（高清版）DB62∕T 4671-2023 草木楫香豆素含量的测定

DB62/T4671—20草木樨香豆素含量的测定2023-05-01实施2023-05-01实施 12规范性引用文件 13术语和定义 14原理 14.1高效液相色谱法 1 1 14.4近红外光谱法 14.5电化学分析法 15试剂或材料 25.1无水甲醇 25.2无水乙醇 25.3标准品溶液(对照品) 25.4标准品储备液 25.5微孔滤膜 2 25.7四丁基四氟硼酸铵 25.8N,N-二甲基甲酰胺 2 2 26.1高效液相色谱仪 26.2分析天平 2 26.4振荡器 36.5超声波清洗器 3 36.7紫外分光光度计 36.8近红外光谱仪 36.9电化学工作站 37试样制备与保存 3 38.1提取 38.2标准曲线的制定 39测定 49.1高效液相色谱法测定 49.2荧光光谱法测定 49.3紫外光谱法测定 5I9.4近红外光谱法测定 9.5电化学分析测定 510实验数据处理 5 6附录A(资料性)香豆素标准样品液相色谱图 附录B(资料性)香豆素标准样品荧光光谱图 附录C(资料性)不同样品香豆素近红外预测模型 9附录D(资料性)香豆素标准样品电化学差分脉冲伏安图 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由甘肃省林业和草原局提出并监督实施。本文件由甘肃省草业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：兰州大学草地农业科技学院、中国科学院兰州化学物理研究所、农业部牧草与草坪草种子质量监督检验测试中心(兰州)、兰州市农业科技研究推广中心。本文件主要起草人：张吉宇、董树清、王艺蒙、彭文静、闫启、王彦荣、邵士俊、王朋磊、张正社。本文件由兰州大学草地农业科技学院负责解释。仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本利用香豆素在激发波长为660nm,发射波长660nm～750nm的荧光强度进行荧光光谱分析测定。利用香豆素中的化学键的泛频振动或转动对近红外光的吸收特性，以漫反射或透射方式获得在近125.3标准品溶液(对照品)称取相应重量的四丁基四氟硼酸铵，以N,N-二甲基甲酰水浴锅控温范围：0℃~99℃。6.4振荡器转速范围：Orpm～3000rpm。6.5超声波清洗器超声频率：40kHz。6.6荧光光谱仪发射波长范围：350nm～800nm。6.7紫外分光光度计波长范围：300nm～600nm。6.8近红外光谱仪波长范围：1400nm～2600nm。6.9电化学工作站三电极系统：工作电极(玻碳电极)、对电极、参比电极。转换速率：0V/s~1V/s。7试样制备与保存按GB/T14699.1和NY/T2129-2012的规定采集牧草样品。将鲜草样品于常温通风干燥或自然晒干制成干草样品，用四分法缩至50g~100g,经粉碎机粉碎，全部通过0.45mm孔径筛，常温储存备用。8分析步骤8.1提取称取干草样品1g(精确到0.001g)试样于25mL离心管中，加入25mL80%乙醇溶液，振荡10min,常温下超声提取30min后过滤，共提取2次，合并滤液，滤液减压浓缩至干，残渣用甲醇溶解并定容至50mL,8.2标准曲线的制定8.2.1高效液相色谱法分别准确吸取标准品储备液0.5mL、1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL,加甲醇分别定容至10mL。准确吸取上述定容液体20μL,在确定色谱条件下进样，得到液相色谱图(附录A)。以对照品峰面积(Y)作为纵坐标，进样浓度(X)为横坐标作图，得线性回归方程。34取10uL上述储备液，用甲醇定容至5mL,设定激发波长(Ex)为660nm,采样步径(Inc)为5nm,激发狭缝(ExSlit)为2nm;发射波长的(Em)范围取650nm～750nm,采样步径(Inc)为5nm,发 (EmSlit)为2nm;积分时间(integrationtime)设置为0.2s,于此条件下得到荧光图谱(附录B),以定紫外吸收，得到紫外吸收谱值，以吸光度(Y)作为纵坐标，进样浓度(X)为横坐标作图，得线性对应关系，建立预测模型(附录C)。以样品的近上述条件下用差分脉冲伏安法(DPV)测定不同样品的氧化峰电流(附录D)。为保持电极的重现性和稳定性，每个样品扫描结束后，要重新超声清洗后再检测。以电流(Y)作为纵坐标，进样浓度(X)荧光光谱激发波长660nm,发射波长650nm～750nm,狭缝2nm,步径5nm,样品量3mL～4mL。9.3.1紫外光谱法参考条件紫外波长范围：300nm～800nm,样品量3mL～4mL。9.3.2紫外光谱法定量测定9.4近红外光谱法测定9.5电化学分析测定9.5.2电化学定量测定Ci试样溶液中香豆素浓度，由标准曲线中查得，单位为微克每毫升(μg/mL);Vi——提取液体积，单位为毫升(mL);V——提取液总体积，单位为毫升(mL);n——稀释倍数；56在相同条件下获得的同一样品溶液三次独立重复测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。(资料性)香豆素标准样品液相色谱图香豆素标准样品液相色谱图如图A.1所示。图A.1不同浓度香豆素标准品的液相色谱图78DB62/T4671—2023(资料性)——0.5040μg/mL波长Wavelength/nmDB62/T4671-2023(资料性)不同样品香豆素近红外预测模型不同样品香豆素近红外预测模型如图C.1所示。77050.403020.1Equatory=0.%*x+