DB54T 0449-2025 藏猪副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌三重实时荧光定量PCR检测技术规范

ICS65.020.30CCSB4154西 藏 自 治 区 地 方 标 准DB54/T0449—2025PCR2025-05-10发布 2025-06-10实施西藏自治区市场监督管理局发布DB54/T0449DB54/T0449—2025PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前言 II范围 1规范性引用文件 1术语和定义 1缩略语 1仪器和设备 2试剂和耗材 2样品采集和处理 2核酸提取 3三重实时荧光定量PCR检测 3结果判定 3生物安全措施 4附录A（规范性） 培养基及溶液配置 5附录B（规范性） 阳性质粒的构建 6附录C（规范性） 荧光定量引物、Taqman探针名称及序列 7附录D（规范性） 荧光定量PCR反应体系及条件 8前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由西藏自治区农业农村标准化技术委员会提出并归口。都市畜牧总站。红阳、李沛明、张辉、拜占春、韦明邦、李可欣、钟亚男、石斌。DB54/T0449DB54/T0449—2025PAGEPAGE1藏猪副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌三重实时荧光定量PCR检测技术规范范围本文件规定了藏猪副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌和胸膜肺炎放线杆菌三重实时荧光定量PCR检测PCR生物安全措施等要求。膜肺炎放线杆菌的定性及定量检测。规范性引用文件（包括所有的修改单适用于本文件。GB19489 实验室生物安全通用要求GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法NY/T541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T1948 兽医实验室生物安全要求通则SN/T4835 实验室生物废弃物管理要求术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1实时荧光定量PCR指在PCR反应体系中加入荧光基团、利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，实现对未知模板的定性及定量分析。3.2循环阈值是每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。缩略语下列缩略语适用于本文件。HPS：副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis）。PM：多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida）APP：胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacilluspleuropneumoniae）BHQ1：黑洞淬灭剂-1（BlackHoleQuencher-1）。BHQ2：黑洞淬灭剂-2（BlackHoleQuencher-2）。FAM：一种在荧光定量PCR中常用的荧光探针（FluoresceinAmidite）。CY5：一种在荧光定量PCR中常用的荧光探针（Cyanine5）。VIC：一种在荧光定量PCR中常用的荧光探针（ViewItCompounds）。FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）。NAD：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NicotinamideAdenineDinucleotide）。ROX：一种惰性参比染料（6-Carboxy-X-Rhodamine）。Taqman探针：一种双标记的寡核苷酸水解探针（TaqmanProbe）。TE缓冲液：Tris-EDTA缓冲液（Tris-EDTAbuffer）。TSB：胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TrypticaseSoyBroth）。ddH2O：双蒸水（DoubleDistilledWater）。仪器和设备荧光定量PCR容量瓶、气浴恒温振荡器等。试剂和耗材除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水符合GB/T6682的要求。FBS。NADA。A。2×PerfectStart®IIProbeqPCRSuperMixUDG，2×PCR预混液。50×PassiveReferenceDye，50×ROXEASYDilution（forRealTimePCR，TakaraClontech），PCR的商品化DNA稀释液。B。ddH2O。DNATaqmanC。0.2mLPCR1.5mL10mL样品采集和处理采样工具下列采样工具适用于本文件。121℃，30min无菌采样拭子、采样管为一次性用品。样品采集组织样品用灭菌器械，剪取典型病变的肺部新鲜组织，样品量≥5g，于无菌的采样管中编号保存。棉拭子样品将无菌棉拭子经PBS湿润后插入藏猪鼻腔内2cm～3cm处，并轻轻旋转3次～5次，折断后浸泡于盛有2.5mL增菌培养基的一次性摇菌管中。样品保存与运输上述采集的样品应立即进行检测。不能立即检测的样品，在4℃条件下保存不超过24h，-20℃条件下保存不超过1个月，-80℃以下条件保存不超过6NY/T541样品处理组织样品处理取0.5g～1g的组织，将样品接种到盛有2.5mL增菌培养基的一次性摇菌管中，将摇菌管置于37℃，210r/min，恒温震荡培养16h～24h。棉拭子样品处理吸取7.2.2中混有棉拭子样品的培养基2.5mL摇菌管置于37℃，210r/min，恒温震荡培养16h～24h。核酸提取取7.4中的增菌培养物制备样品DNADNA提取采用商品化革兰氏阴性菌DNA组DNA提取试剂盒，具体操作步骤参照所选用的试剂盒说明书。PCR三重荧光定量PCR反应体系及条件，见附录D。结果判定阈值设定为准。质控标准下列质控标准适用于本文件。CtCt≤35，扩增曲线明显呈对数增长。检测结果判定需同时满足以上两个条件，否则本次检测无效。样品判定下列样品判定适用于本文件。Ct≤35，且出现典型的扩增曲线，判定为阳性。CtCt35，且出现典型扩增曲线的样品，判定为可疑，应重复试Ct生物安全措施GB19489NY/T541、NY/T1948、SN/T4835等要求进行。附 录 A（规范性）培养基及溶液配置NAD贮存液的配制称取1gNAD溶解于100mLddH2O中，充分摇匀溶解后，用0.22μm的细菌滤器过滤，分装于无菌离心管中，置-20℃保存备用。增菌培养液的配制TSB30g，949mLddH2O，加热至充分溶解后摇匀，121℃15min，4℃条件下保存。50mLFBS1mL1%NAD。附 录 B（规范性）HPS由NCBI数据库参考菌株的infB粒pUC57-infB。PM由NCBI数据库参考菌株FDAARGOS_218（Genebank：GCA_002073255.2）的kmt1基因保守序列构建的阳性质粒pUC57-kmt1。APP由NCBI数据库参考菌株NCTC10976（Genebank：GCF_900638445.1）的apxⅣ基因保守序列构建的阳性质粒pUC57-apxⅣ。工作浓度阳性质粒工作浓度为103～105copies/μL。附 录 C（规范性）检测靶标名称序列HPS检测靶标名称序列HPS上游引物5′-AGCTGACGATGGCGTAATG-3′下游引物5′-CACGCTCTAGGTTTGCTTCT-3′Taqman探针5′-FAM-CCATTGAAGCAATCCAACACGCGAAAG-BHQ1-3′PM上游引物5′-TTGTGGCAAAGAAAAGCACAGT-3′下游引物5′-TCAGTTGCGCCGTTGTCA-3′Taqman探针5′-VIC-CACACCAAACTCTGCCCA-BHQ1-3′APP上游引物5′-GGTATCGGTGGAACGGTAAAC-3′下游引物5′-CTTTCGCCGCATTCACTAAAC-3′Taqman探针5′-CY5-CTTAACTTTACCGGCGAGGTGGAAACC-BHQ2-3′DB54/T0449-2025DB54/T0449-2025PAGEPAGE8附 录 D（规范性）PCRPCR名称25μL反应体系工作浓度成分12×PerfectStart®IIProbeqPCRSuperMixUDG12.5μL2×成分2HPS引物F0.6μL10μmol/L成分3HPS引物R0.6μL10μmol/L成分4HPSTaqman探针0.7μL10μmol/L成分5PM引物F0.7μL10μmol/L成分6PM引物R0.7μL10μmol/L成分7PMTaqman探针0.7μL10μmol/L成分8APP引物F0.6μL10μmol/L成分9APP引物R0.6μL10μmol/L成分10APPTaqman探针0.6μL10μmol/L成分1150×PassiveReferenceDye参照商品化说明书根据荧光定量PCR仪选择成分12TemplateDNA1μL成分13无菌ddH2Oupto25μLTotal25μL反应条件94℃预变性5min；然