肝癌转移特征性聚糖谱改变及相应糖基转移酶基因表达差异研究

肝癌转移特征性聚糖谱改变及相应糖基转移酶基因表达差异研究摘要肝细胞肝癌（humanhepatocellularcarcinoma，HCC）在我国位居恶性肿瘤死亡率第二位，其复发和转移一直是影响肝癌治疗效果的重要因素。所有细胞都带有致密而复杂的共价键结合的糖链（又叫做聚糖或寡糖）。聚糖结构随肿瘤进程不同会出现特征性的改变。寻找特征性改变的聚糖，弄清其改变的意义对于肿瘤的监测、诊治及预后判断都具有重要价值。凝集素芯片是2005年新出现的糖分析技术，可以高通量的解析样本的聚糖信息。本研究首次采用凝集素芯片比较了3株肝细胞：L02（正常肝细胞系）、Hep3B（不转移肝癌细胞系）、HCCLM3（高转移潜能肝癌细胞系）的细胞膜蛋白糖谱，筛选出Hep3B和HCCLM3细胞表面一系列和肝癌侵袭及转移相关特征性聚糖结构，并且建立了糖基转移酶基因芯片比较了Hep3B和HCCLM3的糖基转移酶基因表达谱，一方面用以解释HCCLM3细胞表面特征性聚糖结构的发生，另一方面探讨差异表达的糖基转移酶所涉及的细胞功能及与HCCLM3细胞系转移潜能的相关性。最后我们对其中一个差异表达的糖基转移酶β3GALT5进行基因沉默，分析了这一基因的改变对高转移肝癌细胞系HCCLM3的体外细胞行为学影响。关键词肝细胞肝癌；肿瘤转移；凝集素芯片；聚糖谱改变；糖基转移酶；基因表达；细胞侵袭；RNA干扰一、引言肝细胞肝癌（HCC）是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，在我国其发病率和死亡率均居高不下，严重威胁着人类的健康。肝癌的复发和转移是导致患者预后不良的主要原因，尽管在肝癌的诊断和治疗方面取得了一定进展，但对于肝癌转移机制的深入理解仍有待加强。细胞表面的聚糖在细胞间识别、信号传导、细胞黏附等多种生物学过程中发挥着关键作用。在肿瘤发生发展过程中，聚糖结构会发生显著改变，这些改变与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及免疫逃逸等密切相关。因此，研究肝癌转移过程中特征性聚糖谱的改变以及相应糖基转移酶基因表达的差异，有望为肝癌的早期诊断、治疗靶点的寻找以及预后评估提供新的思路和方法。二、材料与方法2.1细胞系选用正常肝细胞系L02、不转移肝癌细胞系Hep3B以及高转移潜能肝癌细胞系HCCLM3作为研究对象。这些细胞系均购自国内知名细胞库，并在实验室条件下按照标准操作规程进行培养和传代。2.2凝集素芯片技术检测细胞膜蛋白聚糖谱采用Cy3标记完整细胞膜，液氮速冻终止标记后，使用Merck天然膜蛋白提取试剂盒提取细胞膜蛋白。通过免疫印迹法鉴定膜蛋白提取的纯度，蛋白定量后每格凝集素芯片围栏上样10μg。经芯片孵育、清洗、扫描及统计分析后获得细胞膜蛋白和凝集素结合谱，根据不同凝集素对聚糖的结合特异性，推断膜蛋白聚糖谱，并比较不同细胞聚糖谱表达差异。为验证芯片系统的重现性，进行了不同样本及同一批样本重复上样检测。2.3糖基转移酶基因芯片的制备与应用从功能糖组学网站（）数据库筛选参与肿瘤相关聚糖合成的基因115个，其中包含90个糖基转移酶、10个糖苷水解酶和5个糖核苷酸转运子，合成探针点制糖基转移酶基因芯片。芯片上同时设置阳性对照、阴性对照、点样阳性对照以及外标作为芯片质控。选取人肝癌细胞系Hep3B和HCCLM3，用Trizol法提取RNA，逆转录获得cDNA，经荧光标记后进行芯片杂交。筛选出表达差异倍数≥2或是≤0.5的基因，统计学方法分析差异显著性，并经生物信息学分析差异基因可能涉及的聚糖结构合成通路及功能网络。选取其中5个基因通过Real-timePCR方法验证芯片结果。2.4β3GALT5基因沉默及细胞行为学分析针对差异表达的糖基转移酶β3GALT5设计并合成特异性的siRNA，采用脂质体转染法将其导入高转移肝癌细胞系HCCLM3中，实现β3GALT5基因的沉默。通过实时荧光定量PCR和Westernblot检测基因沉默效率。利用Transwell小室实验检测细胞侵袭能力的变化，CCK-8法检测细胞增殖能力的改变，流式细胞术分析细胞凋亡情况。三、实验结果3.1基于凝集素芯片的不同转移潜能肝癌细胞系膜蛋白聚糖谱比较凝集素芯片技术成功捕捉到细胞系CHO和Lec1的膜蛋白特征性寡糖表达差异，即Lec1由于缺少N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I，杂合型和复杂型聚糖表达减少，高甘露糖型聚糖代偿性合成增多。比较L02、Hep3B的细胞膜糖谱，发现Hep3B对凝集素ConA、AAL、PHA-L、MPL的亲和增强，对WGA亲和减弱，提示细胞表面甘露糖、末端岩藻糖、β1-6分支聚糖及粘蛋白T抗原聚糖结构增多而N-乙酰葡糖胺结构和（或）多价唾液酸结构的减少。比较Hep3B和HCCLM3的细胞膜聚糖谱，发现HCCLM3对凝集素LCA、PHA-E、MAL-I、MAL-II、WGA的亲和增强，对Lac-A-I亲和减弱，提示细胞表面可能出现核心岩藻糖、平分型GlcNAc、α2,3连接唾液酸和（或）N-乙酰葡糖胺结构表达增高以及末端β1-4连接半乳糖结构表达减少。细胞表面凝集素组织化学技术验证的结果和芯片结果一致，证明芯片结果可靠。3.2不同转移潜能肝癌细胞系糖基转移酶基因表达谱比较及其与细胞膜聚糖谱的关系人肝癌细胞系Hep3B和HCCLM3比较，18个基因在HCCLM3中表达上调，11个基因表达下调。表达改变的基因主要涉及N-聚糖、O-聚糖粘蛋白sialylTn抗原、血型糖脂、红细胞糖苷脂、sialylLewisa（sLea）、sialylLewisx（sLex）等聚糖结构的合成。比对这两株细胞的凝集素芯片亲和谱与糖基转移酶基因表达谱，发现糖基转移酶基因FUT8、MGAT3、ST3Gal的上调分别对应凝集素芯片上LCA、PHA-E、MAL-I、II亲和信号增强。结合IPA工具分析差异基因涉及的功能网络图，发现MGAT3、ST3Gals、β3GalT5、β3Gn-Ts、FUT等基因通过改变对黏附分子或其受体的修饰和表达量来影响细胞的黏附；MGAT5等通过协同或独立刺激血管生长因子分泌促进血管生成；MGAT5等基因也可以通过调节功能网络中重要节点分子如TGFβ受体的表达，影响其后续的多种信号通路，参与细胞的凋亡增殖等。3.3β3GALT5基因沉默对HCCLM3细胞体外行为学的影响成功将针对β3GALT5的siRNA导入HCCLM3细胞，实时荧光定量PCR和Westernblot结果显示β3GALT5基因的mRNA和蛋白表达水平均显著降低，表明基因沉默成功。Transwell小室实验结果表明，β3GALT5基因沉默后，HCCLM3细胞的侵袭能力明显减弱；CCK-8法检测结果显示细胞增殖能力受到抑制；流式细胞术分析结果显示细胞凋亡率显著增加。四、分析与讨论4.1肝癌转移相关特征性聚糖谱的意义本研究通过凝集素芯片技术筛选出了与肝癌侵袭及转移相关的特征性聚糖谱。这些聚糖结构的改变可能在肝癌细胞的转移过程中发挥着重要作用。例如，核心岩藻糖、平分型GlcNAc等结构的增加可能影响细胞表面受体与配体的相互作用，从而促进肝癌细胞与细胞外基质或其他细胞的黏附、迁移。末端β1-4连接半乳糖结构表达减少可能影响细胞间的识别和信号传导，有利于肝癌细胞突破原发部位的限制发生转移。这些特征性聚糖谱的发现为肝癌转移机制的研究提供了新的线索，也有望作为潜在的生物标志物用于肝癌转移的早期诊断。4.2糖基转移酶基因表达差异与聚糖谱改变及肝癌转移的关系糖基转移酶基因表达谱的改变很好地解释了细胞膜聚糖谱的差异。例如，FUT8基因表达上调导致核心岩藻糖结构增加，这与凝集素芯片上LCA亲和信号增强一致。差异表达的糖基转移酶基因通过调节细胞黏附、血管生成、细胞凋亡增殖等多种生物学过程参与肝癌转移。如MGAT5等基因通过调节TGFβ受体的表达影响信号通路，进而影响肝癌细胞的生物学行为。深入研究这些糖基转移酶基因的功能及相互作用网络，有助于进一步阐明肝癌转移的分子机制，为寻找新的治疗靶点提供理论依据。4.3β3GALT5基因在肝癌转移中的作用β3GALT5基因沉默后，HCCLM3细胞的侵袭、增殖能力受到抑制，凋亡率增加，表明β3GALT5基因在肝癌转移过程中发挥着促进作用。β3GALT5可能通过参与合成特定的聚糖结构，影响细胞表面分子的功能，进而调节肝癌细胞的生物学行为。进一步研究β3GALT5的作用机制以及其上下游调控关系，对于开发针对肝癌转移的靶向治疗策略具有重要意义。五、结论本研究通过凝集素芯片和糖基转移酶基因芯片技术，系统地分析了肝癌转移过程中特征性聚糖谱的改变以及相应糖基转移酶基因表达的差异。筛选出了一系列与肝癌侵袭及转移相关的特征性聚糖结构和差