八猪瘟防治技术规范 (二)

八、猪瘟防治技术规范

猪瘟（Classicalswinefever,CSF）是由黄病毒科瘟病毒属猪

瘟病毒引起的一种高度接触性、出血性和致死性传染病。世界动物卫

生组织（OIE）将其列为必须汇报的动物疫病，我国将其列为一类动物

疫病。

猪瘟-（Glassieal—swine-£€veFrCSFQ是,由黄病毒科瘟病毒属,猪

瘟病毒引起的一种高度接触性、出血性和致死性传染病。世界动物卫

生组织（OIE）将其列为必须汇报的动物疫病，我国将其列为一类动物

为及时、有效地防止、控制和扑灭猪瘟，根据《中华人民共和国

动物防疫法》、《重大动物疫情应急条例》和《国家突发重大动物疫情

应急预案》及有关法律法规，制定本规范。

为及时、有效地防止、控制和扑灭猪瘟，根据《中华人民共和国

应急预案》及有关R勺法律法规，制定木规范u

1合用范围

本规范规定了猪瘟的诊断、疫情汇报、疫情处置、疫肯监测」防

止措施、控制和消灭原则、控制和消灭原则箜。

本规范合用于中华人民共和国境内一切从事猪（含驯养的野猪）

时喂养、经营及其产品生产、经营，以及从事动物防疫活动日勺单位和

个人。

本规范合用于中华人民共和固境内一切从事猪（含驯养的野猪）

的喂养、经营及其产品生产、经营，以及从事动物防疫活动的单位和

人人

I/Xc

2诊断

根据本病流行病学特点、临床症状、病理变化可作出初步诊断，确

诊需做病原分离与鉴定。

根据木病流行病学特点、临床症状、病理变化可作出初步诊断，

确/诊需IH4做Izv病ft4原分/q离।与v鉴v.■n*/定Av

2.1流行特点

猪是本病唯一的自然宿主，发病猪和带毒猪是本病日勺传染源，不

一样年龄、性别、品种的猪场易感。一年四季均可发生。感染猪在发

病前即能通过度泌物和排泄物排毒，并持续整个病程。与感染猪直接

接触是本病传播的重要方式，病毒也可通过精液、胚胎、猪肉和沿水

等传播，人、其他动物如鼠类和昆虫、器具等均可成为重要传播媒介。

感染和带毒母猪在怀孕期可通过胎盘将病毒传播给胎儿，导致新生仔

猪发病或产生免疫耐受。

一是木病唯一的自然宙主，发病猪和带等猪是木病的传染源,不

一样年龄、性别、品种的猪用易感二一年四季均可发生。感染猪在发

病前即能通过度泌物和排泄物排毒，并持续整•个病程U与感染猪直接

接触是木病传播的重要方式，病毒也可通过精液、胚胎、佬肉和沿水

等传播，人、其他动物如鼠类和昆虫、器具等均可成为重要传播媒介b

感染和带毒母猪在怀孕期可追过胎盘将病毒传播绐胎儿，导致新生仔

猪发病或产生免疫耐受。

2.2临床症状

2.2.1本规范规定本病潜伏期为3T0天、隐性感染可长期带

毒。

2.2.1本规范规定本病潜伏期为3-10天，隐性感染可长期带毒°

根据临床症状可将本病分为急性、亚急性、慢性和隐性感染四种

类型。

2.2.2经典症状

2.2.2.1发病急、死亡率高；

2.2.2.2体温一般升至4UC以上、厌食、畏寒；

2.2.2.3先便秘后腹泻，或便秘和腹泻交替出现；

2.2.2.4腹部皮下、鼻缭、耳尖、四肢内侧均可出现紫色出血斑

点，指压不褪色，眼结膜和口腔黏膜可见出血点。

2.2.2.4腹部皮下、鼻虢、耳尖、四肢内侧均可出现紫色出血斑

点，指压不褪色，眼结腹和口腔黏腹可见出血点。

2.3病理变化

2.3.1淋巴结水肿、出血，展现大理石样变；

2.3.1淋巴结水肿、出由，展现大理石样变：

2.3.2肾脏呈土黄色，表面可见针尖状出血点；

2.3.2肾脏呈土黄色,表面可见针尖状出血点：

2.3.3全身浆膜、黏膜和心脏、膀胱、胆囊、扁桃体均可见出血

点和出血斑，脾脏边缘出现梗死灶；

2.3.3仝身浆膜、黏腹和心脏、膀胱、胆囊、扁桃体均可见出血

点和出血斑，脾脏边缘出现梗死灶：

2.3.4脾不肿大,边缘有暗紫色突出表面的出血性梗死：

2.3.4脚不肿大，边缘有暗紫色突出表面的出女性模死l

2.3.5慢性猪瘟在回肠末端、盲肠和结肠常见“钮扣状”溃疡。

2.4试验室诊断

试验室病原学诊断必须在对应级别的生物安全试验室进行。

2.4.1病原分离与鉴定

2.4.1.1病原分离、鉴定可用细胞培养法（见附件1）;

2.4.L2病原鉴定也可采用猪瘟荧光抗体染色法，细胞浆出现

特异性的荧光（见附件2）；

异性日勺荧光见附件2）：

2.4.1.3兔体交互免疫试验（附件3）；

2.4.1.4猪瘟病毒反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）：重要用于

临床诊断与病原监测（见附件4）。

2.4.1.4猪瘟病毒反转录聚合酶隹式反应（RT-PCR）：重要用于

临床诊断与病原监测（见附件4工

2.4.1.5猪痕抗原双抗体夹心EUSA检测法：重要用于临床诊

断与病原监测（见附件5）。

2.4.1.5猪瘟抗原双抗体夹心ELISA检测法：重要用于临床诊断

与病原监测（见附件5）。

2.4.2血清学检测

2.4.2.1猪瘟病毒抗体咀断ELISA检测法（见附件6）；

2.4.2.2猪瘟荧光抗体病毒中和试验（见附件7）：

—猪-瘟美光抗体病毒病和试脸—J见附件力一

2.4.2.3猪瘟中和试验措施（见附件8）。

2.5成果鉴定

2.5.1疑似猪瘟

2-TTT-2「4-仇-猪瘟流行病学特点、临床症状

和病理变化。

2.5.2确诊

非免疫猪符合成果鉴定2.5.1,且符合血清学诊断2.4.2.1、

2.42.2、2.4.2.3之一，或符合病原学诊断2.4.1.1、2.4.1.2、

2.4.1.3、2.4.1.4、2.4.1.5之一的；

非免疫猪符合成果鉴定2.5.1,且符合血清学诊断2.4.2.1,、

2.42.2,,2.4.2.3,之一:二或符合病原学诊断2.41.1,,2.4.1.2,,

2.41.3,-2.4.1.4,-2.4L5之一的：

免疫猪符合成果2.5.1,且符合病原学诊断2.4.1.1、2.4.1.2、

2.4.1.3、2.4.1.4、2.4.1.5之一的。

免疫猪符合成果2.5.1,且符合病原学冶断2.4.1.1,,2.4.1.2一

2.4.1.3,」2.4.1.4,-2.4.1.5之一的6

3疫情汇报

3.1任何单位和个人发现患有本病或疑似本病的猪：都应当立

即向当地动物防疫监督机构汇报。

向当地动枷先疫监督机构汇报6

3.2当地动物防疫监督机构接到汇报后，按国家动物疫情汇报

管理日勺有关规定执行。

3.且当地动物防疫监督机构接到汇报后,按国家动物疫情汇报.管

4疫情处理

根据流行病学、临床症状、剖检病变，结合血清学检测做出的临

床诊断成果可作为疫情处理的根据。

根据流行病学、临床症状、剖检病爽，结合血消学检测做出的临

床诊断成果可作为疫情处理的根据u

4.1当地县级以上动物防疫监督机构接到可疑猪瘟疫情汇报后，

应及时派员到现场诊断，根据流行病学调查、临床症状和病理变化等

初步诊断为疑似猪瘟时，应立即对病猪及同群猪采用隔离.消毒、限

制移动等临时性措施。同步采柒病料送省级动物防疫监督机构试验室

确诊，必要时将样品送国家猪瘟参照试验室确诊。

4.1当地县级以上动物方疫监督机构接到可疑猪瘟疫情汇报后,

应及时派员到现场诊断，根据流行病学调查、临床症状莉病理变化等

初步诊断为疑似猪瘟时，应立即对病猪及同群猪采用隔离.消毒、限

制移动等临时性措施。同步采集病料送省级动物防疫监督机构试脸室

确诊，必要时将样品送国家猪瘟参照试脸室确诊©

4.2确诊为猪瘟后，当地县级以上人民政府兽医主管部门应当

立即划定疫点、疫区、受威胁区，并采用对应措施；同步，及时报请

同级人民政府对疫区实行封锁，逐层上报至国务院兽医主管部门，并

通报毗邻地区。国务院兽医行政管理部门根据确诊成果，确认猪瘟疫

工

即划定疫点、疾美威-肋名小采用药■应-措施l同多T—笑时报蒋同-

级人民■跌府■对赛区实行邦铭一逐层上报至国务院兽医■主管部目小通

报毗郤地区°国务院兽医行政管理部门根据确诊成果，确认猪瘟疫情°

4.2.1划定疫点、疫区和受威胁区

疫点：为病猪和带毒猪所在的地点。一般指病猪或带毒猪所在的

猪场、屠宰厂或经营单位，如为农村散养，应将自然村划为疫点。

疫点：为病猪和带毒猪所在R勺地点L一般指病猪或带毒猪所在的

猪场、屠宰厂或经营单位，如为农村散养，应将自然村划为疫点U

疫区：是指疫点边缘外先3公里范围内区域。疫区划分时，应注

意考虑当地的喂养环境和天然屏障（如河流、山脉等）等原因。

疫区：是指疫点边缘外爽3公里范围内区域。疫区划分时，应注

意考虑当地的喂养环境和天然屏障（如河流、山脉等）等原因。

受威胁区：是指疫区外走5公里范围内的区域。

受威胁区：是指疫区外"公里范围内的区域b

4.2.2封锁

由县级以上兽医行政管理部门向本级人民政府提出启动重大动物

疫情应急指挥系统、应急预案和对疫区实行封锁的提议，有关人民政

府应当立即做出决定。

由县级以上兽医行政管理部门向小务田效存提出启动重关动物・

疫情应■急指•挥系统b应急预案和•对族区实存势锁的提诏一存关人民峡

4.2.3对疫点、疫区、受威胁区采用的措施

疫点：扑杀所有的病猪和带毒猪，并对所有病死猪、被扑杀猪及

其产品按照GB16548规定进行无害化处理；对排泄物、被污染或也许

污染饲料和垫符、污水等均需进行无害化处理；对被污染的物品、交

通工具、用品、禽舍、场地进行严格彻底消毒（见附件9）；限制人员

出入，严禁车辆进出，严禁猪只及其产品及也许污染的物品运出。

疫点：扑杀所有的病猪和带毒猪，并对所有病死猪、被扑杀猪及

其产品按照GB16548规定进行无害化处理：对排泄物、被污染或也许

污染饲料和垫料、污水等均需进行无害化处理：对被污染的物品、交

逋工具、用品、禽舍、场地进行严格彻底消毒（见附件9）；限制人员

出入,严禁车辆进出.严禁猪只及其产品及也许污染的物品运出。

疫区：对疫区进行封锁，在疫区周围设置警示标志，在出入疫区

的交通路口设置动物检疫消毒站（临时动物防疫监督检查站），对出入

的人员和车辆进行消毒；对易感猪只实行紧急强制免疫，保证到达免

疫保护水平；停止疫区内猪及其产品的交易活动，严禁易感猪只及其

产品运出；对猪只排泄物、被污染饲料、垫料、污水等按国家规定原

则进行无害化处理；对被污染的物品、交通工具、用品、禽舍、场地

进行严格彻底消毒。

疫区:一寸疾区进行封锁।在疫区■周国■谯置警异标志，在出入疫区

的交通路口设置动物桧疫消毒站（临时动物防疫监督检查站），时出入

则进行无害化处理；对被污染日勺物品、交通工具、用品、禽舍、场地

进行严格彻底消毒。

受威胁区：对易感猪只（未免或免疫未到达免疫保护水平）实行紧

急强制免疫，保证到达免疫俣护水平；对猪只实行疫情监测和免疫效

果监测。

受威胁区：对易感猪只（未免或免疫未到达免疫保护水平）实行紧

急强制免疫，保证到达免疫俣护水平：对猪只实行疫情监测和免疫效

果监测。

4.2.4紧急监测

对疫区、受威胁区内的猪群必须进行临床检查和病原学监测。

4.2.5疫源分析与追踪调查

根据流行病学调查成果，分析疫源及其也许扩散、流行的状况。

对也许存在的传染源，以及在疫情潜伏期和发病期间售（/运）出的猪

只及其产品、可疑污染物（包括粪便、垫料、饲料等）等应当立即开

展追踪调查，一经查明立即按照GB16548规定进行无害化处理。

根据流年病学调查成果l分柝疫.源及其也许护散流存的状况k

对也许存在的传染源，以及在疫情潜伏期和发病期间售（/运）出的猪

只■及其产品可-疑浮染物-包括粪便、垫料、饲料等3一等应-当立即.拜

展追踪调查，一经查明立即按照-GB16548-规定避存无害生处理-

4.2.6封锁令日勺解除

疫点内所有病死猪、被扑杀的猪按规定进行处理，疫「内没有新

的病例发生，彻底消毒10天后，经当地动物防疫监督机构审验合格,

当地兽医主管部门提出申请，由原封锁令公布机关解除封锁。

疫点内所有病死猪、被扑杀H勺猪按规定进行处理，疫区内没有新

的病例发生，彻底消毒10天后，经当地动物防疫监督机构审睑合格，

当地善医主管部门提出申请，由原封锁令公布机关解除封锁b

4.2.7疫情处理记录

对处理疫情日勺全过程必须做好详细日勺记录（包括文字、图片和影

像等），并归档。

对处理疫情的仝过程必须做好详细的记录（包括文字、图片和影

像等），笄归档“

5防止与控制

以免疫为主,采用“扑杀和免疫相结合”的综合性防治措施。

以免疫为主，采用“扑杀和免疫相结合”的综合性防治措施。

5.1喂养管理与环境控制

喂养、生产、经营等场所必须符合《动物防疫条件审核管理措施》

（农业部口15号令）规定的动物防疫条件，并加强种猪调运检疫管理。

喂，养、生产、经营等场所必须符合《动物防疫条件审核管理措施》

,农-业部日H号令工规-定晦动物防疫条俗.-并加强种猪-调运桧疫借■理p

5.2消毒

各喂养场、屠宰厂（场）、动物防疫监督检查站等要建立严格日勺卫

生（消毒）管理制度，做好杀虫、灭鼠工作（见附件9）。

各喂养场、屠宰厂（场）、动物防疫监督检查站等要建立严格H勺卫

生（消毒）管比制度，做好：猪国、加工厂、用品、与栖、粪便、道

路和人员等应进行定期的严格消毒、杀虫、灭鼠工作（见附件9上

5.3免疫和净化

5.3.1免疫

国家对猪瘟实行全面免疫政策。

防止免疫按农业部制定的免疫方案规定日勺免疫程序进行。

所用疫苗必须是经国务院兽医主管部门同意使用的猪痘疫苗。

5.3.2净化

对种猪场和规模养殖场时种猪定期采样进行病原学检测，对检测

阳性猪及时进行扑杀和无害化处理，以逐渐净化猪瘟。

对种猪场和规模养殖场时种猪定期采样进行病原学检测，对检测

阳性猪及时进行扑杀和无害化处理，以逐渐净化猪瘟6

5.4监测和预警

5.4.1监测措施

非免疫区域：以流行病学调查、血清学监测为主，结合病原鉴定。

非免疫区域：以流行病学调查，血清学监测为主，结合病原鉴定6

免疫区域：以病原监测为主，结合流行病学调查、血清学监测。

免疫区域：以病原监测为主，结合流行病学调查、血清学监测U，

5.4.2监测范围、数量和时间

对于各类种猪场每年要逐头监测两次；商品猪场每年监测两次,

抽查比例不低于0.1%,最低不少于20头；散养猪不定期抽查。或按

照农业部年度监测订划执行。

对于各类种猪场每年要逐头监测两次：商品猪场每年监测两次，

抽查比例不低于0.筮，最低不少于20头：散养猪不定期抽查°或按

照农业部年度监测计划执行u

5.4.3监测汇报

监测成果要及时汇总，由省级动物防疫监督机构定期上报中国动

物疫病防止控制中心。

监测成果要及时汇总,由省级动物防疫监督机构定期上报中国动

物疫病防止控制中心6

5.4.4预警

各级动物防疫监督机构对监测成果及有关信息进行风险分析,做

好预警预报。

好预警预报。

5.5消毒

喂养场、屠宰厂（场）、交易市场、运送工具等要建立并实行严格

的消毒制度。

5.6检疫

5.6.1产地检疫

生猪在离开喂养地之前，养殖场/户必须向当地动物防疫监督机

构报检。动物防疫监督机构接到报检后必须及时派员到场/户实行检

疫。检疫合格后,出具合格证明；对运载工具进行消库,出具消毒证

明，对检疫不合格日勺按照有关规定处理。

生猪在离开喂养地之前，养殖场/户必须向当地动物防疫监督机构

报检,动物防疫监督机构接到报检后必须及时派员到场/户实行检疫b

检疫合格后，出■具合槌诿明:凸运载工具进行消毒，出具消毒证明，

对检疫不合格日勺按照有关规定处理U

5.6.2屠宰检疫

动物防疫监督机构的检疫人员对生猪进行验证查物，合格后方可

入厂/场屠宰。检疫合格并加盖（封）检疫标志后方可出厂/场，不合

格的按有关规定处理。

动物防疫监督机构的检疫人员对生猪进行验证查物，合格后方可

入厂/场屠宰。检疫合格并加盖（封）桧疫标志后方可出厂/场，不合

格的按有关规定处理U

5.6.3种猪异地调运检疫

跨省调运种猪时，应先到调入地省级动物防疫监督机构办理检疫

审批手续，调出地进行检疫，检疫合格方可调运。抵达后须隔离喂养

10天以上，由当地动物防疫监督机构检疫合格后方可投入使用。

跨省调运种猪时，应先到调久地省级动物防疫监督机构办理检疫

审批手续，调出地按照进行检疫，检疫合格方可调运。抵达后须隔离

喂养10天以上，由当地动物方疫监督机构检疫合格后方可投入使用°

6控制和消灭原则

6.1免疫无猪瘟区

6.1.1该区域首先要到达国家无规定疫病区基本条件。

6.1.2有定期、迅速日勺动物疫情汇报记录。

6.1.3该区域在过去3年内未发生过猪瘟。

6.1.4该区域和缓冲带实行强制免疫，免疫密度100」所用疫

苗必须符合国家兽医主管部门规定。

6.1.4该区域和缓冲带实行强制免疫，免疫密度1009所用疫

苗必须符合国家醇医主管部门规定U

6.1.5该区域和缓冲带须具有运行有效日勺监测体系，过去2年

内实行疫病和免疫效果监测，未检出病原，免疫效果确实。

6.1.5该区域和缓冲带须具有运行有效的监测体系，过去2年内

实行疫病和免疫效果监测，未检出病原，免疫效果确实6

6.1.6所有的汇报，免疫、监测记录等有关材料详实、精确、齐

全。

6.1.6所有的汇报,免疫、监测记录等有关材料详实、精确、齐

—

若免疫无猪瘟区内发生猪瘟时，最终一例病猪扑杀后12个月，

经实行有效日勺疫情监测，确认后方可重新申请免疫无猪瘟区。

6.2非免疫无猪瘟区

6.2.1该区域首先要到达国家无规定疫病区基本条件。

6.2.2有定期、迅速日勺动物疫情汇报记录。

6.2.3在过去2年内没有发生过猪瘟，并且在过去12个月内,

没有进行过免疫接种；此外，该地区在停止免疫接种后，没有引进免

疫接种过的猪。

6.2.3在过去2年内没有发生过猪瘟，并且在过去12•个月内，

没有进行过免疫接种：此外，该地区在停止免疫接种后，没有引进免

疫接种过的猪。

6.2.4在该区具有有效的监测体系和监测区，过去2年内实行

疫病监测，未检出病原。

6.2.4在该区具有有效的监测体系和监测区，过去2年内实行疫

病监测，未检出病原6

6.2.5所有的汇报、监测记录等有关材料详实、精确、齐全。

若非免疫无猪瘟区发生猪瘟后，在采用扑杀措施及血清学监测日勺

状况下，最终一例病猪扑杀后6个月；或在采用扑杀措施、血清学监

测及紧急免疫的状况下，最终一例免疫猪被屠宰后6个月，经实行有

效的疫情监测和血清学检测确认后，方可重新申请非免疫无猪瘟区。

附件1

若非免疫无猪瘟区发生猪瘟后，在采用扑杀措施及血清学监测的

状况下，最终一例病猪扑杀后6•个月：或在采用扑杀措施、血消学监

测及紧急免疫R勺状况下，最终一例免疫猪被屠宰后6•个月，经实行有

效的疫情监测和血清学检测确认后,方可重新申请非免疫无猪瘟区b

病毒分离鉴定

采用细胞培养法分离病毒是诊断猪瘟的一种敏捷措施。一般使用

对猪瘟病毒敏感的细胞系如FK-15细胞等，加入2%扁桃体、肾脏、脾

脏或淋巴结等待检组织悬液于培养液中。37（培养48〜72小时后用荧

光抗体染色法检测细胞培养物中日勺猪瘟病喜。

采用细胞培养法分离病库是诊断猪瘟日勺一种敏捷措施…一般使用，

脏或淋巴结等待检组织悬液于培养液中537美培养48、72小时后用荧

环节如下：

环节如下：

1.制备抗生素浓缩液（青霉素10000IU/mL、链霉素1C0001以mL、

卡那霉素和制霉菌素5000IU/mL）,小瓶分装，-2CTC保留。用时融化。

1.制备抗生素浓缩液（青窗素10000IU/矶、链/素H）OOOIL：/mL、

卡那霉素和制霉菌素5000IU/mL）,小瓶分装，-20℃保留°用时融化。

2.取1〜2g待检病料组织放入灭菌研钵中，剪刀剪碎，加入少许

无菌生理盐水，将其研磨勺浆；再加入Hank'S平衡盐溶液或细胞培

养液，制成20%（\v/v）组织悬液：最终按1/10的比例加入抗生素浓缩

液,混匀后室温作用1小时；以1000g离心15分钟，取上清液备用。

2.取1、2g待检病料组织放入灭菌研钵中，剪刀剪碎，加入少许

无菌生理盐水，将其研磨匀浆：再加入Hank1型平衡盐溶液或细胞

培养液，制成20%（w/v）组织悬液；最终按1/10的比例加入抗生索液

缩液，混勺后室温作用1小时：以1000g离心15分钟，取上清液备用。

3.用胰酶消化处在对数生长期的PKT5细胞单层，将所得细胞悬

液以1000g离心10分钟，再用一定量EMEM生长液［含5%胎牛血清（无

BVDV抗体），56℃灭活30分钟］、0.3%谷氨酰胺、青霉素100.U/mL、

链霉素100.U/mL）悬浮，使细胞浓度为2义106/矶。

”-用■胰■酶消化处在对数生长期的PKT5细胞单层，将所得细胞悬

液-I头4。。施-离心TO-分钟-厂用用-r^g-EME出生长■液上含-5%胎牛血清■（次・

BVDV抗体356℃灭活30分钟］、0.3%谷氨酰胺、青霉素T4Q4弘

链霉素1001U/矶）悬浮，使细胞浓度为2工1。64

4.9份细胞悬液与1份上清液混合，接种6〜8支含细胞玻片日勺菜

顿氏管（loiwhton's）（或其他合适日勺细胞培养瓶），每管02mL；同步

设3支莱顿氏管接种细胞悬液作阴性对照；另设3支莱顿氏管接种猪

瘟病毒作阳性对照。

莱顿氏管（leighton'6（或其他合适的细胞培养瓶），每管0.2疝：同

步次3支莱顿氏管接种细胞反液作阴性对照：另设3支莱顿氏管接种

格疸病且作阳林耐初

7wZiiil7L'FII7*4|_1_Ja

5.经培养24、48、72小时，分别取2管组织上清培养物及1管阴

性对照培养物、1管阳性对照培养物，取出细胞破片，以矫酸缓冲盐

水（PBS液，pH7.2,0.01M）或生理盐水洗涤2次，每次5分钟，用

，令丙酮（分析纯）固定10分钟，喙干，采用猪瘟病毒荧光抗体染色法进

行检测（见附件2）。

5.经培养24、48、72小时，分别取2管组织上清培养物及1管

阴性对照培养物、1管阳性对照培养物，取出细胞玻片，以磷酸缓冲

盐水（PBS液，pH7.2,0.01M）或生理盐水洗涤2次，每次5分钟，

用冷丙酮（分析纯）固定10分钟，晾干，采用猪瘟病毒荧光抗体染色法

进行检测（见附件2九

6.根据细胞玻片猪瘟荧光抗体染色强度，鉴定病毒在细胞中日勺增

殖状况，若荧光较弱或为阴性，应按环节4将组织上清细胞培养物进

行病毒盲传。

临床发病猪或疑似病猪日勺全血样是猪瘟初期诊断样品。接种细胞

时操作程序如下：取-2（rc冻存全血样品置379水浴融化；向24孔板

每孔加300微升血样以覆盖对数生长期的PK-15单层细胞；37C吸附

2小时。弃去接种液，用细胞培养液洗涤细胞二次，然后加入EMEM维

持液，37（培养24至48小时后，采用猪瘟病毒荧光抗体染色法检测

（见附件2）。

临床发病猪或疑似病猪的仝血样是猪瘟初期诊断样品,接种细胞

时操作程序如下：取-20℃冻存全血样品置37℃水浴融化：向24孔板

得孔加300微升血样以覆盖对数生长期的PKT5单层细胞；37”C吸附

2小时。弃去接种液，用细胞培养液洗涤细胞二次，然后加入EMEM维

持液，37毛培养24至48小时后，采用猪瘟病毒荧光抗体染色法检测

（见附件2）。

附件2

猪瘟荧光抗体染色法

荧光抗体染色法迅速、特异，可用于检测扁桃体等组织样品以及

细胞培养中日勺病毒抗原。操作程序如下：

细魏培r知中邱喷毒抗原°操作程序如下：

1样品的采集和选择

1.1活体采样：运用扁桃体采样器（鼻捻子、开口器和采样枪）。

采样器使用前均须用3%氢氧化钠溶液消毒后经清水冲洗。首先固定活

猪的上唇，用开口器打开口腔，用采样枪采用扁桃体样品，用灭菌牙

签挑至灭菌离心管并作标识。

1.1活体采样：运用扁桃体采样器（鼻捻子、开门器和采样枪九

采样器使用前均须用3%氢氧化钠溶液消毒后经清水冲洗u首先固定活

猪的上唇,用开n器打开n腔,用采样枪采用扁桃体样品.用灭菌牙

签挑至灭菌离心管并作标识U

1.2其他样品：剖检时采用的病死猪脏器，如扁桃体、肾脏、脾

脏、淋巴结、肝脏和肺等，或病毒分离时待检的细胞玻片。

1.2其他样品：剖检时采用的病死猪脏器，如扁桃体、肾脏、肿

脏、淋巴结、肝脏和肺等脏器，或病毒分离时待检R勺细胞强片6

1.3样品采集、包装与运送按农业部有关规定执行。

2检测措施与鉴定

2.1措施：将上述组织制成冰冻切片，或待检的细胞培养片（见

附件1）,将液体吸干后经冷丙酮固定5〜10分钟，日京干：，滴加猪瘟

荧光抗体覆盖于切片或细胞片表面，置湿盒中37T作用3。分钟。然

后用PBS液洗涤，自然干燥。用碳酸缓冲甘油（pH9.0~9.5,0.5M）

封片，置荧光显微镜下观测。必要时设置克制试验染色片，以鉴定荧

光的特异性。

2.1措施：将上述组织制成冰冻切片，或待检的细胞培养片（见

附件1）,将液体吸干后经冷丙酮固定5〜10分钟，晾千$滴加猪瘟美

用PBS液诜涤，自然干燥。用碳酸缓冲甘油（pH9.0~9.5,0.5M）封

的特异性°

2.2鉴定：在荧光显微镜下，见切片或细胞培养物（细胞盖片）

中有胞浆荧光，并由克制试验证明为特异的荧光，判猪瘟阳性；无荧

光判为阴性。

中有胞浆荧光］并由克制试验证明为特异R勺荧光,判猪瘟阳性；无英

光判为阴性。

2.3荧光克制试验：将两组猪瘟病毒感染猪的扁桃体冰冻切片,

分别滴加猪瘟高免血清和健康猪血清（猪瘟中和抗体阴性），在湿盒

中37C作用30分钟，用生理盐水或PBSSH7.2）漂洗2次，然后进行

荧光抗体染色。经用猪瘟高免血清处理的扁桃体切片，隐腐上皮细胞

不应出现荧光，或荧光明显减弱；而用阴性血清处理的切片，隐高上

皮细胞仍出现明亮日勺黄绿色烫光。

附件3

2.3荧光克制试睑：将两组猪瘟病毒感染猪R勺扁桃体冰冻切片，

分别滴加猪瘟高免血清和健康猪血清(猪瘟中和抗体阴性)，在湿盒中

37毛件用30分钟，用生理盐水或PBS(pH7.2)漂洗2次，然后进行荧

光抗体染色°经用猪瘟高兔血清处理的扁桃体切片，隐窝上皮细胞不

应出现荧光，或荧光明显减弱：而用阴性血清处理的切片.隐窝上皮

细胞仍出现明亮的黄绿色荧光"

兔体交互免疫试验

本措施用于检测疑似猪瘟病料中的猪瘟病毒。

1试验动物

家兔1.5〜2kg、体温波动不大的大耳白兔，并在试验前1天测

基础体温。

基础体温一

2试验操作措施

将病猪日勺淋巴结和脾脏，磨碎后用生理盐水作1：10稀释，对3

只健康家兔作肌肉注射，5mL/只，另设3只不注射病料日勺对照兔，间

隔5天对所有家兔静脉注射L20日勺猪瘟兔化病毒（淋巴脾脏毒），1mL/

只，24h后，每隔6小时测体温一次，持续测96小时，对照组2/3出

现定型热或轻型热，试验成立。

将病猪R勺淋巴结和脾脏，磨碎后用生理盐水件1：10稀。，对3

只健康家兔件肌肉注射，5mL/只，另设3只不注射病料R勺对照兔,问

隔5天对所有家兔静脉注射1:20H勺猪瘟兔化病毒（淋巴脾脏毒），1mL/

只，24h后，每隔6小时测体温一次，持续测96小时，对照组2/3出

现定型热或轻型热,试脸成立“

3兔体交互免疫试验成果鉴定

接种病料后体温反接种猪瘟兔化弱毒后体温成果鉴定

应反应

——含猪瘟病毒

—+不含猪瘟病毒

+—含猪瘟兔化病毒

++含非猪痣病毒热原性物

质

注：“+”表达多于或等于三分之二的动物有反应。

注：“+”表达多于或等于三分之二的动物有反应u

附件4

猪瘟病毒反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)

RT-PCR措施通过检测病毒核酸而确定病毒存在，是一种特异、敏

感、迅速日勺措施。在RT-PCR扩增的特定基因片段日勺基础上，进行基因

序列测定，将获得的基因信息与我国猪瘟分子流行病学数据库进行比

较分析，可深入鉴定流行毒株的基因型，从而追踪流行毒株的传播来

源或预测预报新口勺流行毒株。

RT-PCR措施通过检测病毒核酸而确定病毒存在，是一种特异、敏

感、迅速的措施。在RT-PCR扩增的特定基因片段的基础上，进行基因

序列测定，将获得的基因信息与我国猪瘟分子流行病学数据库进行比

校分析，可深入鉴定流行毒樵的基因型，从而追踪流行毒株的传播来

源或预测预报新的流行毒株&

1材料与样品准备

1.1材料准备：本试验所用试剂需用无RNA酶污染的容器分装；

多种离心管和带滤芯吸头需无RXA酶污染；剪刀、镜子和研钵器须经

干烤灭菌。

1.1材料准备：木试脸所用试剂需用无RM\静污染的,容器分装；

多种离心管和半滤芯吸头需丢RNA旃污染；剪刀、镶子和研钵器须经

1.2样品制备：按1：5(TV/V)比例，取待检组织和PBS液于研

钵中充足研磨，4℃,lOOOg离心15分钟，取上清液转入无RNA酶污

染的离心管中，备用；全血采用脱纤抗凝备用；细胞培养物冻融3次

备用；其他样品酌情处理。制备日勺样品在2〜8℃保留不应超过24小

时，长期保留应小分装后置-70℃如下，防止反复冻融。

染的离心管中，各用：全血采用脱纤抗凝备用；细胞培养物冻融3次

备用：其他样品酌情处理。制备的样品在2、8(保留不应超过24小

时，长期保留应小分装后置-7(TC如下，防止反复冻融，

2RNA提取

2.1取1.5矶离心管，每管加入800uLRNA提取液（通用

Trizol）和被检样品200uL,充足混匀，静置5分钟。同步设阳性和

阴性对照管，每份样品换一种吸头。

2^4―取1.5mL离心管，各管加入800uLRNA提取液（通用Trizol）

和被检样品200uL,充足混勾、一静置■导分钟l同步设-阳•性和•阴性对照

管，每份样品换一种吸头6

2.2加入200HL氯仿，充足混匀，静置5分钟，4七、1g离心15・带格式的：缩进：左侧：0.85显米，制衣位：6字

符,左对齐：

带格式的：项目符号和编号1

分钟。

2.22.2加入20011L氤仿，充足混匀，静置5分1，4℃、S

离心-15诗钟b

2.3取上清约500M,（注意不要吸出中间层）移至新离心管中，

加等量异丙醇，颠倒混匀，室温静置10分钟，41、相离心10分钟。

2.3取上清约500»1,（注意不要吸出中间层移至新漓7普中T

加等量异丙醇，颠倒混勺，室温静置10分钟，4℃、1g离心10分钟&

2.4小心弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；加入1000HL

75%乙醇，颠倒洗涤，4℃、心离心10分钟。

乙醇，颠倒洗涤，4美、1g离心10分钟°

2.5小心弃L消，倒置丁吸木纸L,沾/液体；400。n离心10

分钟，将管壁上残存液体甩到管底部，小心吸干上清，吸头不要碰到

有沉淀的一面，每份样品换一种吸头，室温干燥。

2.5小心弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体：4000g离心10

分钟，将管壁上残存液体甩到管底部，小心吸干上清，吸头不要碰到

有沉淀的一面，每份样品换一种吸头，室温干燥,

2.6加入10uLDEPC水和10URNasin,轻轻混匀，溶解管壁上

日勺RNA,4000《离心10分钟，尽快进行试验。长期保留应置-7(TC如

下。

2.6加入10uLDEPC水和10URNasin,轻轻混匀，溶解管壁上

日勺RNA,4000g离心10分钟，尽快进行试脸。长期保留应置-70C如

A

3cDNA合成

取200HLPCR专用管，连同阳性对照管和阴性对照管，每管加

10uLRNA和50D”下游引物P2(5'-CACAG(CT)CC(AC)AA(TC)

CC(AG)AAGTCATC-3'),按反转录试剂盒阐明书进行。

取200必工,PCR专用管I连•同阳性对照管和阴性对照誉，每•管加

10-M-ILRNA-和与0-2游引-物-Eg_4R26、GAG4G-《Cn-GJ(4GJ-AA-J0

4PCR

4.1取200ULPCR专用管，连同阳性对照管和阴性对照管，每

管加述lOuLcDNA和适量水，95式预变性5分钟。

4.1取200ULPCR专用管，连同阳性对照管和阴性对照管,每管

加上述10uLcDNA和适量水，95℃预变性5分钟0

4.2每管加入10倍稀释缓冲液5)L,上游引物Pl(5'-TC(GA)

(AT)CAACCAA(TC)GAGATAG3G-3')和下游弓I物P2各50"1,10mol/L

dNTP2uL,Taq的2.5U,补水至50uL。

4.2每管加入10倍稀野媛冲液5uL,上游引物巴⑹-TC(GA)

(AT)CAACCAA(TC)GAGATAGGG-3')和下游引物P2各50pM,10mol/L

dNTP2uL,Taq酶2.5U,补水至50HL

4.3置PCR仪.循环条件为95(C50sec.58(C60sec,72(C35sec,

共40个循环，72(C延伸5分钟。

上0T~PGR-仪，循环条件为950c50s。。，58℃60“。,—2哈唬一

共-40-伞循环T-2哈延伴-5-分钟/

5成果鉴定

取RT-PCR产物5uL,于1%琼脂糖凝胶中电泳，凝胶中含0.5uL

/矶滨化乙锭，电泳缓冲液为05XTBE,80V30分钟，电泳完后于长

波紫外灯下观测拍照。阳性对•照管和样品检测管出现251nt的特异条

带判为阳性；阴性管和样品检测管未出现特异条带判为阴性。

波紫外灯下观测拍照°阳性对照管和样品检测管出现251m的特异条

A

带'|<z判I/为vI阳1畦I-X*91阴/7性I—4-管F3和I样I|品J"会U冽管n，未I、出L-M现«ZU特，J异y|条带判</为V1阴/2I性-*-O°

附件5

猪瘟抗原双抗体夹心ELISA检测措施

本措施通过形成的多克隆抗体-样品-单克隆抗体夹心,并采用辣

根过氧化物酶标识物检测.刘外周血白细胞、全血、细胞培养物以及

组织样本中日勺猪瘟病毒抗原生行检测的一种双抗体夹心ELISA措施。

详细如下：

本措施通过形成的多克隆抗体-样品-单克隆抗体夹心।并采用辣

根过氧化物酶标识物检测，对外周血白细胞、仝由、细胞培养物以及

组织样本中的猪流病毒抗原进行检测的一种双抗体夹心ELISA措施°

1试剂盒构成

1.1多克隆羊抗血清包被板条8孔X12条(96孔)

1.2CSFV阳性对照，具有防腐剂

1.5mL

1.2CSF¥阳性对照『具布•防腐剂----------------------------------------kW.

1.3CSFV阴性对照，具有防腐剂

1.5ni【,

1.3CSF¥阴性对照，具有防腐剂-----------------------

1.4100倍浓缩辣根过氢化物酶标识物(100X)

辣根过氧化物酶标识抗鼠HG,含防腐剂

200uL

----------辣根过氧化物嗨标工具抗晶T-gGr冬防-腐刑----------------------200^

1.510倍浓缩样品稀释液（10X）55mL

1.6底物液，TMB/H202溶液

12mL

1.6底物液，TMB/H禽溶液-----------------------------洛叱

1.7终止液，1MHCL（小心，强酸）12mL

1.7终止液，1MHCL（小心,强酸）------------------------

1.810倍浓缩洗涤液（10X）125mL

1.9CSFV单克隆抗体，含防腐剂

4mL

i.10酶标抗体稀释液15mL

2样品制备

注意：制备好的样品或组织可以在2〜7七保留7天，或-209冷

冻保留6个月以上。但这些样品在应用前应当再次以1500B离心10分

钟或10000g离心2〜5分钟。

注意：制备好的样品或组织可以在2〜7（保留7天，或-2（TC冷

冻保留6个月以上。但这些样品在应用前应当再次以1500g离心10分

钟或10000g离心2、5分钟。

2.1外周血白细胞

2.1.1取10mL肝素或EDTA抗凝血样品，15001离心15〜20分

钟。

4

2.1.2再用移液器小心吸出血沉棕黄层，加入500uL样品稀释

液（IX）,在旋涡振荡器上混匀，室温下放置1小时，期间不时旋涡

混合。然后直接进行环节2.1.6操作。

2.1.2再用移法器4心吸出独掘棕英层■>_加4500口「样品稀驿■液

（IX）,在旋涡振荡器上混匀，室温下放置1小时，期间不时旋涡混

合6然后直接进行环节2.L6操件l

2.1.3假如样品日勺棕黄层压积细胞体积非常少，那么就用整个

细胞团（包括红细胞）。将细胞加进10mL的离心管，并加入5mL预冷

（2〜7℃,下同）的017MM14C1。混匀，静置10分钟。

2.1.3假如样品的棕黄层压积细胞体积非常少,那么就用整.个细

胞团（包括红细胞九将细胞加进-IO砥的离心管丁并加入-5矶预冷（2~

7℃,下同）R勺0.17MNH£1°混匀，静置10分钟°

2.1.4用冷（2〜7C）超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠

倒混匀，15002离心5分钟。

2.1.4用冷（”^8年邑生或浜蒸水加满离心管，轻轻上下上

倒混匀，1500g离心5分钟。

2.1.5弃去J清，向细胞团中加入500此样品稀释掖（1K）,

用洁净口勺吸头悬起细胞，在旋涡振荡器上混匀，室温放置1小时。期

间不时旋涡混合。

2.1.5弃去上清，向细胞团中加入500uL样品稀瘠烫（IX）,

用洁净口勺吸头悬起细胞，在旋涡振荡、器七g白，室温放置1小时°期

间不时旋涡混合。

2.1.61500g离心5分钟，取上清液按操作环节进行检测。

注意：处理好日勺的样品可以在2〜7。（3保留7天，或-2CTC冷冻保留

6个月以上。但这些样品在使用前必须再次离心。

6•个月以上6但这些样品在使用前必须再次离心。

2.2外周血白细胞（简化措施）

2.2.1取0.5〜2矶肝素或EDTA抗凝血与等体积冷0.17MNH4cl

加入离心管混合。室温放置10分钟。

2.2.21500］离心10分钟（或100002离心2—3分钟），弃上

清。

2：2「21600g.离心-1。分钟.（或10000g离心2-3.分钟T弃上清&

2.2.3用冷（2〜7C）超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠

倒混匀，1500g离心5分钟。

2.2.3用冷（2〜7C）超纯水或双蒸水加满离心管，轻轻上下颠

倒混匀，1500g离心5分钟°

2.2.4弃去上清，向细胞团加入500ul样本稀释液（IX）。旋涡

振荡充足混匀，室温放置1小时。期间不时旋涡混匀。取75ul按照“操

作环节”进行检测。

2.2.4声去上清，向细,炮团加入500ul样木稀生液（IX）。旋涡

振荡充足混勾，室温放置1小时6期间不时旋涡混匀6取75ul按照''操

作环节”进行检测6

2.3全血（肝素或EDTA抗凝）

2.3.1取25uL10倍浓缩样品稀释液（10义）和475uL全血加入

微量离心管，在旋涡振荡器上混匀。

2.3.1取25uL10倍浓缩样品稀释液（10X）和475uL全血加入

2.3.2室温下孵育1小时，期间不时旋涡混合。此样品可以直接

按照“操作环节”进行检测。

2.3.2室温下孵育1小时，期间不时旋涡混合°此样品可以直接

按照“操作环节”进行检测。

或：直接将75uL全血加入酶标板孔中，再加入10uL5倍浓缩样

品稀释液（5X）。晃动酶标板/板条，使样品混合均匀。再按照“操

作环节”进行检测。

或：直接将75uL仝血加入酶标板孔中，再加入10此5倍浓缩样

•品稀■释■於®JI晃动酶■标板/板条，使样品混合物句°再按照“操

作环节”进行检测u

2.4细胞培养物

2.4.1移去细胞培养液，搜集培养瓶中的细胞加入离心管中。

~移去细胞培养液，搜集培养瓶中的细胞加入离心管中&

2.4.22500g离心5分钟，弃上清。

2.4.22500g离心5分钟，弃上清」

2.4.3向细胞团中加入500uL样品稀释液（IX）。旋涡振荡充足

混匀，室温孵育1小时。期间不时旋涡混合。取此样品75皿按照“操

作环节”进行检测。

混勾，室温孵育1小时u期恒不时旋涡混合b取此样品75uL按照“操

作环节”进行检测6

2.5组织

最佳用新鲜日勺组织。假如有必要，组织可以在处理前于2〜7C冷

藏保留1个月。每只动物检测1〜2种组织，最佳选用扁桃体、脾、肠、

肠系膜淋巴结或肺。

最住用新鲜B勺组织。假如有必要，组织可以在处理前于2〜7（冷

肠系膜淋巴结或肺°

2.5.1取1〜2g组织用剪刀剪成小碎块（2〜5mm大小）。

2.5.2将组织碎块加入10mL离心管，加入5mL样品稀释液（1

义），旋涡振荡混匀，室温下孵育1〜21小时，期间不时旋涡混合。

2.5.2将组织碎块加入10位离心管，加入5mL样品稀释液Q

X）,旋涡振荡混匀，室温下将育1〜21小时，期间不时旋涡混合6

带格式的：缩进：苜行缩进：2字符，无项目符号

2.5.31500g离心5分钟，取75皿上清液按照“操作环节”.或“位：5.门字.符

进行检测。

3^5~~2毋与一玷。。♦禹心6分钟FTI-75吐士清・液按,照■上操作

环节”进行检测u

3操作环节

注意：所有试剂在使用前应当恢复至室温18〜221；使用前试剂

应在室温条件下至少放置1小时。

应在室温条件下至少放置1小时U

3.1每孔加入25uLCSFV特异性单克隆抗体。此环节可以用多道

加样器操作。

3.2在对应孔中分别加入75uL阳性对照、阴性对照，各加2孔。

注意更换吸头。

3.2在对应孔中分别加入75uL阳性对照、阴性对照，各加2孔0

注意更换吸头。

3.3在其他孔中分别加入75uL制备好的样品，注意更换吸头。

轻轻拍打酶标板，使样品混合均匀。

3j—在其他耳中分别加、_76ii『制备好啊样品?一注建要换吸头b

轻桧拍打酶标板，使样品混合用勾U

3.4置一盒中或用胶条密封后室温（18〜22小）孵育过夜。也可

以孵育4个小时，不过这样会减少检测敏捷度。

3.4置湿盒中或用胶条密封后室温（18〜22（）孵育过夜°也可

以孵育4个小时，不过这样会减少检测敏捷度°

3.5甩掉孔中液体，用洗涤液（IX）洗涤5次，每次洗涤都要

将孔中的所有液体倒空，用力拍打酶标板，以使所有液体拍出。或者,

每孔加入洗涤液250〜300uL用自动洗板机洗涤5次。注意：洗涤酶标

板要仔细。

3.5甩掉孔中液体，用洗涤液（IX）洗涤5次，每次洗涤都要

将孔中日勺所有液体倒空，用无拍打酶标板，以使所有液体拍出」或者,

每孔加入洗涤就_25。~300唱『用-自-动洗板机洗涤-5■冼l注矣:诜涤麻

标坂要仔细。

3.6每孔加入lOO