总的实验手册

实

验

手

册

华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室

细胞工程分室柑桔课题组

二OO二年七月•武汉

录

翩B1

因缴招B2

1、培养基母液的配制3

2、柑桔胚性愈伤组织的诱导5

3、柑桔原生质体操作6

4、柑桔胚性愈伤组织和茎尖的超低温保存11

5、微嫁接13

6、花粉的制备和保存13

更钾丝初^14

1、DNA提取和检测15

2、SouthernbIotting19

3、NorthernbIotting27

4、AFLP标记30

5、SSR操作步骤36

6、ISSR操作步骤37

7、根癌农杆菌介导柑橘愈伤组织遗传转化38

8、PCR产物的TA克隆41

9、植物RNA的分离和纯化(异硫氨酸胭法)47

10、GISH分析49

假圉何O51

1、色彩色差计CR-300的使用流程及注意事项52

2、细胞流式仪(PA)操作规程55

Wecomehereforthecommoninterest.Everyyearweputourheartintotheresearch

soastofindsomething.Butforabeginneritisofgreatdifficultyforhimtoinitiatethefirst

step.Muchtimeshouldbespentontheprotocolreading,documentretrievalandmethod

optimization.Inorderto,tosomedegreeifnotcompletely,avoidthistedious,

time-consumingandbafflingperiodthestudentsintheCitrusResearchGroupofCell

EngineeringDivisionofNationalKeyLaboratoryofCropGeneticImprovement,Huazhong

AgriculturalUniversity,comeupwiththeideaofsummarizingtheirresearchprotocolsand

ideas,whichiswhatyouwillseenow.Ithinkthiswillbeofgreathelpforthosewhowant

todothesimilarworkshownherein.Thoughyoucanseetheprotocolsinotherreferences

youcannotgeteverydetailfortheexperimentbecausetheintroductionthereisverysketchy.

Onthecontraryyoucanseethedetailsfromthestudents9personalgeneralizationinthis

manual.Thepresentmanualcoversmanyhorizonsofbiologicalsciences,rangingfromtissue

culturetomolecularmarkersthatarestate-of-the-arttopicsforthetimebeing.Inaddition

someintroductionofmachineoperationsareincludedsothatthosewhowanttousethe

instrumentcanbenefitfromthismanual.

ThanksshouldbeextendedtoProf.XiuxinDengforhiskindofferofthefinancial

supportforthesmoothpublicationofthismanual.Inthemeantimegratitudeshouldbegiven

toallofthepostgraduatestudentswhohavebeenworking,areworkinghere.Withouttheir

hardworkwewouldnothavebeenabletogetaverythroughsummaryofthework.

第一部分

1、培养基母液的配制

一.大量元素（10倍液）：称取下列药品分别溶解定容到1升后，加到5升存储瓶中。

KNO395g

NH4NO382.5g

KH2P。48.5g

MgSO4*7H2O18.5g

CaCb・2H2。22.0g

注意事项：

1配置母液前要仔细清洗存储容器

2.应按照顺序分别彻底溶解后混合，每加完一种药品，摇动存储瓶使其混合均匀；

3.溶解时最好加热，以便充分溶解，避免沉淀的产生；

4.夏季要用新制的蒸储水，并加热，这样可以避免因为水中带菌量过大而产生沉淀,

同时可以减缓绿藻的生成；

5.沉淀的产生一是由于溶解不充分就混合造成的（浑浊型沉淀），所以配置时一定不

要急；二是由于长菌而产生絮状沉淀，所以要用新制的蒸储水并加热。

二.微量元素母液的配制（100倍）：取少量（200-300ml）温水依次加入下列药品，每加一种

药品后搅拌溶解，最后定容到1L：

KI0.083g

H3BO30.62g

ZnSO4*7H2O0.86g

NaMoO4*2H2O0.025g

CUSO4*5H2O0.0025g

COC12*6H2O0.0025g

MnSO4*4H2O2.23g(MnSO4*H2O1.69g)

注意：配好后在室温下放置10h以上再放入冰箱保存，即刻放入冰箱易产生结晶沉

淀。配制过程中产生沉淀的原因有：1.前一个没彻底溶解就加入了后一个药品；2.蒸

储水pH值过高，可加几滴盐酸校正。

三.甘氨酸和肌醇的配制（100倍）：

甘氨酸:0.2g溶解定容到一升；肌醇：10g溶解定容到一升。

四.铁盐的配制（100倍）：

称取EDTA3.73g,FeSO4-7H2O2.78g,分别溶解后混合定容到1L,放入棕色细口瓶

中，室温放置10h以上（防止结晶沉淀），然后放入4℃冰箱。

五.维生素B的配制（100倍）：

改良MT：VBi（盐酸硫氨素）1g,MS：10mg

VB6（盐酸毗哆素）1g,50mg

VB5（烟酸）0.5g,50mg

分别称取顺序溶解在温热的蒸储水中，定容到1升。

注：需要溶解完一个再加另一个。VB5不易溶解，需要搅拌，必要时可以加热。

六.Vc的配制：

称取VcO.5g溶解在蒸储水中，定容到1升即可。

七淇它

BA,NAA,IBA,GA3等激素类试剂可先用少量INNaOH彻底溶解，再加水定容。配

好后在室温放置一段时间，再放入冰箱中冷藏保存。有些试剂在乙醇或盐酸中也可溶解,

但比较而言，用碱溶解比较稳定，不易产生沉淀。

注意：母液最好不要配制太多，如果配制的量较大，短时间内用不完，最好分装一

部分到小的细口瓶中，在做培养基时使用。这样不容易产生沉淀。

2、柑桔胚性愈伤组织的诱导

1幼嫩胚珠诱导愈伤组织培养基

(1)MT+ME(500mg/L)

(2)MT+BA10mg/L

(3)MT+IAA(O.lmg/L)+KT(O.5mg/L)

2.成熟果实未发育胚珠诱导愈伤组织培养基

(1)GA3(lmg/L)+SAD(40mg/L)+MT

(2)2,4-D(O.Olmg/L)+BA(0.1mg/L)+MT

附成熟果实未发育胚珠的灭菌及培养方法：

取成熟果实，将果实剖开，去掉果肉，可发现囊衣内紧靠中柱处有许多未发育的小

胚珠，长约L5-2.5mm。用小镶子将这些未发育胚珠轻轻挑下，放入一培养皿中，培养

皿中预先放入一张滤纸，以预防小胚珠干燥失水，取无菌滤纸一张，漏斗一支，将滤纸

放入漏斗中，而后将已取出的小胚珠放入其中，再将3%次氯酸钠倒入漏斗进行消毒，

消毒15分钟后，用无菌水进行冲洗3-5次，每次10分钟，然后将滤纸及小胚珠取出接

种于诱导培养基中，进行暗培养。1-2个月后即可看到有胚状体的形成，有的从胚状体

上直接形成愈伤组织，有的胚状体继续发育形成小植株，部分胚状体会产生次生胚状体,

将这些胚状体在MT+AgNO35mg/L培养基上进行暗培养，有利于愈伤的形成。

3、柑桔原生质体操作

一、材料的准备

1.胚性悬浮系的建立：从固体培养基上取继代20天左右生长旺盛的愈伤组织于MT+ME0.5g

/L+谷氨酰胺L5g/L+蔗糖40g/L的液体培养基中（每瓶50ml）,100转振荡培养，每两周继代一

次，3代后用于分离原生质体。

2.无菌苗的获得：柑桔种子无菌条件下播种于MT培养基上，20-30天后叶片充分展开后用于

分离原生质体。

二、原年质体的分离

1.悬浮系原生质体的分离：用吸管吸取1g左右的继代6-10天的悬浮培养物于15x60mm的

培养皿中，吸干培养基，加入L5mlO.7EME和1.5ml酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇

床上（20-30转）或静置，28℃暗条件下酶解16-24小时。

2.叶肉原生质体的分离：1.5mlO.6EME加入一15x60mm的培养皿中，在此培养皿用解剖刀

将叶片切成0.05-0.1cm的细条，后加入1.5ml酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床上（20-30

转）或静置，28℃暗条件下酶解16-24小时。

三、原生质体的纯化：

1.酶解后的原年质体经孔径为4511m的不锈刚网去掉渣质,CPW13洗涤以收集大量原生质

体,滤液在10ml离心管中离心（100转）10分钟，使原生质体沉于管底。

2.沉淀物用3mlCPW25悬浮，在其上轻轻加入1mlCPW13,100转离心2-6分钟，原生质

体在两液面间形成一条带，其它杂质及少量原生质体沉于管底。（注：如果此种情况下无法形成界面,

则原生质体沉淀物用CPW13悬浮）

3.将原生质体轻轻吸出，置于另一离心管中，用电融合液离心洗涤6-8分钟，去掉上清液，用

电融合液悬浮至5-10x105个/ml备用。（用血球计数板调密度，一个大方格中原生质体数X10000

即是原生质体密度）

四、原生质体活性检查

FDA用丙酮配制成5mg/ml的浓度。按25ulFDA/ml原生质体的比例加入FDA,5分钟后

在万能显微镜下检查原生质体活性（暗视野下发荧光原生质体数/明视野下原生质体总数）。

注:叶肉原生质体发红色荧光,而悬浮原生质体发黄色荧光。

五、原生质体融合

一）PEG法

1.将悬浮好的双亲原生质体等体积混合

2.用吸管滴2滴混合好的原生质体于15x60cm塑料培养皿中央，立即加入40%的PEG2滴

诱导融合

3.10分钟后，加入稀释液（9A/1B）2滴

4.15分钟后，从边缘缓缓加入12滴EME培养基，保持20分钟后用吸管沿边缘小心移走

5.从边缘再加入15滴EME培养基，保持10分钟后小心移走。

6.重复步骤5两次

7.最后加10-15滴BH3培养基，在培养皿中央形成一小池，沿培养皿边缘加入15-20滴BH3培

养基，保持培养皿内的湿度，封口膜封口。

二）电融合法

1.将双亲原生质体用电融合液悬浮，混合备用（胚性愈伤组织原生质体「5x个小1；叶

肉原生质体10-20x10s个/ml）.

2.融合小室先用融合液洗涤，以防原生质体聚集于电极两侧的角落里，然后取大约0.8ml

（FTC-03）或1.6ml（FTC-04）悬浮液于环形融合小槽，融合小室中央加几滴电融合液以保

持湿度，parafilm封口。

3.静置5To分钟，待大量原生质体沉淀后，在选择好的电融合参数下诱导融合，倒置显微镜

下观察融合过程。

4.融合后，静置15-20分钟以利于融合的原生质体圆球化。

5.轻轻吸出融合产物于10ml离心管中离心5-6分钟，用培养基悬浮至0.5-1x个/面.

六、原生质体培养

1.原生质体培养常采用液体浅层培养或固体包埋培养法。

2.原生质体培养在暗培养箱中进行，3-10天后原生质体再生细胞壁，并开始第一产次分裂。

3.等原生质体分裂形成多细胞团时（大约20-30天），开始降低培养基的渗透压，具体：1）各

加入5-10滴0.6MBH3和0.3MEME培养基，降压至0.45M

2）7-15天后再各加入5-10滴0.6MBH3和0.3MEME培养基，降压至0.3M

3）此后要及时稀释，降低细胞团的浓度，以利于胚状体发生，等细胞团长到一定大小时，

转入EME500上诱导胚状体的发生。

4）细胞团长出球形胚、心形胚后，及时转入EME1500培养基上，以利于胚状体的进一步

发育和转绿。

5）将发育到子叶胚时期的胚状体转入生芽培养基（MT+BA0.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA

0.1mg/L）中诱导丛生芽。

6）将丛生芽转入生根培养基（l/2MT+IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L）中

诱导生根或嫁接到试管中的砧木上。

7）再生苗的鉴定及移植于温棚中。

七、再生苗的鉴定方法

1形态学观察：叶形、气孔等。

2细胞学观察：海氏苏木精法

3分子标记鉴定：RAPD,AFLP,SSR,CAPS,RFLP等

八、相关培养基的配方

1.酶液混合液®帙参考,不同时间购买的酶活力不同，故浓度会有不同程度的变化）

40ml60ml

甘露醇（12.7%）5.10g7.68g

NaH2PO4.2H2O(0.011%)0.0044g0.0066g

CaCl2.2H2O(0.36%)0.144g0.216g

MES(0.12%)0.048g0.072g

CellulaseR-10(1.5%)0.6g0.9%

离析酶R-10(3%)1.2gL8g

2.EME培养基:MT+500mgME(麦芽提取物)

0.3EME:MT+500mgME/L+102.5g蔗糖/L

0.6EME:MT+500mgME/L+205.38g蔗糖/L

0.7EME:MT+500mgME/L+239.61g蔗糖/L

EME500:MT+500mgME/L+50g蔗糖/L+7g琼脂/L

EME1500:MT+1500mgME/L+50g蔗糖/L+7g琼脂/L

3.电融合液(100ml)

甘露醇(0.7M):12.74g

无水CaCl2(0.25mM):0.02775gPH值：5.8压灭菌

4.CPWstockI(100ml)CPWstockII(100ml)

KH2PO40.272g无水CaCb1.5g

KNO31.0g

MgSO4•7H2O2.5g

KI0.002g

CuSO4-5H2O0.00003g

CPW13(100ml)：CPWstockI1ml+CPWstockII1ml+13g甘露醇

CPW26(100ml):CPWstockI1ml+CPWstockII1ml+26g蔗糖

5.PEG融合液(100ml)

PEG(分子量6000)40g

H2O80ml

无水CaC120.97g

Glucose5.41g

定溶至100mL加热溶解，PH6.0,过滤灭菌

6.稀释液A：Glucose7.21g稀释液B:Glycine2.25g

(100ml)无水CaCl20.97gPH10.0过滤灭菌(KOH)

DMSO10ml

PH6.0过滤灭菌

使用前按9A:1B混合澄清。

7.BH3培养基（1升）

ME1.0g

蔗糖51.34g

甘露醇81.99g

谷氨酰胺3.1g

MgSO4•7H2。0.37g

KH2PO40.17g

KC11.5g

MT微量元素10ml

MTCa+MTvit+MT铁盐各10ml

水解酪蛋白0.25g

VitStockA2.0ml

VitStockB1.0ml

KIStock1.0ml

有机糖贮存液10ml

有机酸贮存液10m

椰子汁20ml

定容到1000mLpH5.8过滤灭菌

#KIstock75mg/100ml

(mg/lOOml)

#有机酸贮存液

丙酮酸钠盐200

柠檬酸400

苹果酸400

延胡索酸

400

#有机糖贮存液(mg/lOOml)

果糖2500

核糖2500

木糖2500

甘露醇2500

鼠李糖2500

纤维二糖2500

半乳糖2500

甘露醇2500

#VitstockA

Mg/lOOml

生物素

1

核黄素

10

叶酸

20

对氨基苹果酸

1

氯化胆碱

50

VC

100

Caloiumpantathenase

50

#VitStockBMg/lOOml

VitA

1

VitD3

1

VitB12

2

4、柑桔胚性愈伤组织和茎尖的超低温保存

胚性愈伤组织超低温保存

i.建立悬浮系

取大约3克胚性愈伤组织，在含500mg/L麦芽提取物和5g/L的谷胺酰胺的MT培

养基中，在摇床上进行悬浮培养。

2.玻璃化冻存

取悬浮培养8-10天的细胞系0.3mg左右，加入L8ml冷冻管，吸干培养基，然后加

入15mlpVS2玻璃化溶液，迅速颠倒然后，100g离心5min,弃上清液，用0.5mlPVS2重

新悬浮愈伤组织后处理3min,将冻存管迅速投入液氮，进行保存

3.解冻，

超低温保存一段时间后，将冻存管从液氮中取出，迅速投入40度水浴中化冻，无

菌状态下，弃去PVS2,加入L5mH.2M蔗糖溶液，颠倒混匀后，处理约lOmin,中间混

匀两次，弃去上清液

4.培养

将愈伤组织转入直径90mm的培养皿中(内含20mlMT固体基本培养基)的两层滤

纸上，过夜后，愈伤组织连同上层滤纸一起转入新的培养基上，在常规条件下或弱光下

培养。

茎尖的超低温保存

1.预培养

取在BAL5/L+IBA0.2mg/L+MT培养基上继代的试管苗，切取1mm长的茎尖，在

DMS05%的MT培养基上进行预培养3天，

2装载与脱水

无菌状态下切取2mm左右的顶端，放入60%PVS2中装载(loading)30分钟，后在0

度下用PVS2处理60分钟，将材料与PVS2一起转入冷冻管，放入自制纱布袋中，迅速

投入液氮。

3化冻与洗涤

将装有冷冻管的纱布袋从液氮中迅速取出，在40度水浴中化冻，然后在无菌状态

下吸出PVS2,加入L2M蔗糖+MT培养基，洗涤3-4次，每次10分钟。

4恢复培养

将材料转入原生芽培养基中暗培养，一天后换新鲜培养基，暗培养一周后，转入光

培养。

注：PVS2成份：甘油30%+乙二醇15%+DMSO15%+0.4M/L蔗糖+MT基本培养基。各

成份先灭菌后，再配制。

5、微嫁接

1.将枳等砧木种子无菌条件下接种在MT培养基上，暗培养箱中暗培养15-20天左右

（高度大约为4cm左右），选取粗壮的黄化苗用于嫁接。

2.将接穗芽留0.5-L0cm长，用手术刀片将其基部削成契形，与此同时，将试管中黄

化砧木在子叶下去掉主根，在子叶上L0-L5cm处去掉茎，并将其劈开。随后，将

接穗芽插入裂口。

3.整个操作过程均在无菌条件下进行，并且动作要快。

4.伤口愈合后，及时清除砧木的萌捏孽。

5.待伤口充分愈合后，并且接穗芽长出新叶后，移入温室。

6、花粉的制备和保存

1.花的采集：选取大气球期花蕾或刚刚开放的花，这样的材料出粉量大，花粉质量好。

2.散粉：材料采回后，取下花药，在27C左右的室内或烘箱内放置散粉。

3.保存：散粉完成后，在30℃左右的烘箱中放置6h左右，使花粉充分干燥，然后装

入青霉素小瓶或盛放胶卷的塑料瓶中，用PARAFILM封严密，然后放入-20C冰箱

中可长期保存。

第二部分

靖国初善

1、DNA提取和检测

实验准备工作：

1所用离心管、枪头要洗净、烘干（最好灭菌）。

2试剂配制：

1MTris-HCl（pH8.0）:称取Tris-Base121g,加入约800ml水在磁力搅拌器上搅拌，使其充分

溶解后加入浓盐酸调整pH至8.0后加水定溶至1000ml.灭菌后于室温保存。

0.5MEDTA（pH8.0）:称取EDTA-Na2盐187g加入约800ml水，在磁力搅拌器上边搅拌边加

入固体NaOH,当EDTA和NaOH均完全溶解，溶液变清时其pH值刚好达到8.0左右，再用pH试

纸略加调整即可，灭菌后于室温保存。

5.0MNaCl:称取NaCl300g,加入蒸储水约800ml于磁力搅拌器上充分搅拌，约5分钟后停

止搅拌，静止2~3分钟，倒出上清液，再加入100ml蒸储水重复前面的步骤，直到NaCl充分溶解

后定溶至1000ml.,灭菌后于室温保存。

酚：氯仿：异成醇（25：24：1）的配制：可参考《分子克隆》亦可按如下方法配制取重蒸酚100

ml,蒸储水50ml,8-羟基唾咛0.05g加入500ml玻璃烧杯于磁力搅拌器上边加热边搅拌，待酚达

到水饱和后加入18gTris-Base,等Tris-Base完全溶解后加入100ml氯仿：异戌醇（24：1）,搅拌

10~20分钟，静止约10分钟，除去上层水相后，装入棕色瓶，最后加入20ml0.1M的Tris-HCl保护

液于4℃保存。

DNABuffer的配制：

1MTris-HCl(pH8.0)100ml

0.5MEDTA(pH8.0):100ml

5.0MNaCl:300ml

H2O500ml

灭菌后于室温下保存3个月左右，用时按1.5%往Buffer中加入CTAB,在电炉上烧开；在通风

橱里加入1%的疏基乙醇（现配现用）。

DNA的提取：

1取2~5g叶片或愈伤组织，加入适量液氮研碎，转入预冷的50ml离心管，加入20mlDNA提取

缓冲液充分摇匀，于65℃水浴60~9。111吊，中途轻轻摇匀两次。

2加入15ml氯仿：异戍醇(24：1)轻轻摇匀10分钟，于BECKMAN离心机中4000rpm离心

15分钟。

3取上清液于另一50ml离心管加入10ml氯仿：异成醇(24：1)重复步骤2。

4吸上清液于一干净的50ml离心管，加入15ml冷冻的异丙醇，轻轻摇匀后于-20℃冷冻半小时，

4000rpm离心10分钟。弃上清液，加入5ml76%的乙醇(含10mM

NH4AC)浸泡5h(或过夜)，中途换乙醇2-3次。

5弃乙醇风干沉淀约半小时，加入3.0mlTE缓冲液(10mMTris-HClpH8.0；1mMEDTA,pH8.0),

20mRNaseA(lOmg/ml),37℃温浴过夜。

6溶液转入一10ml离心管，加入3.0ml苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)充分颠倒混匀，4000

rpm离心15min,吸上清液于另一10ml的离心管中，(可重复一次)。

7加入1ml5.0M的NaCl和3.0ml水饱和乙醛，充分混匀，4000rpm离心5min。

8弃乙酸，用20w枪头挡住离心管管口内侧，用力下压枪头，使枪头与管壁间形成一狭缝，让下

清液从缝中流入另一10nil离心管。

9加入5ml冷冻的异丙醇，轻轻摇匀后于-20℃冷冻半小时，4000rpm离心10分钟。弃上清液，

加入3ml70%的乙醇浸泡4~6h(或过夜)，中途换乙醇2-3次。风干乙醇，加入500M1TE溶解，

或浸在乙醇中长期保存。

DNA检测

1取DNA原液15gl稀释至3.0ml,用UV-1601型紫外分光光度计测定230nm、260nm及280nm

的吸光值。

局质量的DNA要求：A26O/A23O>2.O；1.7<A260/A28O<1.9

2将DNA原液适当稀释后，用1XTAE,0.8%琼脂糖凝胶2V/cm电泳1h进行质量检测。

3向一定量的DNA中加入限制性内切酶EcoRI至4-5U/ugDNA,37℃消化过夜，用0.5XTBE,

0.8%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳3h进行检测。

CTAB法微量提取DNA

1.药品的配制：

CTAB提取液：

(1)lOOmMTris-HCl(PH8.0),1.5MNaCl,50mMEDTA(PH8.0)

(2)1%PVP,2%CTAB

(3)取少许⑴加到(2)中，搅拌成糊状,后加(1)至足量,65℃水浴充分溶解备用。使用前要在65℃

温浴一会儿，然后加入-4%筑基乙醇,混均匀。

苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）：重蒸酚65℃水浴溶解，在烧杯中加入80ml温热的蒸储

水，加入少许8-羟基唾咻，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：异戊醇（24：1）,

加入20克TrisBase,磁力搅拌器上搅拌L5h左右至停止搅拌后很快分层，然后装入棕色瓶

中，4℃冰箱中储存备用。

2.材料的采取与保存：

在超净工作台上，取试管苗叶片，放入无菌的L5ml离心管中，置于冰盒中，然后把装有叶片

的离心管一起装在纱布袋中，置液氮中冷冻10分钟，取出后置于一70℃冰箱中可长期保存，需

要用时，取出置于冰盒中。

3.DNA的粗提

在装有叶片的离心管中加入石英砂少许（约0.07克），用事先灭过菌的一20℃冰箱中预冷的尖头

玻棒将材料戳到底部，先压后研磨，研细后加入600ulCTAB提取液，再继续研磨一会儿使其

悬浮均匀，然后在65℃水浴锅中温浴60-90分钟，隔30分钟取出上下轻轻颠倒几次，水浴之

后，加入700ul苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）,,上下晃动10分钟以上，其间置于37℃水

浴锅中温浴一会（冬季），使之充分混匀，然后10000-12000rpm离心5-10分钟，吸取上清液转

至另一离心管中，加入60ul5MNaCL再加入-20℃冰冻无水乙醇1mL轻轻颠倒数次，混合

均匀后冰冻30分钟沉淀DNA,然后8000-10000rpm离心5分钟，弃上清液，加入1ml70%酒精

浸泡2小时或过夜，8000rpm离心5分钟,弃酒精之后在工作台上风干DNA,注意不要过干，否

则会使以后溶解困难。

4.DNA的纯化：

向风干后的DNA中加入500ulIxTE,37℃水浴15-30分钟至DNA完全溶解，然后加入700ul

苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）,上下颠倒离心管约10分钟，至充分混匀，其间置于37℃

水浴锅中温浴一会（冬季）；10000-12000rpm离心5分钟，吸取上层液至另一离心管中，加入

700ul氯仿:异戊醇（24：1）,颠倒10分钟（方法同上）,10000-12000rpm离心5分钟，吸取

上层液至另一离心管中，加入60ul5MNaCL再加入1ml冷冻的无水乙醇，轻轻颠倒，然后

在-20℃冰箱中置30分钟沉淀DNA,8000-10000rpm离心2-3分钟，使DNA分散状紧贴在管壁

上，弃酒精，加70%酒精1ml浸泡,2小时后换一次,后浸泡过夜，8000rpm离心3分钟后弃酒精,

风干，加50-100ullxTE充分溶解，然后每管加5ul5mg/mlRnase,37℃水浴6小时或过夜。

5.DNA检测：

（1）0.8%琼脂糖凝胶电泳30-60分钟：

TAE100mLEB30ul,样品3-5ul,电压90V,

观察A：DNA是否跑出，带型是否整齐划一；B：RNA是否除尽

(2)分光光度计检测D260/D28。的比值：在L8-2.0的范围内认为纯度较高上述方法提取的DNA

比值在1.65-1.95之间。浓度=30000x0D懒(DNA样品为5ul时)。

2、SouthernbIotting

实验前准备工作：

5XTBE溶液配制：

约800ml蒸储水中加入Tris-base54g,硼酸27.5g,充分溶解后加入0.5MEDTA(pH:8.0)定

溶到1000ml,于室温下短期存放。

1将DNA稀释至500ng/u1.,并电泳检测。欲转到同一张膜上的DNA浓度是否一致，若亮度差

异太大，则应进行进一步的浓度校正。

2在200口1微量离心管中加入25U1DNA样品，6.5口1限制性内切酶(MBI,10U/ul)和

8口1相应的buffer,上加一滴矿物油覆盖，在旋涡器上混匀并稍微离心后放于37℃水浴16-18

小时。

3取5口酶切DNA样品于0.8%的琼脂糖凝胶上检测酶是否充分。

4于DYY-II134A型电泳槽中制备3/4块0.8%的IXTBE琼脂糖凝胶需要胶260~300ml。

5向每个样品中加入5口1澳酚蓝上样缓冲液，混匀后稍微离心后点样。

(样品多时点样要迅速，以防先点的样品DNA在胶中扩散；点样时我不主张加混有二甲苯菁的上

样缓冲液，因为它影响染色后的照相效果；点样时要注意Marker最好采用不对称点样，以便在

X-光片上确定样品顺序，同时Marker的点样孔使用其配套的上样缓冲液，其中有二甲苯菁以便

确定凝胶的正反面。)

6点样后在1XTBE电泳缓冲液中250V高压电泳10分钟后把电压调至40V电泳12-14小时，

这时澳酚蓝已离开点样孔10cm左右。

7将胶置于装有EB的瓷盘中染色15-20分钟，在紫外灯下用塑料板切除多余的凝胶，凝胶点样

孔一端及两侧应留出2mm左右，澳酚蓝一端要保留澳酚蓝作为变性处理的显色指示。(这一步

非常重要,如果样品酶切不充分、电泳泳道不直、样品间相互弥散或样品间DNA量差异太大都不能再往下做,

要找出原因后重新再做。最好把待Blot的凝胶规格控制在其宽度或长度之一为10cm,因为我们使用的尼龙

膜的规格为30cmX3m这样不至于浪费昂贵的尼龙膜,同时酶切的DNAsmear长度达到10cm时各片段也能

得到很好的分离。)

SouthernBlottingontoHybond-N+NylonMembrane

Hybond-N+NylonMembrane,0.45闵poresize,20cmx3mrollsavailablefromAmersham(Cat.#RPN.

203B)

实验前准备工作：

酸变性液和碱变性液的配制:

Depurinationsolution:

11mlHCl

989mldistilledwater

Mix.storeatroomtemperatureforupto1month.

Denaturationbuffer

87.66gNaCl

20gNaOH

Addapproximately800mlofdistilledwater.Mixtodissolve.Makeuptoafinalvolume

of1000ml.Storeatroomtemperatureforupto3month.

1将切好的胶夹在两块软塑料板之间，小心翻转180度，使胶底面向上。

2将胶放入20X30cm的瓷盘中加入500ml脱喋吟溶液（酸变性液），偶尔轻轻振荡至澳酚蓝完

全变成黄色，大约需要15~30分钟。

3用软塑料板小心将胶转入另一洗净的瓷盘，用水漂洗凝胶2~3次，将水倒尽，加入碱变性液500

ml偶尔轻轻振荡至澳酚蓝完全恢复到原来的蓝色（大约需要20~30分钟）。

4洗净一块15X25cm的玻璃板和4块旧的X光片条；切两块20X30cm的滤纸。

5取一洗净的20x30cm瓷盘，把干净玻板横放于盘上，把切好的滤纸在碱变性液中浸湿，平整地

铺在玻板上，使纸的两端自然下垂到盘中，用玻棒赶尽玻板与纸之间的气包后再按同样的方法

铺上第二层滤纸，往盘中加入500ml碱变性液。

6经碱变性处理好的胶用软塑料板小心转移到滤纸桥上，用X光片条把胶的四周约0.5cm宽与滤

纸隔开，使转膜液必须经过胶进入吸水纸，使胶上的DNA能充分印迹到尼龙膜上。

7用尺子量好胶的尺寸后，用锋利的剪刀剪取同样大小的尼龙膜，用铅笔在膜的一角做好标记如

点样顺序、使用的内切酶，膜的编号、转膜日期等，将膜用蒸储水浸湿后放于胶上，使膜与胶

完全重合，用玻棒赶尽膜与胶之间的气泡（膜一旦放到胶上就不能再移动）。

8切两块与膜同样大小的滤纸，用水浸湿后覆于膜上，赶尽气包；在上面放10cm厚的吸水纸，

上面放一小玻板，板上加一500g左右的重物。

94~6小时后换一次吸水纸，之后隔8~10小时再换一次吸水纸，印迹18~24小时胶上的DNA一

般都能充分转移至尼龙膜上。

10取出尼龙膜，用滤纸包好放入80℃烘箱烘烤2小时后用保鲜膜包好放于4℃保存。

Southern杂交

实验准备工作：

试剂配制：

50xDenhardfssolution

1.0gBovineserumalbumin（BSA,牛血清蛋白）

1.0gFicollMT400（聚蔗糖）

1.0gPolyvinylpyrrolidone（PVP）

Addapproximately50mlofdistilledwater.Mixtodissolve.Makeuptoafinalvolumeof

100ml.Storeat-20℃forupto3months.

25xSSC

219gNaCl

110gTri-sodiumcitrate（柠檬酸三钠）

Addapproximately800mlofdistilledwater.Mixtodissolve.CheckthepHis7~8.Makeup

toafinalvolumeof1000ml.Storeatroomtemperatureforupto3months.

P/HStocksolution

165mlIMTris-8.0

66ml0.5MEDTA-8.0

660ml25xSSC

Adddistilledwatertomakeuptoafinalvolumeof1000ml.StoreatRTforupto3months.

TEbuffer

1.21gTrizmabase

0.372gEDTA,sodiumsalt

Addapproximately800mlofdistilledwater.Mixtodissolve.AdjusttopH8.0with

concentratedhydrochloricacid.Makeuptoafinalvolumeof1000ml.Storeatroom

temperatureforupto3months.

第一天早上做好以下步骤：

1将所有欲杂交的尼龙膜用2XSSC浸泡10-30分钟。

2打开同位素室的空调，把杂交管放入杂交炉，并将杂交炉调至65℃预热，用塑料桌布铺好防护

罩内的台面，桌布上再铺一层滤纸，从冰箱中取出装同位素的铅罐，拧松罐盖，使同位素在室

温下解冻。

3打开一楼的电炉，用500ml玻璃杯烧2/3杯开水。

4将配好的10mg/ml鲜鱼精DNA在开水中变性10分钟后立即放入冰中冷确至少10分钟。

5按15ml/200cm2配制预杂交液，并预热至65℃,带入同位素室。

STOCK105075100125150175200250

ddH2O6.834516885102119136170

50xDenhardfs0.21.01.52.02.53.03.54.05.0

10%SDS0.21.01.52.02.53.03.54.05.0

P/HStock2.7013.520.252733.7540.547.255467.5

10%稣鱼精DNA(ml)0.21.01.52.02.53.03.54.05.0

6按计划把尼龙膜放入各杂交管，加入预杂交液于65℃预杂交6小时。放膜时要注意：几张膜叠

放在一起时要把膜浸有在2XSSC或蒸储水中，赶尽膜与膜之间的气泡后把几张膜同时放入杂

交管，并用玻棒赶尽膜与管壁之间的气泡，最后加入预杂交液，盖好管盖。

7按下表配制探针标记体系。

探针标记体系（按顺序进行）：

ddH2O(ul)20

Probe(50ng/u1)(u1)3.0

X/HindIII(Ing/u1)(u1)1.5

2.0ng/ulPrimer(u1)20.0

2.0mMdNTP(A,T,G)(ul)8.0

10XKlenowBuffer(P1)6.0

8100℃煮10分钟，放入冰中冷确10分钟

Klenow大片段酶(SABC)5U

32P-dCTP(uCi)30

以上体系可杂交约400cm2的杂交膜，根据杂交膜的面积，按比例增减体系即可。

9从37℃水浴锅中取1.5升37℃温水，倒入同位素室的保温筒。把放探针的小冰盒带入同位素室,

加入同位素并用枪头反复吸几次使探针标记体系充分混匀，插入一块小泡沫块后放入保温筒，

使装探针的小离心管漂在水面上，37℃保温6小时。

10预杂交半小时左右，要检查杂交管盖是否盖好。

第一天下午3:30左右：

11配制杂交液按10~20ml/管配制，将杂交液预热至65℃o

杂交液的配制：(按顺序加入,10ml/200cm2膜)

总体积(ml)10152025303540455060100

硫酸葡聚糖(g)1.01.52.02.53.03.54.04.55.06.010.0

ddH2O(ml)6.810.213.617.020.423.827.230.634.040.868.0

50XDen(ml)0.20.30.40.50.60.70.80.91.01.22.0

10%SDS(ml)0.20.30.40.50.60.70.80.91.01.22.0

P/HStock(ml)2.74.55.46.88.19.511.012.213.516.227.0

10%鲜鱼精DNA(ml)0.50.751.01.251.51.752.02.252.53.05.0

配制：

(1)+(2)+(3)+(4)+(5)加热至65℃充分溶解

"混匀后加入杂交管

10%鳞鱼精DNA于100℃煮10分钟，冰上冷确10分钟

12倒尽杂交管中的预杂交液后加入杂交液。

13打开杂交室的电炉，烧300~500ml开水，待水开后将电炉恒温在90℃左右。

14从保温筒中取出标记的探针，加入20口1终止液和200口1的TE后在开水杯中变性处理10分

钟；再放入冰中冷确10分钟。

15在防护罩内小心将探针加入到杂交管中，适当拧紧管盖65℃杂交16~20小时。

16过20分钟左右要认真检查一下杂交炉看管盖是否盖好，严防同位素泄漏。

17到晚上下班时要到同位素室检查一下杂交炉的运转是否正常。

第二天上午：

18配制洗膜液

低严谨1升(2XSSC+0.1%SDS)：

STOCKVOLUME(ml)

25XSSC80

10%SDS10

dH2O