变性与复性课件

变性与复性

Unfoldingand

Refolding

变性与复性1931年吴宪教授提出蛋白质变性理论。

若溶液中存在变性剂（酸、碱、盐酸胍、尿素、重金属、某些有机试剂等）能引起蛋白质变性。蛋白质变性是因维系其空间结构的次级键被破坏，原有的空间结构解体，蛋白质肽链构型调整以适应新环境。弱变性条件下，蛋白质部分变性，肽链保持一定结型；强变性条件下，蛋白质完全变性肽链伸展成无序随机状态。

变性与复性

变性过程总伴随着蛋白质的物理、化学、生物学性质的变化，如溶解度改变、体积变大、黏度增加、扩散系数降低、生物活性降低或消失等。蛋白质变性时肽链伸展而失去特定的空间结构，这一过程称为肽链的伸展或去折叠。随着这一过程的进行，整个分子也由天然蛋白质紧密的、球状或近球状结构伸展为松散的无一定空间结构的链状分子。许多变性蛋白质在去除变性因素后，可自发地恢复它原来的空间结构和生物活性，这称为变性蛋白质的再折叠或复性。复性有关理论

蛋白质从去折叠状态向折叠状态即天然状态转变的过程中，必须经历一个高自由能的过渡态。

蛋白质复性过程中能量变化示意图复性有关理论

在这个过渡态中蛋白质可有多种构象形式，而天然状态蛋白质可能有一种或有限的几种构象状态存在。蛋白质的再折叠是依据最小能量原则进行的，假设蛋白质的天然构象是能量最小的构象，变性态蛋白质分子会自发的向这个最小能量状态转变。这就是“热力学假说”。该理论认为：蛋白质天然构象形成具有协同性，其能量差别足以区别天然构象和其它构象。大部分蛋白质的天然构象应是能量最小构象。复性有关理论

大量研究还发现，许多蛋白质在体外的变性复性过程并非完全可逆，且体外复性速度远比体内低，多肽链折叠过程中受到许多因素的限制，如S-S键重排和脯氨酰顺反异构等都是折叠反应的限速步骤，实际多肽链在折叠过程受到动力学控制。蛋白质在折叠过程中会有两种途径相互竞争，一种是正确折叠形成天然构象的途径，另一种是错误折叠成稳定的非天然构象的途径。蛋白质多肽链的正确折叠是一些因素在折叠动力学过程中起到控制作用。复性有关理论

“动力学假说”与“热力学假说”并不互相否定，而是互相补充与修正，对不同蛋白质而言，二者在蛋白质多肽链折叠过程中所起的作用大小不同，各有特点。总体上，蛋白质的折叠遵循“热力学假说”，从高能态向低能态转变的过程又受动力学控制。一些小分子单结构域蛋白质的折叠过程相对简单些；热力学控制下能容易地进行可逆的变性、复性；结构比较复杂的蛋白质，特别是涉及S-S键重排，脯氨酰顺反异构限速步骤的折叠反应，总体上受热力学控制，但折叠途径即动力学控制比较重要。

复性有关理论

两个理论都认同：蛋白质的折叠是蛋白质自身分子内作用的结果，是由于暴露在溶液中的疏水侧链的疏水作用而互相靠近，形成了具有特定三维空间结构的蛋白质分子。

按拓扑学观点认为：虽然蛋白质内部基团相互作用复杂，使得不同蛋白质的折叠复性过程不相同，但不同蛋白质多肽链穿越空间的形式可能会是相同或类似。实验中也发现，蛋白质拓扑结构的氨基酸序列不改变对蛋白质的折叠速度等参数影响很很少。因此，该理论认为，蛋白质的折叠过程的许多参数及其折叠机理可能与蛋白质的拓扑结构有密切关系。蛋白质结构

蛋白质如何从具有一级结构的肽链形成具有生物功能的三级结构的机制是由DNA到有生物学功能蛋白质之间唯一没有解决的问题。其研究具有重大理论意义，对利用基因工程生产活性蛋白质有重要指导意义。研究蛋白质的溶液构象、折叠途径是揭示新生态肽链折叠过程的基础。蛋白质的较低级的结构是形成更高级结构的基础，而高级结构可能对低级结构有进一步的调整和完善作用。

蛋白质结构

蛋白质的结构层次蛋白质结构

其中，二级结构和折叠中间体的形成直接影响着球状蛋白质的折叠和寡聚体的组装，结构转换和错误折叠往往导致蛋白质的聚合。二级结构转换是指某些蛋白质中的α-螺旋向β-折叠转变，它是改变蛋白质稳定性和聚合的原因。寡聚体组装和蛋白质的聚合遵循不同的分子机理。前者有一定的专一性，后者则是蛋白质分子的随机集合。研究寡聚体蛋白质折叠和装配，能够深入地揭示蛋白质折叠和聚合问题。目前，虽然有关研究取得了很大进展，但对折叠复性还有很多未解之迷。促进与维系蛋白质折叠和天然构象的作用力

蛋白质从伸展的多肽链折叠成特定的天然构象在总体上受到热力学或/和动力学控制。而在折叠的具体过程中是受到各种作用力的综合作用进行折叠。维系蛋白质构象与促进蛋白质折叠的作用力本质上是一致的，二者的区别是前者在维系天然的静态中起作用，而后者在多肽链折叠的动态过程中起作用。总体上看，二者都可分为四种主要类型：疏水相互作用多肽链处于水环境时，其非极性侧链基团为避开极性分子而形成疏水核心，是“疏水折叠”促进与维系蛋白质折叠和天然构象的作用力

过程的主要动力，同时也是维系多肽链折叠状态的主要作用力。另外，全部或部分暴露在水环境中的非极性侧链基团也有明显地疏水相互作用，在多肽折叠的早期中间体中起重要作用。氢键蛋白质内有非常多的氢键，具体某一氢键对蛋白质的构象的贡献很小，但所有的氢键的力量加起来就是一个非常重要的作用，不同氢键对蛋白质构象的影响大小也不同，但，至少在二级结构，如α-螺旋和β-折叠的形成与维系起重要作用。促进与维系蛋白质折叠和天然构象的作用力盐键多肽链上的众多带正负电荷的侧链基团之间或与环境中的正负离子之间的静电作用对蛋白质的稳定性有较大影响，在蛋白质构象形成过程中也起到重要作用。二硫键是侧链基团之间唯一的共价键，对蛋白质天然构象及折叠过程中形成的中间体具有很强的稳定作用，在蛋白质折叠过程中起到关键作用。包涵体

目前用基因工程表达的蛋白质有4000多种，用E.coli表达的占90%以上，在E.coli细胞质内高水平表达的外源蛋白质，尤其是来自真核生物的蛋白质，会形成不溶性聚合物---包涵体。

E.coli包涵体

包涵体

包涵体形成原因：使用高计量基因和强启动子；大肠杆菌细胞质环境条件，如pH、离子强度、高还原电位，不同于外源蛋白质正确折叠为最终构象的条件；缺少蛋白质正确折叠的辅助因子。如催化构象互变的折叠酶，脯氨酰基顺/反异构酶，二硫键异构酶，及增强折叠或阻止聚集的分子伴侣等。超表达产生的高浓度新生蛋白质由于多肽链不完全折叠，有利于分子疏水序列之间的相互作用，最终导致这些蛋白质的聚集和错误折叠。包涵体对分离纯化的影响有利方面：蛋白质表达量高；抗剪切和较高温度，对破碎细胞的方法和条件要求低；包涵体密度大，易分离；包涵体的蛋白质纯度较高；后续蛋白质分离纯化较容易。不利方面：需变性复性；活性蛋白质收率低。包涵体的分离破碎细胞，可耐受较高温度和破碎条件；离心沉淀包涵体，离心力较低，除去碎片；洗涤包涵体，包涵体的目的蛋白质含量为80%左右，含有酯类，蛋白，可用含低浓度的变性剂，如尿素、盐酸胍、TritonX-100，脱氧胆酸钠的缓冲液反复洗涤，黏度高时可用DNAse、溶菌酶处理，甚至于可用稀NaOH溶液洗涤，获得较纯的包涵体。包涵体的分离1.用表面活性剂和NaCl

混合物洗两次3.标准蛋白质5.表面活性剂洗两次6.细胞破碎物包涵体的溶解

包涵体的溶解需要打断蛋白质分子内和分子间的共价键（二硫键）、离子键、疏水作用及静电作用等，使多肽链伸展。因此，包涵体的溶解需要强的变性剂，如尿素、盐酸胍或硫氰酸盐，或表面活性剂，如SDS、十六烷基三甲基铵氯化物、肌氨酸、正十二烷基肌氨酸钠等；对于含半胱氨酸的蛋白质，还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫基赤藓糖醇、半胱氨酸、谷胱甘肽等使S-S键断裂。包涵体的溶解

由于金属离子具有催化氧化作用，需加金属离子螯合剂，如EDTA、EGTA。

温度一般25℃~30℃，以促进溶解。也有用70%甲酸溶解包涵体。在细胞周质内形成的包涵体，可采用原位溶解法。即在发酵结束时向培养基中加入变性剂和还原剂，在碱性条件下进行包涵体原位溶解（增加细胞膜的通透性，使包涵体溶解出来），无需采用其它破碎细胞方法，再采用双水相萃取除去细胞碎片，获得包涵体溶解液。

蛋白质的复性

复性简单地说就是脱除变性剂使溶解的包涵体蛋白质的伸展肽链折叠成正确的空间结构。蛋白质的折叠复性过程及聚集体的产生蛋白质的复性

在复性过程中，处于伸展状态的肽链，因暴露在外面的疏水侧链基团之间的相互作用而使这些分子很容易发生聚集反应，形成沉淀，这是大多数蛋白质复性率低的一个主要原因。好的复性方法应能够最大程度的抑制蛋白质的聚集反应，促进蛋白质向折叠成正确的空间结构方向反应。探索高效、方便的蛋白质复性方法对于基因工程产品和理论研究均有重要意义。实践证明，由于蛋白质自身的复杂性和多样性，没有那一种复性方法适用于所有的蛋白质。蛋白质的复性

目前发展的复性方法：稀释复性透析、透滤复性分子伴侣指导复性色谱法复性：凝胶过滤色谱复性、离子交换色谱复性、疏水色谱复性、亲合色谱复性反胶团复性双水相复性蛋白质的复性一个有效、理想的折叠复性方法应具备以下特点：活性蛋白质回收率高；正确复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易放大；复性过程耗时少。就工业应用，要求折叠复性过程要快速、低成本、高效。虽然蛋白质折叠复性方法很多，但就某种蛋白质仍需通过实验确定最佳方法和条件。稀释复性法

这是目前最简单的蛋白质复性方法。将少量的变性蛋白质溶液以一定比例滴加到复性缓冲液中，达到降低变性剂浓度的目的，使处于变性伸展状态的蛋白质分子在溶液中自发地折叠成天然的活性结构。为获得好的复性结果，必须进行复性条件优化。因复性原理不清楚，只能通过实验来确定。一般可采用正交法。影响复性的条件主要有：变性蛋白质溶液组成及浓度、复性缓冲液的组成（离子种类、氧化还原试剂、螯合剂）、离子强度、pH、氧化还原电位、复性温度、稀释倍数、混合方式速度等。稀释复性法正交法优化复性条件稀释复性法变性蛋白质浓度对复性的影响稀释复性法复性缓冲液pH对复性的影响稀释复性法复性温度对蛋白质复性的影响稀释复性法复性时间对蛋白质复性的影响稀释复性法精氨酸浓度对蛋白质复性的影响稀释复性法盐酸胍浓度对复性的影响稀释复性法

不同蛋白质因其结构和变性条件及程度的差异，复性条件和影响因素不同，结果也不同。研究控制复性条件和因素的目的是最大限度抑制聚集反应，促进正确折叠反应，达到最大的复性率。伸展蛋白质分子的聚集反应是两个分子或多个分子之间的反应，在动力学上属于二级以上的反应，而正确折叠反应是单个蛋白质分子的自我组装过程，动力学多属于一级反应。两者相比，聚集反应与蛋白质浓度的关系更大。在低浓度进行复性有利于控制聚集反应。稀释复性法

通常，复性的蛋白质浓度为10~50μg/mL。存在蛋白质浓度低复性率高，蛋白质浓度高复性率低的矛盾。操作方式一次性稀释：操作方式，速度分段稀释：一般采用两步法，先将变性剂浓度降低到一中间浓度，最后再完全除去。连续稀释：变性蛋白质溶液与复性溶液按一定比例连续混合，复性。分段和连续稀释法的复性回收率高于一次性稀释。稀释复性法分段稀释复性时时间间隔对复性率的影响稀释复性法简单稀释和分段稀释复性比较稀释复性法

稀释复性应用于大规模生产的问题：复性缓冲液量大，体积大，设备利用率低；蛋白质浓度低，产物回收困难；稀释复性法是其他复性法的基础。对一个新的包涵体蛋白质复性时，首选的方法是稀释复性法。从中获得的条件和认知可供其它方法参考。蛋白质复性时聚集反应的抑制

复性中最重要的是抑制复性过程的聚集反应。最常用的是使用聚集反应的抑制剂，其原理为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构，降低错误折叠蛋白质的稳定性，增加折叠复性中间体的溶解度，增加非折叠蛋白质的溶解度，减少复性中间体接触发生聚集反应。蛋白质复性时聚集反应的抑制聚集反应抑制剂的种类：可促进蛋白质折叠的小分子添加剂，如盐酸胍或尿素，以及一些离液化合物，如烷基尿素、碳酸酰胺类化合物等。在非变性浓度下，是很有效的促进剂。对于某些需要辅因子才表现活性的蛋白质，辅因子、配基、或底物具有很好促进折叠的作用。

Zn2+

和Cu2+可稳定折叠中间体。浓度为0.5~1.0mol/L的L-精氨酸可大幅度提高折叠效率（使不正确折叠和二硫键不稳定）。蛋白质复性时聚集反应的抑制PEG促进折叠复性，PEG与复性中间体特异形成非聚集的复合物，阻止复性时疏水中间体的聚集，复合物折叠形成第二个中间体，并不再与PEG结合。天然蛋白质即由第二个中间体形成。在有PEG存在下的所有的折叠反应具有相同的速率，复性率与PEG的分子量及浓度相关。认为PEG的作用与分子伴侣的作用机理相似。蛋白质复性时聚集反应的抑制非离子型表面活性剂，尤其是离子型或两性离子表面活性剂。如Chaps、TritonX-100、磷脂、十二烷基麦芽糖苷、磺酸甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用。使用它们的不利是与蛋白质形成胶团，难以去除，影响后续的分离纯化。多离子化合物，如肝素，可促进蛋白质的折叠复性，且有稳定蛋白质天然构型的作用。蛋白质复性时聚集反应的抑制短链醇类、高渗物，如乙醇、甘油等对蛋白质有稳定作用，可有效降低低聚体的形成。如胰岛素生长因子I的复性，除了在复性液中加入Cu2+和Mg2+、2mol尿素、盐类（1mol/LNaCl、DTT）外，还加入乙醇、甘油等。单克隆抗体，待折叠复性的蛋白质的抗体可有效的协助其复性，但只有该蛋白质的特异抗体有效。它可与待折叠复性的蛋白质的远离活性中心的疏水区域结合，有效阻止无活性聚集体的形成。蛋白质复性时聚集反应的抑制分子伴侣和折叠酶，这类蛋白质主要包括硫氧还蛋白、二硫键异构酶(PDI)、肽酰-脯氨酰顺反异构酶(PPI)、分子伴侣、FK506结合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侣和折叠酶不仅可在细胞内调节蛋白质的折叠和聚集过程的平衡，而且可在体外促进蛋白质折叠复性。由于分子伴侣和折叠酶在蛋白质复性后要除去，且这类蛋白质又十分昂贵，须采用可回收的方法，如固定化方法。人工伴侣，将变性蛋白质首先加到含表面活性剂的溶液中，以防聚集，然后用环糊精除去表面活性剂，促进折叠复性。这称为人工伴侣复性。蛋白质复性时聚集反应的抑制

常用的蛋白质复性添加剂复性添加剂复性蛋白质溶液增熵试剂GdmCl荧光假单孢菌脂肪酶，溶菌酶，碳酸酐酶II，干扰素-β-多肽尿素猪生长激素，溶菌酶，IGF-1，干扰素-β-多肽L-精氨酸荧光假单孢菌脂肪酶，鸡卵清溶菌酶，α-糖苷酶盐类(NH4)2SO4

溶菌酶糖类甘油荧光假单孢菌脂肪酶，溶菌酶，IGF-1蔗糖IGF-1葡萄糖溶菌酶N-乙酰基葡糖胺溶菌酶肌氨酸溶菌酶蛋白质复性时聚集反应的抑制表面活性剂类ChapsTGF-β-类蛋白质，碳酸酐酶IITween人生长激素SDS干扰素-β-多肽月桂酰基肌氨酸钠单链Fv片段十二烷基麦芽糖MHCTritonX-100碳酸酐酶IIPEG碳酸酐酶II十八烯甘油碳酸酐酶II单十二酰基磷酸酯溶菌酶硫代甜菜碱鸡卵清溶菌酶短链醇

正戊醇，正己醇，碳酸酐酶环己醇蛋白质复性时聚集反应的抑制

分子内没有S-S键的蛋白质复性相对比较简单，只需抑制聚集反应，不涉及S-S键的形成。

S-S键的形成需要适当的氧化还原条件，对于稀释复性法，最简单的方法是通入空气，进行氧化形成S-S键，但氧化速度太慢；最常采用的是适当比例的氧化还原对，如GSH/GSSG,形成S-S键，或使错误S-S键重排，促进正确S-S键的形成。蛋白质复性时聚集反应的抑制

影响二硫键重排和组建的因素

如果复性蛋白质含有二硫键，在复性缓冲液中需加入还原型及氧化型低分子量的巯基试剂的混合物，如谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基苏糖醇等，其还原型(13mmol/L)与氧化型的摩尔比为1:1到10:1。这样的氧化还原系统实际上给蛋白质形成一个还原环境，形成游离的巯基，实际上形成正确的S-S键在此环境中也可能被还原。因此，还需在后续步骤加入强的氧化步骤，即加入过量的氧化型巯基试剂，或采用Cu2+诱导的空气氧化，以保证形成正确稳定的S-S键。

巯基氧化还原型试剂比例对复性的影响二硫键重排和组建二硫键重排和组建

在有氧化还原对存在下，复性缓冲液的pH也很重要，形成S-S键的氧化反应，需要碱性条件下进行。透析复性法

透析法也是最传统、应用最普遍的蛋白质折叠复性方法。包括借助超滤实现复性的透滤复性法。由于变性剂均为小分子物质，在透析或超滤时可逐渐透过多孔膜，使变性蛋白质溶液的变性剂浓度逐渐降低，最后除去变性剂，达到使变性蛋白质折叠复性的目的。影响透析和透滤复性的因素与稀释复性复性基本相同。但过程缓慢，耗时间长，效率低。对某些蛋白质复性率高于稀释复性法。色谱复性法

在色谱过程中实现复性，称为色谱复性法。近年发展十分迅速。其优点是：色谱固定相对变性蛋白质吸附能力低，甚至完全消除变性蛋白质在脱离变性剂的环境发生聚集，产生沉淀。提高复性质量和活性收率。在蛋白质复性的同时可使目的蛋白质与杂蛋白质分离，达到复性与纯化同时进行的目的。便于回收变性剂，有利于降低废水处理成本。适合蛋白质复性的色谱有：凝胶过滤色谱(GFC)、离子交换色谱(IEC)、疏水色谱(HIC)、亲合色谱(AFC).凝胶过滤复性

凝胶过滤色谱是以溶液中分子的流体力学体积大小进行混合物分离的技术。物料在色谱柱中的保留体积不会超出色谱柱中的溶剂的总体积，保留时间短，溶质峰相对较窄，容易检出，灵敏度高。溶质的保留时间可粗略估计，能够把握间隔进料的时间，进行色谱柱的连续使用，提高使用效率。溶质分子之间及溶质与分离介质之间无相互作用，活性分子不易变性，活性收率高。凝胶过滤复性

由于上述特点，凝胶过滤色谱近年开始用于蛋白质复性。在凝胶过滤复性时，先用复性缓冲液平衡凝胶柱，变性蛋白质溶液上样后进入柱顶，因有高浓度变性剂存在，变性蛋白质有一个随机构象状态和大的动力学水合半径，不能进入介质内空隙，在柱上不能保留。在用复性缓冲液洗脱时，因变性蛋白质溶液逐步被稀释，变性剂和蛋白质浓度降低，使变性蛋白质处于热力学不稳定的高能状态，蛋白质分子会自发地向热力学稳定的低能态，即蛋白质的天然状态转化，使蛋白质开始复性。凝胶过滤复性

局部复性的蛋白质体积变小，可进入介质内部，开始在液-固两相间分配，随时间推移，当蛋白质分子结构变得更加紧密时，蛋白质在两相中的分配系数会逐渐增加。蛋白质进入介质颗粒内部空隙后，其扩散速度减缓，从而限制了蛋白质的聚集，减少了沉淀产生。蛋白质分子大，先从柱子上洗脱，变性剂分子小，最后流出色谱柱。达到复性目的。凝胶过滤色谱对蛋白质本身性质没有特殊要求，只要选择合适分离范围的凝胶介质即可。因此，方法比较简单。凝胶过滤复性凝胶过滤色谱复性图谱图凝胶过滤复性变性蛋白质溶液中的DTT对凝胶过滤色谱复性的影响A用SephadexG25除去

DTTB未除去DTT凝胶过滤复性除去DTT后酸化变性蛋白质溶液对复性的影响×不酸化直接脱除DTT＋酸化后脱除

DTT凝胶过滤复性凝胶过滤色谱复性时不同介质对复性的影响凝胶过滤复性不同变性蛋白质浓度对凝胶过滤色谱复性的影响凝胶过滤复性尿素浓度梯度凝胶过滤复性A:Tris-HCl0.1m0l/L,EDTA1mmol/L,GSH/GSSG=3/0.3mol/LB:Urea8mol/L洗脱液：B尿素梯度凝胶过滤复性尿素浓度梯度凝胶过滤复性过程尿素梯度凝胶过滤复性尿素梯度对蛋白质复性的影响尿素梯度凝胶过滤复性尿素最终浓度对蛋白质回收率的影响尿素梯度凝胶过滤复性梯度长度对蛋白质复性活性回收率的影响尿素梯度凝胶过滤复性洗脱液流速对复性蛋白质活性回收率的影响尿素梯度凝胶过滤复性

变性蛋白质浓度对稀释复性、凝胶过滤复性和尿素梯度凝胶过滤复性影响的比较尿素梯度凝胶过滤复性三种复性方法的活性回收率的比较凝胶过滤复性尿素浓度和pH联合梯度凝胶过滤色谱复性亲合色谱复性

是利用配体与目标蛋白质之间的特异亲合作用，使变性蛋白质分子保留在柱的顶端与变性剂分离，而后在洗脱过程中进行复性。依使用的配体，用于复性的亲合色谱有：抗体亲合色谱、金属亲合色谱(IMAC)、脂质体亲合色谱和分子伴侣亲合色谱等。因配体与目标蛋白质间的作用特异性强，且不同配体与不同蛋白质之间的作用差别大，亲合色谱作为蛋白质复性的机理比较复杂。亲合色谱复性

单链抗体融合蛋白scFv57P包涵体的复性。以与scFv57P有特异性结合的小肽C19V为配体的亲合色谱复性。亲合色谱复性

以金属离子为配体的亲合色谱复性法

如以Ni2+为亲合配体，可与末端标记有组氨酸的蛋白质分子有特异的亲合作用，而这种作用又不受强变性剂的影响，可用于重组蛋白质的复性。亲合色谱复性

脂质体亲合色谱复性脂质体作为配体用于蛋白质复性的原理可能是：局部变形的蛋白质分子结构类似于融球状态，与具有天然蛋白质相似的二级结构，此时，蛋白质分子仍然具有强的疏水表面，可同脂质体的脂质双层作用，以帮助蛋白质进行复性。比如碳酸酐脱氢酶的复性使用脂质体的柱子，活性收率为83%，不用为58%。亲合色谱复性

伴侣亲合色谱复性分子伴侣是介导表达蛋白质建立天然构象的一类重要蛋白质，也是蛋白质体外折叠复性过程的辅助因子。在复性溶液中加入分子伴侣可提高蛋白质的复性效率，但溶液中引入了杂蛋白，给目的蛋白质分离纯化带来麻烦，且它价格昂贵，而无法应用。而将分子伴侣结合在适当的介质上构成分子伴侣亲合色谱介质，用于目的蛋白质的复性可克服上述缺点。亲合色谱复性

分子伴侣亲合色谱介导的蛋白质复性与它在溶液中的作用一样。为变性蛋白质提供一个中空环状的疏水腔，当变性蛋白质进入空腔后，可部分避免或完全消除变性蛋白质分子间的聚集作用，使蛋白质在疏水环境中进行“结合-释放-再结合”的循环过程，直到恢复其天然的构象状态。利用合成的复杂的固定相体系成功地使一些用稀释法无法复性的蛋白质复性，因此，它又称为“折叠色谱”。疏水色谱复性

当变性蛋白质与变性剂、杂蛋白进入疏水色谱系统时，由于疏水固定相对变性剂的作用较弱，而对变性蛋白质的作用较强，变性剂首先与与变性蛋白质分离，并随流动相一同流出色谱柱；而疏水固定相提供较通常方法高出数十倍乃至数百倍的能量，在变性蛋白质被疏水固定相吸