重组DNA技术的基本工具课件高二下学期生物人教版（2019）选择性必修3

第3章

基因工程选择性必修3生物技术与工程科技探索之路：基因工程的诞生和发展第1节：重组DNA技术的基本工具第2节：基因工程的基本操作程序第3节：基因工程的应用第4节：蛋白质工程的原理和应用抗虫棉的培育普通棉花会受到棉铃虫侵袭，造成减产甚至绝收。施用农药不仅提高生产成本，还会对农产品和环境造成污染。由于普通棉花中没有抗虫基因，而其他生物虽然有抗虫基因，但是与棉花存在生殖隔离，因此不能通过杂交育种培育出抗虫棉。普通棉花棉铃虫抗虫棉Bt抗虫蛋白基因导入（目的基因)(受体细胞)Bt抗虫蛋白基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。生物体外(DNA)分子基因重组定向基因工程（重组DNA技术）1.概念：1.DNA的基本组成单位相同(都是四种脱氧核苷酸)2.DNA都遵循碱基互补配对原则3.双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构表达的理论基础1.基因是控制生物性状的结构与功能单位2.遗传信息传递都遵循中心法则3.生物界几乎共用一套遗传密码重组DNARNA蛋白质性状复制转录翻译控制重组与复制的理论基础2.理论基础：1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至19666年，64个密码子均被破译成功。1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性核酸内切酶（简称限制酶）1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。科技探索之路

基因工程的发展历程在培育转基因生物时，既要在体外对含有所需基因的DNA分子“切割”、改造和“拼接”；又要将重组DNA分子导入生物体内，并使其表达。DNA双螺旋的直径只有2nm，对如此微小的分子进行操作，是非常精细的工作。科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？3.1重组DNA技术的基本工具剪切拼接导入表达DNA重组技术的基本工具(至少3种“分子工具”)工具酶准确切割DNA分子的”分子手术刀”将DNA片段再连接起来的”分子缝合针”限制性内切核酸酶DNA连接酶将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的”分子运输车”载体一、限制性内切核酸酶（限制酶）---“分子手术刀”阅读教材P70-71，思考并回答下列问题：

1.限制酶的来源？种类？特点？识别序列长度？切割结果？2.你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？3.为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？主要从原核生物中分离纯化能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，（识别序列）并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。（切割位点）1.来源一、限制性内切核酸酶---“分子手术刀”GATTCGAATTC3'3'5'5'磷酸二酯键2.作用1'2'3'4'5'1'2'3'4'5'A专一性的体现EcoRⅠ属名Escherichia首字母种加词coli头两个字母R型菌株从中分离的第一个限制酶例如：流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:HindIHindIIHindIII限制酶名字的由来EcoRⅠ：大肠杆菌（Escherichia

coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；SmaⅠ：粘质沙雷氏菌（Serratia

marcescens）中分离出的第一个限制酶。P72资料卡EcoRⅠ一G-A-A-T-T-C一一C-T-T-A-A-G一HindⅢ一A-A-G-C-T-T一一T-T-C-G-A-A一SmaⅠ一G-G-G-C-C-C一一C-C-C-G-G-G一TaqⅠ一T-C-G-A一一A-G-C-T一3.特点(1)每一种限制酶都有各自特异性的识别序列①大多数限制酶：识别序列由6个核苷酸组成，如，限制酶EcoRⅠ、SmaⅠ②少数限制酶：识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。(2)限制酶的识别序列具有180°旋转对称的回文结构。识别序列5'5'5'5'5'5'5'5'3'3'3'3'3'3'3'3'即两条链从5'→3'的核苷酸序列相同。如限制酶EcoRⅠ识别序列上边链从5'一GAATTC一3'

下边链从5'一GAATTC一3'EcoRI识别序列为GAATTC切割位点为GA之间黏性末端切割部位：识别序列的中轴线两侧(1)产生黏性末端GCAATTTATACG5'3'3'5'GCTTAAAATTCG4.作用结果SmaI识别序列为CCCGGG切割位点为CG之间平末端CGCCGGGCGCGC5'3'3'5'CGCCGGGCGCGC(2)产生平末端切割部位：识别序列的中轴线处3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'断开断开同尾酶写出下列限制酶切割形成的DNA片段末端，并思考，不同的限制酶切割DNA分子，产生的末端一定不同吗？同尾酶：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同的黏性末端的限制酶。P71，思考：你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具，当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。P74想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？该生物的DNA分子不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样尽管细菌含有某种限制酶，它自身的DNA也不会被切断，并且可以防止外源DNA入侵。限制酶切割特定核苷酸序列的特定部位的磷酸二酯键怎么应用呢？--ATGCATGCAT……CCAGAATTCCCA……TCCCTAAGAATTCCCATCCCAGATG……CATGCATCCATGC-----TACGTACGTA……GGTCTTAAGGGT……AGGGATTCTTAAGGGTAGGGTCTAC……GTACGTAGGTACG---Bt抗虫蛋白基因假定苏云金杆菌DNA片段部分序列如下3'5'5'3'可以用EcoRⅠ限制酶将Bt蛋白基因从DNA片段中切割下来！你知道切割结果是怎样的？一限制性内切核酸酶—“分子手术刀”Bt抗虫蛋白基因苏云金杆菌DNA片段部分序列3'5'5'3'Bt抗虫蛋白基因苏云金杆菌DNA片段部分序列3'5'5'3'5'3'3'5'3'5'5'3'思考：1.要想获得某个目的基因，必须要用限制酶对DNA片段切割几次？可产生几个黏性(平)末端？2次，产生4个黏性(平)末端。2.如果把两种来源不同的DNA用同种限制酶来切割，会怎样？会产生相同的黏性(平)末端G

AA

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G用同种限制酶切割(EcoRⅠ)把两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？思考：

缺口怎么办？G

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G二、DNA连接酶——“分子缝合针”将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键GCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG1.作用种类来源大肠杆菌T4噬菌体作用区别E.coliDNA连接酶T4DNA连接酶连接黏性末端或平末端（都能将双链DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键）2.种类E.coliDNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于

T4DNA连接酶。二、DNA连接酶——“分子缝合针”【特别提醒】用不同的限制酶进行切割，只要切割后产生的黏性末端相同，就可用DNA连接酶连接起来。5'5'5'5'3'3'3'3'5'5'5'5'3'3'5'5'3'3'DNA连接酶DNA聚合酶相同作用实质化学本质不同点模板作用对象作用结果用途都能催化形成磷酸二酯键蛋白质 不需要需要DNA的一条链作模板形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制在两个DNA片段间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已有核酸片段3’末端的羟基，形成磷酸二酯键DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？P72旁栏思考与DNA相关的五种酶的比较酶1酶2酶4酶3酶5酶1:限制酶酶2:DNA连接酶酶3:解旋酶酶4:DNA聚合酶酶5:DNA水解酶（DNA酶）比较与DNA相关的几种酶名称作用部位作用结果限制酶

DNA连接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶磷酸二酯键碱基对之间的氢键将DNA切成两个片段磷酸二酯键将两个DNA片段连接为一个DNA分子磷酸二酯键将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端磷酸二酯键将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸将双链DNA分子局部解旋为单链三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”阅读教材“基因进入受体细胞的载体——分子运输车”的内容，思考并回答下列问题：1.载体要与外源基因连接，需要具备什么条件?2.要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件?3.我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件?拟核质粒大肠杆菌细胞氨苄青霉素抗性基因目的基因插入位点复制原点大肠杆菌及质粒结构模式图三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”将外源基因（目的基因）送入受体细胞1.作用(1)定义：拟核质粒大肠杆菌细胞氨苄青霉素抗性基因目的基因插入位点复制原点2.种类质粒、动植物病毒、噬菌体3.常用载体质粒（最常用）一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。特点原因(2)结构特点供外源DNA片段(目的基因)插入其中使目的基因能够在受体细胞中自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制便于重组DNA分子的筛选标记基因①抗生素的抗性基因②荧光蛋白基因有一个至多个限制酶切割位点复制原点具标记基因AmpR如:绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)如:氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)复制原点载体携带目的基因导入受体细胞的成功率不高，因此需要筛选出导入目的基因的受体细胞。氨苄青霉素抗性基因导入未导入未导入含氨苄青霉素的培养基存活并增殖死亡目的基因质粒含目的基因的DNA片段重组质粒在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行人工改造的。受体细胞导入目的基因思考•讨论重组DNA分子请利用两张纸，按照P73相关要求完成操作，并完成讨论：1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？

一TATCGTACGATAGGTACTTAA一ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC一

GCCGTATG一一TCCTAG一AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC一GGTATG一GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG5′3′5′3′5′3′5′3′重组DNA分子如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？讨论思考：形成一个重组质粒会形成_____个磷酸酯键？4限制酶DNA连接酶载体①有一个至多个限制酶切割位点；②有复制原点；③有特殊的标记基因；④对受体细胞无毒害；质粒、噬菌体、动植物病毒作为载体的条件种类：磷酸二酯键来源

：主要是原核生物作用：作用部位：识别DNA特定核苷酸序列，且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开结果：形成黏性末端或平末端连接部位：磷酸二酯键种类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶作用：

把两个DNA片段连接起来，恢复磷酸二酯键

DNA重组技术的基本工具课堂小结练习与应用1.

DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（

）A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键B.

能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键C.

能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键D.

只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端C2.在重组