《植物组织培养》课件 项目2 培养基的配制

任务一母液的配制任务二培养基的制备模块二培养基的配制项目二

培养基的配制任务一母液的配制知识目标一般掌握培养基的种类、特点。掌握基本培养基的配方。一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量。123技能目标掌握基本培养基的配制的配方。掌握培养基母液的配制方法和步骤。12任务讲解第一节培养基的种类第二节培养基的和成分第三节培养基的配制流程第一节培养基的种类

培养基是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同，只有满足了它们各自的特殊要求，它们才能很好地生长。

因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。第一节培养基的种类

培养基有几十种，根据不同植物和部位选用不同的培养基。历史沿革：

（1）培养基的产生最早是Knop(1681)，以后根据不同目的进行改良产生了多种培养基。（2）White培养基在40年代用得较多，现在还常用。（3）而到60和70年代则大多采用MS等高浓度培养基，可以保证培养材料对营养的需要，并能生长快、分化快，且由于浓度高，在配制、消毒过程中某些成分有些出入，也不致影响培养基的离子平衡。一、培养基的种类第一节培养基的种类

培养基的名称，多数以发明人的名字来命名，如White培养基，Murashige和Skoog培养基(简称MS培养基)。目前国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基及特点如下：

(1)MS培养基它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。第一节培养基的种类(2)B5培养基是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。

(3)White培养基是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基。其特点是无机机盐数量较低，适于生根培养。第一节培养基的种类

（4）N6培养基是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。第二节培养基的成分

水

无机盐：大量元素

微量元素

有机化合物：碳源

维生素

氨基酸

植物激素

天然提取物

琼脂

其它：PH值、活性炭、抗生素、抗酚类物质污染的添加剂、生长抑制剂、染色剂……视频2-1培养基成分1.水

1.水水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质，大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。2.无机元素

元素名称添加形式

NKNO3,NH4NO3

大量PKH2PO4NaH2PO4

元素KKClKNO3(≥0.5mmol/L)CaCaCl2

·2H2OMgMg2SO4

·7H2OSMg2SO4·

7H2OFeFeNa2-EDTA

微量BH3BO3

元素MnMnSO4(≤0.5mmol/L)CuCuSO4MoNa2MoO4·2H2OClCaCl2

·2H2O2.无机元素2.无机元素

总之，植物必需营养元素可组成结构物质，也可是具有生理活性的物质，如酶、辅酶以及作为酶的活化剂，参与活跃的新陈代谢。此外，在维持离子浓度平衡、胶体稳定、电荷平衡等电化学方面起着重要作用。当某些营养元素供应不足时，愈伤组织表现出一定的缺素症状。2.无机元素3.有机化合物有机物维生素肌醇氨基酸天然复合物椰乳香蕉泥水解酪蛋白碳水化合物马铃薯其它3.有机化合物a.碳水化合物

选用种类：蔗糖（或葡萄糖、果糖）等。蔗糖浓度：2－3%，胚培养为4－15%

高压灭菌部分糖会分解。大生产时可用白砂糖。a.碳水化合物b.维生素种类：

VB1、VB6、VB3、Vc浓度：0.1－1.0mg/L

作用：

VB1[盐酸硫胺素]促愈伤组织产生，提高活力。

VB6[盐酸吡哆醇]促根生长。

VB3[烟酸]与代谢和胚发育有关。

Vc[抗坏血酸]防组织褐变。b.维生素c.肌醇

促进愈伤组织生长、胚状体和芽的形成。对组织细胞繁殖、分化的促进作用。浓度100mg/L。促进糖类的相互转化，提高活性物质的活性。c.肌醇d.氨基酸

常用：甘氨酸水解酪蛋白[CH]

水解乳蛋白[LH]等。

作用：是蛋白质的组分；

促进器官增殖；

可作有机氮源。d.氨基酸e.天然复合物椰乳：促愈伤组织和细胞培养，用量10－20%;香蕉泥：对PH值缓冲大，用量150－200ml/L;马铃薯：对PH值缓冲大，用量150－200g/L;水解酪蛋白：浓度100－200mg/L.其他：酵母提取液[YE]、苹果汁、番茄汁等。e.天然复合物4.植物激素（1）生长素类

A.种类

IAA

NAA

IBA

2,4－DB.作用诱导愈伤组织和根分化，促进细胞分裂和伸长。

C.浓度

0.05～5mg/mL（2）赤霉素（GA）

注：不耐热

A.种类：GA3B.作用：促茎伸长，促胚发育成植株；打破休眠；一般在器官形成后加入。4.植物激素4.植物激素（3）细胞分裂素（CTK）

A.种类：6－BA

KT

ZTB.作用：诱导不定芽分化和茎、苗增殖。

C.浓度：0.05－10mg/mL4.植物激素5.培养体支持材料1.琼脂

A.用量6－10g/LB.新买应试凝固力

C.使用优缺点2.其它玻璃纤维滤纸桥海绵蛭石等5.培养体支持材料6.辅助性物质A.常用种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等B.用量：5～20%C.注意：抗生素对组织生长有抑制作用，使用要慎重（1）抗生素6.辅助性物质6.辅助性物质常用抗氧化剂及使用：半胱氨酸VC（50～200mg/L液洗涤外植体伤口表面）。（2）抗氧化物6.辅助性物质6.辅助性物质6.辅助性物质（3）活性炭A.作用：具吸附作用；茎尖初代培养可防褐化；促进新梢增殖（浓度0.1～0.2%）；促进生根；防止组培苗玻璃化（浓度0.3%）。利于胚胎培养。B.常用浓度：0.5～10g/L

C.注意：活性炭具副作用。第三节母液的配制(一)母液配制流程图

称量

母液分装确定培养基溶解

定容

贴标签保存于冰箱MS培养基母液的配制1MS培养基母液配制的配方母液种类成分标准量（mg）扩大倍数称取量（mg）母液体积（ML）用量/L大量元素NH4NO316505082.5100020KNO3190090MgSO4·7H2O37018.5KH2PO41708.5钙盐CaCI2·2H2O4405022100020铁盐FeSO4•7H2O27.81002.78100010MS培养基母液的配制2MS培养基母液配制的配方母液种类成分标准量（mg）扩大倍数称取量（mg）母液体积（ML）用量/L微量元素MnSO4·4H2O22.31002.23100010ZnSO4·7H2O8.60.86CoCl2·6H2O0.0250.0025CuSO45H2O0.0250.0025Na2MOO4·2H2O0.250.025H3BO36.20.62KI0.830.083MS培养基母液的配制3MS培养基母液配制的配方母液种类成分标准量（mg）扩大倍数称取量（mg）母液体积（mL）用量/L有机物烟酸（VB3）0.52000.110005盐酸吡哆醇（VB6）0.50.1盐酸硫胺素（vB1）0.10.02甘氨酸2.00.4肌醇100药品称量视频天平预置全显示清零称药视频2-2药品称量Fe盐母液的配制

Fe盐母液的配制硫酸亚铁和EDTA-Na分别溶解后，冷却后将Fe盐倒入EDTA-Na中[反之易沉淀]，然后定容。激素母液的配制激素母液浓度：

0.5-1mg/ml，1次配成100ml激素溶解：

IAA、IBA、GA、ZT先溶95%酒精再定容

NAA先溶于热水或95%酒精再加水；

2,4-D先溶于1mol/LNaOH或酒精再加水；

KT、BA先溶于1mol/LHCl再加水。任务小结

目前国际上流行的培养基有：MS培养基、B5培养基、White培养基、N6培养基；培养基的成分：水、无机盐、有机化合物、天然提取物、琼脂、活性炭、抗生素等。

母液配制流程图为：确定培养基称量溶解定容母液分装贴标签保存于冰箱123思考练习培养基的种类、特点有哪些？简述培养基的组成成分、作用和适宜的剂量。简述培养基母液的配制方法和步骤。123任务一母液的配制任务二培养基的制备模块二培养基的配制项目二

培养基的配制任务二培养基的配制知识目标培养基配制方法和步骤；一般掌握培养基的筛选办法。12技能目标熟练掌握培养基配制方法和步骤；熟练掌握培养基的灭菌方法12任务讲解第一节培养基配制流程第二节培养基的选择第一节培养基配制流程分装调PH值接种确定配方移母液定容培养基熬制灭菌称取蔗糖、琼脂扎口水培养基配制流程图1.培养基熬制1.将2/3水倒入铝锅中，近开锅时加入称好的蔗糖和琼脂，边煮边搅拌，防止糊底。2.用旺火煮开，再用文火加热，直至琼脂全部融化。3.将量好的培养基母液倒入铝锅中，搅拌均匀。1.培养基熬制培养基熬制视频视频2-3培养基熬制母液的量取视频视频2-4母液的量取母液的定容

2.定容培养基做好后在调整pH值之前，应对培养基进行定容，考虑培养基本身处于热态并还需要灭菌等要损失部分，因此定容时需要多出近1/10。视频2-5定容母液调pH3.调pH值用0.1MNaOH或HCl调PH值为5.8。在培养基配方不大变动的情况下可用经验法。可以将连续三次测定所加入的酸或碱液的平均值作为以后调整的用量值。调后注意一定要摇动均匀。视频2-6调整PH值4.激素的添加在激素的水平变化较小时，尤其在配制多种培养基时，激素可以在pH值调整后添加。要求严格时应添加激素后再调整pH值（因激素母液可能影响培养基的pH值）。激素的添加培养基分装5.培养基分装趁热分装，100ml的三角瓶约装入30～40ml,30瓶/L。视频2-7培养基分装培养基的扎口与灭菌

6.扎口与灭菌要求封口松紧适宜，系活扣，便于接种操作。培养基应及时灭菌，防止变质。视频2-8培养基灭菌任务小结

培养基配制的顺序为：倒水加热称取琼脂入锅加热熔解加入蔗糖待琼脂溶化后加母液搅拌均匀然后加激素。培养基制作视频视频2-9培养基母液配制

0.5mg/ml的NAA配制方法，要求配100ml。某培养基为MS+BA2mg/l+NAA0.2mg/l.

问：如果做2升，应加激素各为多少毫升？（BA母液为0.5mg/ml，NAA为0.5mg/ml）。思考练习12第二节培养基的选择

在建立一个新的实验体系时，为了能研制出一种适合的培养基，最好先由一种已被广泛使用的基本培养基(如MS培养基或B5培养基)开始。当通过一系列的实验，对这种培养基做了某些定性和定量的小变动之后，即有可能得到一种能满足实验需要的新培养基，选择最佳培养基。常用试验方法主要有单因子试验、多因子试验及广谱实验等。单因子试验

在单因子试验中，由于培养基中其他成分都维持在一般水平上，所以只变动一个因子，就可以找出这一因子对试验的影响和影响的程度。例如MS基本培养基的其他成分和用量都不变，只变动NAA用量对某一培养物生根的影响，这种只研究一个因素的试验就是单因子试验。单因子试验

试验中要求对照组与试验组中的试验个体，即植物组织块或其他培养物，必须在遗传性、生理状态、前培养条件等方面，尽可能完全一致。以保证试验结果是来源于试验因子，而不是由于试验材料的不一致导致的。试验中各处理一般都要设有一定的重复，以取得可靠的试验结果。随试验规模和要求不同，大多每个项目要有4～10瓶，每瓶至少3块培养物或3丛小幼苗。多因子试验

对培养基中两个或两个以上因素进行研究的试验称为多因子实验，试验可采用完全试验方案，也可选用正交设计方案，完全试验方案具有均衡完全的特点，各个因子的每个水平都相互搭配，构成了所有可能的处理组合，如研究NAA和6－BA的最佳浓度组合，每个因子各设5个浓度水平(0，0.5，2.5，5，10mg／L)，这两种因子各种浓度的所有组合，就构成了一个具有25项处理的试验见下表。多因子试验2种激素5种浓度的实验组合6-BA(mg/L）00.52.5510NAA012345(mg/L)0.56789102.5111213141551617181920102122232425广谱实验法

在广谱实验法中，把培养基中所有组分分为4大类：无机盐、有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生长素、细胞分裂素。对每一类物质选定低(L)、中(M)、和高(H)3个浓度。4类物质各3种浓度的自由组合即构成了一项包括81个处理的实验。在这81个处理中最好的一个可用4个字母表示。例如，一个