靶向高通量测序技术应用于感染性疾病专家共识解读

靶向高通量测序技术应用于感染性疾病专家共识汇报人：目录CATALOGUE摘要临床适应证tNGS的实验流程建议质量控制报告解读总结与展望01摘要PART摘要感染性疾病的威胁与检测感染性疾病仍为全球公共卫生重要威胁，准确病原学检测对诊治至关重要；传统方法虽各有优势，但也存在不同局限性，亟待更精准的检测手段。tNGS技术的应用与挑战靶向高通量测序技术（tNGS）在感染性疾病病原体检测中展现潜力，随着技术进步和成本降低，预计tNGS将在感染性疾病的诊断和治疗中得到更广泛应用。制定共识的意义为确保tNGS在临床应用中的规范性，提升感染性疾病病原体诊断质量，明确应用场景并实施质量管理，我们组织专家制定了共识，旨在促进技术良性发展。共识的期望与影响希望共识能促进技术交流与合作，助力临床抗感染诊治能力提升，为感染性疾病的精准治疗提供坚实的技术支持，为公共卫生事业贡献力量。02临床适应证PART疑似下呼吸道感染tNGS助诊下呼吸道感染对于疑似下呼吸道感染的非重症患者，tNGS检测有助于明确病原体，尤其当传统微生物检测未明、治疗无效及针对高危人群时。tNGS检出优势显著tNGS显著提升病原体检出率，优于传统方法，且在识别非典型病原体和混合感染方面表现突出，为下呼吸道感染诊断提供有力支持。tNGS指导治疗tNGS检测效率高、成本效益优，其临床应用为下呼吸道感染治疗提供指导，突显了在感染性疾病诊断中的应用价值。tNGS助诊MP感染tNGS在儿童MP感染诊断中准确，且能检测耐药基因，助力早期诊断与流行病学监测，对儿童社区获得性肺炎具有重要意义。疑似中枢神经系统感染01tNGS早诊颅内感染针对经验性抗感染治疗不佳、传统微生物检测阴性及颅内感染疑似占位性病变的非重症患者，tNGS检测在传染性脑膜炎/脑炎脑脊液中表现出色。02tNGS敏感度远超传统方法在小儿神经外科患者中，tNGS诊断中枢神经系统感染的敏感度和特异度远高于传统脑脊液培养和涂片方法，ROC分析显示其性能优越。疑似血流感染tNGS助诊BSI对于疑似血流感染的非重症患者，tNGS检测尤其适用于传统微生物检测阴性、治疗无效及高危人群（儿童、孕妇、老年人及基础疾病患者）。tNGS精准识别病原体tNGS性能优于血培养BSI是危及生命的全身性感染，对高危人群需高度重视；tNGS技术能快速准确识别病原体，辅助医师精准诊断治疗，提高临床疗效。tNGS对BSI诊断敏感度高，检测TAT快，且31.9%患者在针对性抗感染治疗调整后病情改善，其性能优于血培养和mNGS。123疑似泌尿系统脊柱关节感染在关节假体感染中，tNGS诊断敏感度和特异度与mNGS相当，但成本和检测TAT更优，且在关节假体感染中的诊断性能与培养和mNGS相当。tNGS诊断PJI精准tNGS检测尿路感染病原体快速、灵敏、全面，可作为传统尿液培养方法的补充，尤其适用于复杂和混合感染，提升临床诊断价值。tNGS助诊尿路感染0102结核分枝杆菌耐药检测针对结核分枝杆菌耐药基因与表型一致性高的物种，tNGS检测方法表现出色，与传统方法相比，它能够快速识别结核分枝杆菌的谱系和耐药性。tNGS助力耐药检测tNGS检出率高tNGS指导治疗tNGS检出率高于AFB涂片、培养及免疫学检查，与XpertMTB/RIF敏感度相当，且对不同耐药谱结核分枝杆菌检测结果与WGS高度一致。tNGS对利福平、异烟肼等耐药检测敏感度高，且粪便样本检测显示其广泛适用性，为耐药结核病治疗提供精准医学指导的临床信息。优先mNGS送检情况对于病原体未明且病因不明的危重症患者，应优先考虑mNGS送检，以尽早明确病原学诊断，指导精准治疗。mNGS助诊危重症感染免疫功能抑制患者感染复杂，mNGS能覆盖更广泛病原体，提高病原学诊断率，应优先考虑以明确病因。mNGS助力免疫功能抑制患者在社区聚集疑似新发病原体暴发流行中，mNGS因其更广的病原体覆盖优势，成为明确病原体的重要手段，助力早期诊断与控制。mNGS助力早期诊断多学科会诊与判读多标本检测助诊在临床中，多标本检测为致病菌判断提供丰富参考，详细评估患者确定潜在感染病因时，建议进行病原微生物深入分析。微生物多学科会诊判读结合多领域知识对于病情严重且病因不明的患者，建议感染科、病原微生物团队及相关临床科室进行多学科会诊，以全面评估病情。tNGS检测结果判读需结合患者病情、标本类型和实验室结果，必要时参考文献，确保诊断的准确性和可靠性。123tNGS结果判读临床中多标本检测为致病菌判断提供丰富信息，建议综合患者病情、标本类型和实验室结果，必要时参考文献，由感染科、病原微生物团队等多学科会诊，以确定潜在感染病因。多标本综合判读对于病因复杂的微生物群落关系，建议进行病原微生物深入分析，识别微生物群体组成及其与患者病情相关性，并考虑其他临床科室的协同作用，以实现精准抗菌治疗。病原微生物深入分析010203tNGS的实验流程建议PART样本采集与预处理建议在使用抗菌药物治疗前采集疑似感染患者的样本，并优先选择感染部位样本。实验室需建立完整前处理流程，保障生物安全性。样本采集时机与类型样本采集建议样本处理与记录不同样本采集及注意事项详述了各类样本的采集要求，如鼻咽拭子、口咽拭子、BALF、痰液等，并强调了样本采集时的注意事项。实验室收到样本后需记录详细信息，包括样本编号与类型。不同类型样本需进行灭活处理，检查体积和黏度，预处理为可吸取液体样本后再进行后续操作。核酸提取要求常用核酸提取方法有柱提法和磁珠法，可根据实际操作和具体需求选择或优化。对于细胞壁较厚的样本，可结合酶解法或化学法提高裂解效率。核酸提取技术核酸评估与污染防控为保证高纯度和高质量的DNA/RNA，需对核酸进行纯度和浓度评估。在RNA提取过程中需特别注意防止RNase污染，避免影响RNA病毒检测结果。实验室应针对不同类型样本和特殊病原体建立核酸提取流程，并设立阴性对照和阳性对照。核酸提取的质量是高通量测序成功的关键，需确保操作符合需求。核酸提取与质量控制基于探针捕获技术的tNGS（hc-tNGS）通过设计特异性探针捕获目标病原体核酸序列，提高检测序列数和覆盖度，可适用于已知病原体检测，尤其苛养和低载量病原体，但不适用新发病原体检测。tNGS技术选择hc-tNGS的应用与局限基于多重PCR技术的tNGS（mp-tNGS）通过设计多重PCR引物对目标病原体核酸进行富集，实验步骤简单快捷，适用于检测几十到几百个靶标，但存在引物间干扰、非特异性扩增等问题，影响稳定性。mp-tNGS的优缺点概述实验室在选择tNGS技术时，需综合考虑临床需求、适用场景、样本类型、预期病原体种类和数量、实验室设备和技术水平等因素，确保选择的技术能满足检测要求。技术选择考虑因素生物信息学分析优化生物信息学分析流程始于原始fastq文件，包括过滤低质量序列、与参考数据库比对、序列组装、耐药基因和毒力基因鉴定等步骤，确保数据处理的准确性和完整性。生物信息学分析流程为验证生物信息学分析流程的性能，需包括对照组和患者数据集的分析与比较，并通过常规实验室结果确认最终结果准确性。不同实验室可能采用不同分析流程，需详细记录所使用的方法。流程性能验证与记录010204质量控制PART实验室污染防控实验室应通过合理的布局、环境洁净度控制、单向工作流程、严格的去污染方案和对照的设置等降低污染风险，尤其采用专用操作空间，以最大程度减少气溶胶污染。实验室防控污染策略tNGS诊断面临污染挑战，需防控气溶胶、试剂及环境微生物污染；操作需严格训练，避免交叉污染；同时，实施去污染方案，如PCR标签控制和dUTP防污染技术。污染风险与控制措施核酸提取与数据质控实验室的核酸提取流程应经过验证；测序原始数据应进行质量控制，确保测序原始数据的质量；同时，根据测序平台和样本类型选择试剂盒和检测流程。核酸提取与测序选择寡核苷酸设计合成影响tNGS成功率与数据质量，需严格质控其来源、质量与数量；同时数据与序列管理需检验医师与临床医师团队合作，确保检测的准确性。寡核苷酸设计与质控测序数据量标准建议下机数据中单样本平均数据量≥1M，识别正确率超过99.9%的碱基占比（Q30）≥85%，以确保tNGS在感染性疾病病原体诊断中的敏感度和特异度。数据量对诊断影响测序数据量直接影响tNGS诊断敏感度和特异度，较高数据量可提升低丰度病原体检出率，区分病原体序列与背景噪音，减少假阳性和假阴性，提高诊断准确性。下机数据质量标准阳性阈值设定依据tNGS技术中阳性阈值的设定对于确保检测的敏感度、特异度和临床意义至关重要，需综合考虑实验数据、统计分析、病原体特性等，并保证结果的可重复性。阳性阈值重要性实验室分析tNGS结果时，阳性阈值设定至关重要；应基于检测流程、临床意义、病原体特性及实验室数据，设定阈值确保结果可重复，符合行业规范。实验室阈值设定建议0102参考样品性能确认参考样品性能确认对检测和分析流程中的参考样品（代表物种）进行确认是确保实验室检测性能的关键；建议确认包括检出限、精密度、准确性、稳定性和重复性。检测性能验证研究性能确认步骤应通过使用阴性、阳性质控和标准参考品，在不同时间点、不同操作人员和不同仪器上重复实验来完成，确保检测方法的可靠性和实验室间的可比较性。偏差与干扰评估比较tNGS结果与传统微生物学方法和其他分子诊断技术的一致性也十分必要；同时检测流程中可能引入的偏差和干扰因素评估也是非常重要的环节。本地化检测优势与挑战医院建检测平台提升技术与运营水平，可根据临床实践和病例特点定制流程，满足特定临床需求，提升诊疗水平。平台提升医疗水平检测提速诊疗效率挑战医院内部检测能够显著缩短样本处理和结果报告的时间，有助于医疗团队更迅速地获取关键的诊断信息，及时调整方案并提供紧急护理。医院开展本地化tNGS检测面临的挑战主要包括技术人员的质控意识、仪器设备校准、方法学性能验证，以及实验室环境控制和安全保证等方面。05报告解读PARTtNGS报告内容tNGS结果报告应全面，含患者信息、检测方法、范围、结果、质量控制、结论建议、解释权及参考文献，确保检测透明度与准确性。检测全方位报告报告基本内容应包括患者个人信息、送检科室详情、样本采集接收记录、tNGS技术步骤、测序平台与策略、检测范围及结果、质量控制措施等。报告详实全面07060504030201引物：引物是PCR扩增过程中至关重要的组成部分，为确保扩增反应的特异性，引物设计需精确匹配目标DNA序列。检出序列数：检出序列数指样本中检出的微生物核酸序列总数；数值越高，理论上该病原体的有效扩增信号越强。库：库是为进行高通量测序而准备的核酸样本集合，包括经过切割、修饰和适配体连接的DNA或RNA片段。质控：质控是在实验过程中用于确保数据质量的各种检测和措施，质控品建立背景微生物数据库和排除环境污染等情况。内参：内参是实验中加入的已知量的核酸序列，用于监控实验过程的准确性和可靠性，以确保实验数据的准确性。阴性对照：阴性对照是实验中不含目标病原体的样本，其作用是确保实验过程不受污染，以验证实验结果的准确性。SDSMRN：SDSMRN是标准化后的物种（种或型或亚型）严格比对序列数，用于评估测序数据中对病原体的检测情况。报告常用术语解释08Q30：Q30表示碱基错误识别的概率为0.1%，即正确率为99.9%；Q30比例指正确率超过99.9%的碱基占比。质控品数据库建立01质控品与数据库建为确保tNGS检测的准确性，可使用质控品建立背景微生物数据库，并排除环境污染等情况。02质控流程与结果判质量合格的测序数据应该综合临床特征和其他检测指标判定结果；阴性质控品检测阴性，阳性质控品正确检出对应病原体。样本质控流程分析测序完成后，应全面质控样本、实验流程、文库及数据质量，合格后进行分析；查看结果文件，包括临床和对照样本的下机数据量、数据质量等。测序完成质控全质控合格后，使用比对工具将过滤后的读段与本实验室的tNGS参考病原体数据库比对，对检出物种进行精确注释，以获取有意义的生物学信息。比对注释精准0102检出结果综合判断理论上，标准化后的物种SDSMRN高于其对应类别的阳性判断阈值则视为检出，同时考虑微生物自身特点及患者临床实际情况。病原检出标准病原检出与校正序列数与致病判断细菌分革兰阳性和阴性，病毒分DNA和RNA；根据阳性判断值、阴控倍数及强阳污染阈值分析检出靶标，全部满足则判定为阳性。检出序列数可能不足以反映病原体的真实丰度或致病潜力，应结合临床实际情况及其他临床检测结果、病原体本身致病情况判断是否为致病微生物。低序列数综合判断法报告中某种/某些胞内菌（如结核分枝杆菌）/厚壁菌（真菌，如曲霉等）检出序列数不高时，需要结合患者临床症状及其他检测结果综合判断。胞内菌厚壁菌低检低序列数可能是由于破壁技术未能有效破坏微生物的细胞壁，导致胞内DNA释放不充分；对于低序列数无法明确判断的胞内菌和厚壁菌，须综合分析。低序数综合判断tNGS报告内容全面涵盖患者、送检及样本信息，tNGS技术细节，测序平台与策略，检测范围，病原体检出与解释，以及质量控制措施，确保检测结果准确可靠。报告基本内容详解报告常用术语解释检出序列数反映病原体扩增信号强度，引物是PCR关键，库是高通量测序准备样本，质控确保数据质量，阴性对照排污染，内参监控实验准确性。包含患者、送检机构信息，检测方法、范围、结果，质控措施，专业格式，结论、建议及参考文献，确保报告完整性与准确性。阴性结果综合判断阴性结果综合判断质控品与结果判定质控品阴性质控阴性有效排除污染，阳性质控正确检出病原体，综合临床特征和其他检测指标判定结果，确保tNGS检测准确性。测序后质控流程病原微生物检出标准测序完成后，全面质控样本、实验流程、文库、数据及污染，合格后分析；查看结果文件，质控后比对数据库，注释检出物种。理论上SDSMRN高于阈值视为检出，但需结合微生物特点及患者临床实际；细菌分革兰阳性/阴性，病毒分DNA/RNA，综合判断。123胞内菌/厚壁菌低序列数可能因破壁技术不足，DNA释放少；需结合临床症状、影像学、培养等其他检测综合分析，以准确诊断。阴性结果综合判断低序列数综合判断tNGS阴性结果需结合整体检出情况判断，不能作为唯一排除感染标准，因靶标有限，可能存在非靶标感染，受多种因素影响。阴性结果综合判断tNGS阴性结果需结合临床和其他实验室检测方法综合判断，因可能受病原体类型、采样时间等因素影响，不能单独作为排除依据。阴性结果综合考量阴性结果综合判断01耐药基因验证必要tNGS鉴定耐药/毒力基因时，需明确基因型与表型不一，结合实验室检测结果验证，特别是高一致性病原体如结核分枝杆菌。02耐药基因辅助治疗tNGS可鉴定病原体及耐药/毒力基因，但结果需结合实验室检测和临床判断，因表达受多种因素影响，最终耐药性评估需综合考量。耐药基因鉴定与验证tNGS能够精准识别多种病原体，包括细菌、病毒、真菌及寄生虫等，适用于复杂或混合感染的情况。精准识别病原体检测耐药基因研究耐药机制tNGS能够检测病原体的耐药基因，对于与表型一致性较高的病原体如结核分枝杆菌，能够及时提供用药指导。对于基因型与表型之间的关系尚未完全明确的病原体，耐药基因的检测与临床表现可能存在不一致情况。耐药基因鉴定与验证通过整合多个数据库并深入研究耐药机制，通过对耐药基因相关耐药性状进行分级，生成更直观的耐药检测结果。分级耐药性状技术实现长读长测序，提升拼接准确性，用于病原体识别与追踪，助力研究传播路径、基因型变异及地域性流行病。靶向长读长测序通过特异性捕获技术，对临床标本中微生物的核酸进行靶向富集，从而获得更多的检测数据信息。富集检测数据耐药基因鉴定与验证高效检测应用以其便携高效、长读长等特性，能够在微生物的种类鉴定及发现新型（未知）耐药突变方面发挥关键作用。01控制检测成本长读长测序在敏感度和特异度上有优势，但目前其成本较高，尤其是在大规模流行病学调查和常规临床应用中。0206总结与展望PARTtNGS技术潜力与进展tNGS精准识别病原体tNGS能够精准识别多种病原体，包括细菌、病毒、真菌及寄生虫等，适用于复杂或混合感染的情况。检测耐药基因助精准tNGS能够检测病原体的耐药基因，对于与表型一致性较高的