3.2基因工程的基本操作程序课件高二下学期生物人教版选择性必修3（第一课时）

第3章第2节第二步：基因表达载体的构建二/第一步：目的基因的筛选与获取一/第三步：将目的基因导入受体细胞三/第四步：目的基因的检测与鉴定四/DNA片段的扩增及电泳鉴定五/一目的基因的筛选与获取任务一：阅读教材P76-77，回答下列问题。1.培育转基因抗虫棉需要哪些步骤？2.什么是目的基因？3.你知道有什么方法可以得到目的基因吗？4.DNA复制需要什么条件？一目的基因的筛选与获取任务一：阅读教材P76-77，回答下列问题。1.培育转基因抗虫棉需要哪些步骤？2.什么是目的基因？3.你知道有什么方法可以得到目的基因吗？目的基因的筛选和获取、基因载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和鉴定用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因利用PCR获取和扩增目的基因一目的基因的筛选与获取任务一：阅读教材P76-77，回答下列问题。4.DNA复制需要什么条件？酶：解旋酶（高温替代）解开双链、DNA聚合酶催化合成子链模板：DNA母链

原料：4种脱氧核苷酸引物：使DNA聚合酶能够从引物3’端开始连接脱氧核苷酸一目的基因的筛选与获取一目的基因的筛选与获取问题：PCR主要功能是什么？DNA的体外合成PCR的实质是什么？特异性的扩增DNA一目的基因的筛选与获取1.PCR中文名称：聚合酶链式反应2.实质：在体外大量快速扩增特定DNA片段的技术DNA复制（体外）3.原理：根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制一目的基因的筛选与获取解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为一小段单链RNA）无需解旋酶高温替代任务二：探究PCR的条件活动1：对比DNA的体内复制条件，总结DNA体外合成的条件一目的基因的筛选与获取任务二：探究PCR的条件活动1：对比DNA的体内复制条件，总结DNA体外合成的条件资料2：DNA的变性和复性DNA的变性：在80-100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构解体，DNA打开氢键，双链解成单链。DNA的复性：缓慢冷却后，温度降低两条分离的单链按照碱基互补配对，重新结合成双链。一目的基因的筛选与获取任务二：探究PCR的条件活动1：对比DNA的体内复制条件，总结DNA体外合成的条件资料2：DNA的变性和复性DNA的变性：在80-100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构解体，DNA打开氢键，双链解成单链。DNA的复性：缓慢冷却后，温度降低两条分离的单链按照碱基互补配对，重新结合成双链。DNA双链单链变性（加热95℃）复性（缓慢冷却55℃）一目的基因的筛选与获取解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为一小段单链RNA）无需解旋酶高温替代任务二：探究PCR的条件活动1：对比DNA的体内复制条件，总结DNA体外合成的条件DNA母链脱氧核糖核苷三磷酸,dNTPs一目的基因的筛选与获取任务二：探究PCR的条件活动1：对比DNA的体内复制条件，总结DNA体外合成的条件资料3：DNA复制的原料脱氧核糖核苷三磷酸原料：dNTPsdATPsdGTPsdCTPsdTTPs既能作为原料又能提供能量一目的基因的筛选与获取解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为一小段单链RNA）无需解旋酶高温替代任务二：探究PCR的条件活动1：对比DNA的体内复制条件，总结DNA体外合成的条件DNA母链脱氧核糖核苷三磷酸,dNTPs一目的基因的筛选与获取任务二：探究PCR的条件活动1：对比DNA的体内复制条件，总结DNA体外合成的条件思考：DNA变性需要较高的温度，使用的DNA聚合酶应具有什么样的特点？耐高温的DNA聚合酶（例如：Taq酶）注：Taq酶的适宜温度约为70-80℃TaqDNA聚合酶的最适温度是72℃一目的基因的筛选与获取解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸（dNTPs)DNA聚合酶引物（通常为一小段单链RNA）无需解旋酶高温替代任务二：探究PCR的条件活动1：对比DNA的体内复制条件，总结DNA体外合成的条件DNA母链脱氧核糖核苷三磷酸,dNTPs耐高温聚合酶（Taq酶）一目的基因的筛选与获取任务二：探究PCR的条件活动2：小组讨论，设计PCR所需引物问题1：DNA体内复制过程需要引物，DNA体外合成需要引物吗？一目的基因的筛选与获取复习：DNA体内复制过程一目的基因的筛选与获取复习：DNA体内复制过程一目的基因的筛选与获取任务二：探究PCR的条件活动2：小组讨论，设计PCR所需引物问题1：DNA体内复制过程需要引物，DNA体外合成需要引物吗？DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能引物为DNA聚合酶提供了游离的3’末端，DNA聚合酶可以从3’末端延伸子链一目的基因的筛选与获取任务二：探究PCR的条件活动2：小组讨论，设计PCR所需引物问题1：DNA体内复制过程需要引物，DNA体外合成需要引物吗？DNA聚合酶不具有从头合成子链的功能引物为DNA聚合酶提供了游离的3’末端，DNA聚合酶可以从3’末端延伸子链ATGCTTGCTTAAAAAA5’3’3’5’AAA一目的基因的筛选与获取任务二：探究PCR的条件活动2：小组讨论，设计PCR所需引物问题2：DNA体内复制过程需要RNA引物，DNA体外合成也需要RNA引物吗？RNA不稳定，容易降解RNA引物体内还需要被去除重新形成DNA链PCR引物通常是一小段DNA单链引物能与DNA母链的一段碱基互补配对的短单链核酸，通常为20-30个核苷酸（小的DNA单链）一目的基因的筛选与获取任务二：探究PCR的条件活动2：小组讨论，设计PCR所需引物问题3：以下为需要扩增的序列，设计扩增所需要的引物？GACCTGTGGAAGC------------------------------------------CATACGGGATTG5’3’CTGGACACCTTCG------------------------------------------GTATGCCCTAAC3’5’目的基因一目的基因的筛选与获取任务二：探究PCR的条件活动2：小组讨论，设计PCR所需引物问题3：以下为需要扩增的序列，设计扩增所需要的引物？GACCTGTGGAAGC------------------------------------------CATACGGGATTG5’3’CTGGACACCTTCG------------------------------------------GTATGCCCTAAC3’5’目的基因Ⅰ3’5’Ⅱ3’5’Ⅲ5’3’Ⅳ5’3’根据DNA延伸方向，选择合适的引物？需要2个引物引物与DNA模板链的3’末端结合一目的基因的筛选与获取任务二：探究PCR的条件活动2：小组讨论，设计PCR所需引物问题3：以下为需要扩增的序列，设计扩增所需要的引物？GACCTGTGGAAGC------------------------------------------CATACGGGATTG5’3’CTGGACACCTTCG------------------------------------------GTATGCCCTAAC3’5’目的基因Ⅱ3’5’Ⅲ5’3’写出引物Ⅱ、Ⅲ的碱基序列？引物Ⅲ5’GACCTGTGGAAGC3’引物Ⅱ5’CAATCCCGTATG3’引物序列具有特异性，可以与模板链进行特异性结合一目的基因的筛选与获取任务二：探究PCR的条件活动2：小组讨论，设计PCR所需引物问题3：以下为需要扩增的序列，设计扩增所需要的引物？GACCTGTGGAAGC------------------------------------------CATACGGGATTG5’3’CTGGACACCTTCG------------------------------------------GTATGCCCTAAC3’5’目的基因Ⅱ

3’GTATGCCCTAAC5’Ⅲ

5’GACCTGTGGAAGC3’写出引物Ⅱ、Ⅲ的碱基序列？引物Ⅲ5’GACCTGTGGAAGC3’引物Ⅱ5’CAATCCCGTATG3’引物序列具有特异性，可以与模板链进行特异性结合一目的基因的筛选与获取任务二：探究PCR的条件活动2：小组讨论，设计PCR所需引物GACCTGTGGAAGC------------------------------------------CATACGGGATTG5’3’CTGGACACCTTCG------------------------------------------GTATGCCCTAAC3’5’目的基因Ⅱ

3’GTATGCCCTAAC5’Ⅲ

5’GACCTGTGGAAGC3’问题4：引物的长短与PCR扩增的特异性有什么关系？引物的长度一般在18-20bp，过短的引物，特异性不强一目的基因的筛选与获取任务二：探究PCR的条件活动2：小组讨论，设计PCR所需引物GACCTGTGGAAGC------------------------------------------CATACGGGATTG5’3’CTGGACACCTTCG------------------------------------------GTATGCCCTAAC3’5’目的基因Ⅱ

3’GTATGCCCTAAC5’Ⅲ

5’GACCTGTGGAAGC3’问题5：为什么引物与引物、引物内部、引物与待扩增靶DNA分子的其他序列都不能存在多个碱基的同源序列？两条引物之间不能有连续4个碱基的互补配对，否则加入的引物自身形成双链以至于得不到目的基因的产物引物内部自身不能有大于4bp的反向重复序列或自身互补序列的存在，引物内部多对碱基互补形成发夹结构一目的基因的筛选与获取任务二：探究PCR的条件活动2：小组讨论，设计PCR所需引物GACCTGTGGAAGC------------------------------------------CATACGGGATTG5’3’CTGGACACCTTCG------------------------------------------GTATGCCCTAAC3’5’目的基因Ⅱ

3’GTATGCCCTAAC5’Ⅲ

5’GACCTGTGGAAGC3’问题5：为什么引物与引物、引物内部、引物与待扩增靶DNA分子的其他序列都不能存在多个碱基的同源序列？两条引物之间不能有连续4个碱基的互补配对，否则加入的引物自身形成双链以至于得不到目的基因的产物引物内部自身不能有大于4bp的反向重复序列或自身互补序列的存在，引物内部多对碱基互补形成发夹结构引物与待扩增DNA分子的其他序列存在多个碱基的同源序列会导致引物与靶基因配对不精确。得到非目的基因产物一目的基因的筛选与获取解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸（dNTPs)DNA聚合酶引物（通常为一小段单链RNA）无需解旋酶高温替代任务二：探究PCR的条件活动1：对比DNA的体内复制条件，总结DNA体外合成的条件DNA母链脱氧核糖核苷三磷酸,dNTPs耐高温聚合酶（Taq酶）人工合成的引物（通常是一小段的单链DNA）一目的基因的筛选与获取任务二：探究PCR的条件PCR反应体系DNA母链（模板）脱氧核糖核苷三磷酸，dNTPs(N=AGTC)，（原料+能量）耐高温的DNA聚合酶（例:Taq聚合酶）人工合成的引物（一小段单链DNA）高温（破坏氢键）---替代解旋酶Mg2+（激活耐高温聚合酶的活性）缓冲液（维持反应体系的PH）一目的基因的筛选与获取任务三：设计PCR的循环温度活动1：结合DNA的复制过程，对比得出PCR的过程，并设计PCR循环温度第一步：变性变性：PCR反应体系中，双链DNA氢键断裂，变成单链DNA。变性温度：超过90℃（80-100℃）变性时间：一般只需要30s变性温度与氢键的数量有关，A=T、G≡G氢键越多（G≡G），温度越高目的基因问题:变性的温度为何是设定的是范围呢？DNA热变性一目的基因的筛选与获取任务三：设计PCR的循环温度活动1：结合DNA的复制过程，对比得出PCR的过程，并设计PCR循环温度第二步：复性（也称为退火）复性：引物也能够与分离的单链DNA碱基互补配对结合，从而构成DNA聚合酶合成新链的必要条件。复性温度：通常是50℃左右氢键越多，复性温度越高复性时间:一般只需要30s复性/退火一目的基因的筛选与获取任务三：设计PCR的循环温度活动1：结合DNA的复制过程，对比得出PCR的过程，并设计PCR循环温度第二步：复性（也称为退火）思考：温度降低的过程中，模板DNA也可以发生复性，如何控制条件，尽可能多的让引物和模板DNA结合？①引物相对于模板要过量（主要）复性/退火②引物不宜过长:退火的温度不会过高更有利于引物和模板DNA的结合一目的基因的筛选与获取任务三：设计PCR的循环温度活动1：结合DNA的复制过程，对比得出PCR的过程，并设计PCR循环温度第三步：延伸延伸：以单链DNA为模板，在耐高温的DNA聚合酶作用下延伸，即将4种脱氧核苷酸加到3’端。复性/退火延伸温度：72℃TaqDNA聚合酶的最适温度是72℃延伸时间：一般只需要1min一目的基因的筛选与获取任务三：设计PCR的循环温度活动2：小结PCR过程经历变性、退火、延伸三个步骤，可以完成一次DNA的体外复制

一目的基因的筛选与获取一目的基因的筛选与获取任务四：PCR结果分析活动1：目的基因PCR扩增结果分析引物1引物2问题：第1轮复制后能得到目的基因吗？如果不能，第几轮复制能够得到目的基因呢？

目的基因5’3’3’5’一目的基因的筛选与获取任务四：PCR结果分析活动1：目的基因PCR扩增结果分析第一轮5’3’3’5’一目的基因的筛选与获取任务四：PCR结果分析活动1：目的基因PCR扩增结果分析第二轮5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’一目的基因的筛选与获取任务四：PCR结果分析活动1：目的基因PCR扩增结果分析5’3’5’3’5’3’5’3’第三轮5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’5’3’5’3’一目的基因的筛选与获取任务四：PCR结果分析活动2：建立数学模型，从产物数量上分析PCR结果问题3：第n轮复制，产生多少个目的基因呢？次数DNA个数目的基因个数123n280422n-2n2n0PCR扩增轮数足够多时，扩增得到产物几乎全是目的基因的片段扩增产物近似指数增长一目的基因的筛选与获取任务四：PCR结果分析活动2：建立数学模型，从产物数量上分析PCR结果问题3：第n轮复制，产生多少个目的基因呢？次数含引物的DNA数含两种引物的DNA数含其中一种引物的DNA数消耗引物对数123n482n20262n-21372n-11372n-1一目的基因的筛选与获取一目的基因的筛选与获取任务四：PCR结果分析活动3：PCR扩增产物的鉴定采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物电泳的结果：较小的DNA片段移动速度快、距离远较大的DNA片段移动速度慢、距离近一目的基因的筛选与获取任务四：PCR结果分析活动3：PCR扩增产物的鉴定采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物当电泳结束时，比较DNA样品所在的位置和一些列已知大小的DNA片段的位置（标准），这些已知大小的片段称为DNA分子量标准样比较项目PCR细胞核内DNA复制场所细胞外（试管中）细胞内方式半保留全连续局部区域复制半保留半不连续全链复制起始位点引物3’复制起始位点酶仅使用一种DNA聚合酶（Taq酶）多种酶反应条件温度变幅大温和解旋高温解旋解旋酶解旋引物DNA片段，保留在复制的子链中RNA片段，不保留在复制的子链中产物引物界定的片段核基因组循环人为设置与细胞分裂同步PCR和细胞核内DNA复制的相同点有哪些？相同点内容原理原料模板酶引物均为碱基互补配对均为四种脱氧核苷酸均为脱氧核苷酸链，作为模板进行物质合成均需要DNA聚合酶催化均需要引物，使DNA聚合酶从引物3’端开始连接脱氧核苷酸关于引物设计补充？(1)设计引物主要目标①扩增的特异性只有当每条引物都能特异性的与模板DNA中的靶序列退火形成稳定结构时，才能达到准确扩增目的基因的目的（准）②扩增的高效性每条引物与模板DNA中的靶序列容易结合（快）(2)设计引物基本原则Ⅰ引物长度：一般在20-30bp过短：特异性差Ⅱ

引物中G+C含量：一般在40%-60%为宜过长：退火温度会比较高，不易和模板DNA链结合关于引物设计补充？(2)设计引物基本原则Ⅲ

两条引物之间不能有连续4个碱基的互补配对目的：防止引物自身形成双链，无法与模板DNA结合Ⅳ退火温度：退火温度高，扩增特异性强，退火温度低，扩增效率高如果引物碱基数较少，引物可能与模板DNA发生部分、非特性的结合，可能产生非特异性的扩增产物。解决办法：可以适当提高退火温度，减少引物的非特异性结合，使PCR的特异性增加。如果引物碱基数较多，引物的退火温度高，温度过高，引物不易于模板DNA结合（氢键不稳定），扩增效率低。解决办法：可以适当降低退火温度，促使引物与模板DNA结合。✔关于引物改造(3)引物的修饰和改造①修饰的部位：引物的5’②引物5’端修饰方法：加入酶切位点，由于引物从3’端延伸，3’不能进行任何修饰，由于5’端对扩增特异性影响不大，可给予修饰而不影响扩增特异性。引入蛋白质结合DNA序列，引入点突变、插入突变、缺失突变序列，引入启动子序列等一目的基因的筛选与获取任务五：修饰PCR引物活动1 ：需要扩增的目的基因不具有酶切位点，为保证目的基因和运载体连接，请设计引物，为目的基因增加酶切位点。5’3’TATCAGATCCATGGAGT......GAGTACTAGTCCTATGAGT3’5’ATAGTCTAGGTACCTCA......CTCATGATCAGGATACTCA目的基因一目的基因的筛选与获取任务五：修饰PCR引物5’3’TATCAGATCCATGGAGT......GAGTACTAGTCCTATGAGT3’5’ATAGTCTAGGTACCTCA......CTCATGATCAGGATACTCACAGATCCATG3’5’GAATTC-TCAGGATACT-CCTAGG3’5’第一轮TCAGGATACT-CCTAGG3’5’CAGATCCATG3’5’GAATTC-引物A引物B5’3’TATCAGATCCATGGAGT......GAGTACTAGTCCTATGAGTATAGTCTAGGTACCTCA......CTCATGATCAGGATACTCA-CCTAGG5’TCAGGATACT3’ATAGTCTAGGTACCTCA......CTCATGACAGATCCATGGACT......GAGTACTAGTCCTATGAGTGAATTC-5’3’3’5’5’3’TATCAGATCCATGGAGT......GAGTACTAGTCCTATGAGT-CCTAGG5’TCAGGATACT3’ATAGTCTAGGTACCTCA......CTCATGAATAGTCTAGGTACCTCA......CTCATGATCAGGATACTCACAGATCCATGGACT......GAGTACTAGTCCTATGAGTGAATTC-5’3’3’5’第二轮-CCTAGG5’TCAGGATACT3’ATAGTCTAGGTACCTCA......CTCATGATCAGGATACT-CCTAGG3’5’CAGATCCATG3’5’GAATTC-引物A引物BCAGATCCATGGAATTC-5’GACT......GAGTACTAGTCCTATGAGGATCC3’GAATTC-5’3’CAGATCCATGGACT......GAGTACTAGTCCTATGAGT-CCTAGG5’TCAGGATACT3’CTTAAGGTCTAGGTACCTCA......CTCATGA一目的基因的筛选与获取一目的基因的筛选与获取-CCTAGG5’TCAGGATACT3’ATAGTCTAGGTACCTCA......CTCATGACAGATCCATGGAATTC-5’GACT......GAGTACTAGTCCTATGAGGATCC3’GAATTC-5’3’CAGATCCATGGACT......GAGTACTAGTCCTATGAGT-CCTAGG5’TCAGGATACT3’CTTAAGGTCTAGGTACCTCA......CTCATGATCAGGATACT-CCTAGG3’5’CAGATCCATG3’5’GAATTC-引物A引物BCAGATCCATGGAATTC-5’GACT......GAGTACTAGTCCTATGAGGATCC3’第三轮-CCTAGG5’TCAGGATACT3’CTTAAGGTCTAGGTACCTCA......CTCATGA一目的基因的筛选与获取任务五：修饰PCR引物CAGATCCATGGAATTC-5’GACT......GAGTACTAGTCCTATGAGGATCC3’-CCTAGG5’TCAGGATACT3’CTTAAGGTCTAGGTACCTCA......CTCATGA5’3’TATCAGATCCATGGAGT......GAGTACTAGTCCTATGAGT3’5’ATAGTCTAGGTACCTCA......CTCATGATCAGGATACTCA一目的基因的筛选与获取一目的基因的筛选与获取思考：如何获得一只荧光鱼基因工程的操作步骤1.目的基因的筛选与获取2.基因表达载体构建（核心）3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测和鉴定一目的基因的筛选与获取任务六：目的基因的筛选和获取DNA是十分庞大的生物分子，各种生物基因组大小又各不相同，如人的基因组有3✖109个碱基对（bp)，水稻的基因组有4.3✖109个bp。每个DNA分子上含有很多个基因，而进行基因工程操作时，所需的目的基因通常只有一个或几个。一般来讲，一个基因有几百至几千个碱基对。因此，基因工程遇到的第一个问题就是要从庞大的基因组中筛选并分离出所需的目的基因如何寻找水母中的gfp基因？荧光蛋白对应的为gfp基因一目的基因的筛选与获取任务六：目的基因的筛选和获取活动2：获取水母中的gfp基因背景：水母中的gfp基因序列和位置未知方案1：构建基因文库途径1：正向从细胞中提取DNA基因组限制酶酶切DNA片段质粒限制酶酶切重组质粒导入基因组文库提取水母基因组DNA多种限制酶酶切拼接质粒，导入细菌中，保存为文库基因组文库一目的基因的筛选与获取任务六：目的基因的筛选和获取活动2：获取水母中的gfp基因背景：水母中的gfp基因序列和位置未知方案1：构建基因文库特定组织从细胞中提取mRNAmRNA导入逆转录限制酶酶切质粒限制酶酶切DNA连接酶cDNA文库途径2：逆向水母mRNA逆转录得到cDNA酶切拼接质粒，导入细菌中，保存为文库cDNA文库一目的基因的筛选与获取任务六：目的基因的筛选和获取(1)构建基因文库获取法适用：目的基因的序列完全未知基因组文库：将含有某种生物体内的DNA全部提取出来选用适当的限制酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段分别与载体连接起来，导入到受体菌的群体中储存，每个受体菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是，这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。①分类：基因组文库、cDNA文库cDNA文库：如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库一目的基因的筛选与获取任务六：目的基因的筛选和获取(1)构建基因文库获取法适用：目的基因的序列完全未知②区别：基因组文库cDNA文库一种生物的全部基因一种生物的部分基因①分类：基因组文库、cDNA文库③缺点：基因组文库：盲目性大、工作量大cDNA文库