处于钾的饥饿状态中；

钾细菌：

产乳酸，柠檬酸，酒石酸，苹果酸；分解钾长石，云母，使难溶性钾转化为植物能吸收利用

的有效钾，分解无效磷为有效磷；

接种钾细菌的土壤，28℃4d,速效钾与速效磷含量增加一倍；钾细菌菌体灰分中钾量高达

33-43%；

速效磷钾含量提高，有利于作物生长；增强抗病能力；小麦，减轻锈病，赤霉病，棉花黄叶

枯茎病发生率比对照低24%,衰老期延迟20天；

生产

菌种，斜面，克氏瓶，种子罐，发酵，菌液；

草炭，腐殖酸，无害化畜禽粪便；自然干燥，粉碎过筛，混拌吸附，造粒，烘干，包装；

使用：

种肥：每公顷15-23kg与种肥混合使用；

蘸秧根：1：1到1：4；菌肥浸出液浸根或蘸根；

磷细菌

我国2/3耕地缺磷；

有机磷，占全磷1/3—1/2；植酸，磷脂形态；

无机磷，占全磷40—75%,大部分为不溶性，如磷酸钙，磷酸铁，铝磷酸盐；很难利用；

能被直接吸收利用的有效态磷占全磷2—3%；

有机磷细菌：产磷酸酶，将磷酸酯键打开；常用芽抱杆菌属，抗逆性强；如巨大芽泡杆菌，

假单胞菌；

无机磷细菌：产有机酸，如乳酸，柠檬酸，草酸，乙酸，碳酸，硝酸，硫酸，增加磷酸钙的

溶解性

1菌种分离

取样：采土深度5—15cm；

培养基：

有机磷细菌培养基：葡萄糖，硫酸镀，氯化钠，硫酸镁，硫酸亚铁，硫酸镒，碳酸钙，氯化

钾，卵磷脂，pH7.2；

无机磷细菌培养基：葡萄糖，硫酸镀，氯化钠，硫酸镁，硫酸亚铁，硫酸钵，碳酸钙，氯化

钾，磷酸钙,pH7.2；

菌种筛选：24—36h,平板菌落周围透明圈有无及大小；复筛：采用液体摇瓶，定量接种，

30℃振荡培养5-9d,铝睇抗比色法测有效磷含量；

2生产

斜面：马铃薯，碳酸钙；

三角瓶，克氏瓶：麦秋浸汁；

种子罐：麦熬浸汁，投料为罐容量2/3；接种量10—20%；

发酵罐：麦魅浸汁，接种量10-20%；

载体干燥，粉碎，原料混合成粒剂，混合吸附，造粒烘干；

3使用：

种肥：每公顷15-23kg；

拌种：稀释成糊状，与种子拌匀，播种；

蘸秧根：每公顷30-45kg,加水稀释成糊状；

根瘤菌，钾细菌和磷细菌的分离方法；

根瘤菌肥，钾细菌肥，磷细菌肥的发酵生产方法；

菌根菌肥料

真菌的菌丝与植物根联合形成共生结构菌根；自然界绝大多数植物都有菌根，对改善植物营

养和增强植物抗逆性有良好作用；

一类型

-）外生菌根：

多形成于木本植物，乔木灌木；多数外生菌根真菌是广谱性寄生真菌，少数为专性寄生真菌,

如小牛肝菌只与落叶松形成菌根；

特征：

在菌根外形成菌套；菌丝在根表面生长繁殖，并交织成套状结构