DB22-T2984-2019-鹿粘膜病双抗夹心ELISA检测方法-吉林省

ICS11.220DB22B41吉林省地方标准DB22/T2984—2019鹿粘膜病双抗夹心ELISA检测方法DoubleantibodysandwichELISAmethodforthedetectionofdeermucosaldisease吉林省市场监督管理厅发布DB22/T2984—2019前言本标准按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015给出的规则起草。本本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。本标准起草单位：长春市乾艺生物科技研究所、长春市农业科学院。本标准主要起草人：田来明、赵春梅、张宇、李男、田桂华、申雨弘、崔鹤馨、权心娇、胡桂英、付晓霞、王雨千。IDB22/T2984—2019鹿粘膜病双抗夹心ELISA检测方法警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，具体防护措施及要求按照GB19489执行。1范围本标准规定了鹿粘膜病双抗夹心ELISA检测方法的术语和定义、试剂、仪器设备、样品处理、操作步骤和结果判定。本标准适用于鹿粘膜病病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19489实验室生物安全通用要求由病毒性腹泻病毒（mucosaldiseasevirus，MDV）引起的鹿传染病，可引起鹿呈多临床表现，主要表现为腹泻、母鹿流产、不孕，产死胎、木乃伊胎或畸形胎等。除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。4.1PBS，见表A.1。4.5pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液，见表A.5。4.6底物溶液（OPD-H2O2），见表A.6。4.7终止液，见表A.7。4.10MDV免疫球蛋白，见附录B。1DB22/T2984—20194.11MDV酶标抗体，见附录C。5仪器设备5.1离心机，最高转速15000r/min。5.2恒温培养箱，温度均匀度≤±1（37℃时）5.3酶联免疫检测仪，全波长酶标仪。5.4紫外分光光度计，200nm～1000nm。6样品处理6.1样品采集选择新鲜鹿粪3g～5g装入洁净的食品塑料袋内，用封口机封口或结扎紧袋口后立即放入盛有冰块的保温瓶（箱）内。每份样品的包装瓶（袋）上均要贴上标签，写明采集地点，编号，时间等。如暂时不进行检测应－80℃保存。6.2样品处理取1g采集到的鹿粪样品加入10mLPBS（5.1）中充分混匀，3000r/min离心（6.1）30min，上清液即为待检样品。7.2在ELISA反应板中加入用包被液（5.2）稀释至1.0mg/mLMDV免疫球蛋白（5.10）100μL/孔，37℃（6.2）包被4h。7.3弃去板中溶液，加洗涤液（5.3）300μL/孔，轻微晃动反应板，3min后弃去洗涤液；如此操作3次，最后将ELISA反应板置于吸水纸上轻轻拍干。7.6加入待检样品100μL/孔，并设阳性对照（5.8）2孔，阴性对照（5.9）2孔，空白对照1孔，密封ELISA反应板，37℃孵育2h。7.8加入酶标抗体（5.11）100μL/孔，密封ELISA反应板，37℃孵育1h。7.9重复7.3的操作。2DB22/T2984—20198.4样品OD值/阴性对照平均OD值≥2判断为阳性，否则为阴性。3DB22/T2984—2019附录A（规范性附录）相关试剂的配制PBSpH7.4配制见表A.1。表A.1NaCl8.0gKH2PO41.2g2.9gNa2HPO4•12H2OKCI0.2g蒸馏水加至1000mL包被液配制见表A.2。表A.24DB22/T2984—2019封闭液配制见表A.4。表A.4兔血清白蛋白5g洗涤液100mLpH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液配制见表A.5。表A.50.2mol/LNa2HPO40.1mol/L柠檬酸蒸馏水25.7mL24.3mL50mL底物溶液（OPD-H2O2）配制见表A.6。表A.6pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液邻苯二胺5DB22/T2984—2019附录B（规范性附录）MDV免疫球蛋白提取MDV免疫球蛋白提取步骤为：a)取20mLMD高免血清，加20mLpH7.4的PBS，使其稀释1倍；b)在搅拌条件下缓慢加入40mL的饱和硫酸铵（50%饱和度），4℃放置0.5h～1h；以3000r/min离心20min，弃去上清液；c)d)加入20mLPBS，将沉淀充分溶解后再加入10mL饱和硫酸铵（即33%饱和度），进行第二次沉淀；e)重复B.4二次，使沉淀物达到完全白色为止；f)沉淀物溶于2mL～4mLPBS中，装入透析袋中密封；g)再将其放到盛有PBS的容器中，于4℃条件下透析过夜脱盐；h)再用SephadexG-25进行过柱纯化；i)收集纯化免疫球蛋白，将其用蔗糖浓缩后采用紫外分光光度计进行蛋白含量测定，IgG含量为1.28mg/mL；j)进行分装，-20℃保存备用。6DB22/T2984—2019CA附录C（规范性附录）MDV酶标抗体MDV酶标抗体的标记步骤为：a)取10mgHRP溶于1.0mL蒸馏水，加入新鲜配制的0.06mol/L高碘酸钠水溶液1.0mL，混匀后置冰箱4℃30min；b)将其取出加入0.16mol/L乙二醇水溶液1.0mL，于室温放置30min后加入含10mg纯化MDIgG水溶液2.0mL；c)将上述结合物混匀后装入透析袋中在0.05mol/LpH9.5的碳酸缓冲液中缓慢搅拌透析6h使之结合，然后吸出；d)再将吸出物加5mg/mL硼氢化钠溶液0.4mL，4℃放置2h；e)将上述结合物混合液加入等体积的饱和硫酸铵，4℃放置30min后，以3000r/min离心20min，沉淀物溶于少许0.02mol/LpH7.4的PBS中，透析过夜；f)再将其在4℃条件下1.5×104r/min离心2