鹅星状病毒感染诊断技术规范

ICS11.220

CCSB41

DH37

山东省地方标准

DB37/TXXXXX—XXXX

鹅星状病毒感染诊断技术规范

Diagnostictechnicalspecificationforgooseastrovirusinfection

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

山东省市场监督管理局发布

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-A—

刖B

本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。木文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由山东省畜牧兽医局提出并组织或施。

本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。

I

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鹅星状病毒感染诊断技术规范

1范围

本文件规定了鹅星状病毒感染的临床诊断和实验室诊断的技术规范。其中临床诊断包括流行病学、

临床症状、病理变化；实验室诊断包括样品的采集与保存、病毒分离鉴定、反转录-聚合酶链式反应

（RT-PCR）、实时荧光定量RT-PCR与间接酶联免疫吸附试验（ELISA）。

本文件适用于鹅星状病毒感染的诊断、检测、监测和流行病学调查。鹅星状病毒感染的流行病学、

临床症状、病理变化适用「鹅星状病毒的初步诊断；病毒分离、RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法

适用于鹅组织、分泌物、排泄物和病毒培养物中鹅星状病毒分离鉴定及核酸检测；间接ELISA抗体检测

方法适用于鹅星状病毒感染的抗体特异性血清学诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件,

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB19489—2008实验室生物安全通用要求

GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫

NY/T541-2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

鹅星状病毒感染gooseastrovirusinfection

由鹅星状病毒引起的5口龄〜25口龄雏鹅内脏器官与关节发生严重尿酸盐沉积的疾病。

4实验室要求

4.1环境

4.1.1实验室符合GB19489—2008和GB/T27401要求。

4.1.2从事RT-PCR工作的实验室应进行分区，根据条件划分出前处理区、核酸提取区、核酸扩增区、

电泳检测区，形成有效的物理隔离，且为单•流向，不得倒流,特别注意电泳后的琼嘴凝胶要及时处理，

避免对实验室造成污染。

4.1.3生物样品应严格控制避免对环境造成污染，试验结束后应将相关样品（如血样）进行无害化处

理。

4.2人员

1

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5.4.4所有样品保存温度在-15°C以下，不超过2wk；-70℃贮存不超过30d。

5.5检测要求

在每次检测过程中，需要设置相应的阳性对照和阴性对照。

6临床诊断

6.1流行病学

鹅群发病日龄集中于5日龄〜20日龄，5日龄左右开始发病，死亡率逐渐升高，10日龄〜15日龄为死

亡高峰，鹅群的死亡率为20%〜30%,最高可达50%。

6.2临床症状

患病雏鹅表现为精神沉郁、卧地倦动、采食减少、排白色稀便。

6.3剖检变化与组织学变化

死亡雏鹅剖检变化主要表现为内脏器它和关节腔有大量尿酸盐沉积，包括心脏、肝脏、肾脏及愉尿

管等，有的病例表现为肾脏出血肿大。患鹅组织学变化主要表现为肾小管上皮细胞坏死、间质出血，肾

小球肿胀，脾脏有大量红细胞浸润，肝细胞空泡变性、尿酸盐沉积。

6.4临床诊断结果判定

同时符合6.1、6.2、6.3,则判断为疑似鹅星状病毒感染。

7病毒分离鉴定

7.1病毒分离

7.1.1仪器设备与材料

7.1.1.1不同温度的冰箱（2℃-8℃、-20℃、-70℃）o

7.1.1.237c恒温孵化箱。

7.1.1.34℃离心机。

7.1.1.4打孔器。

7.1.1.51mL注射器。

7.1.1.6石蜡。

7.1.1.7照蛋器。

7.1.1.813口龄鹅星状病毒III清抗体阴性鹅胚。

7.1.2样品接种和培养

7.1.2.1将处理后的样品上清，经绒毛尿囊腔途径无菌接种13日龄鹅胚，0.2亳升/枚，37c孵育，

连续观察6d。

7.1.2.2弃去24h内死亡鹅胚，24h〜144h内死亡和存活鹅胚置于4c冰箱过夜或-20C冷冻lh,

分别无菌收集尿囊液并进行无菌检查，无菌尿囊液宣传三代。

7.1.3病毒分离结果判定

3

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组织样品处理液接种鹅胚后，当胚体3d〜5d内出现死亡，且胚体尿囊膜增厚，死亡鹅胚全身皮肤

及胚体腹膜有点状出血斑，肝脏、肾脏、肺脏均呈现点状出血等变化，可判断为鹅疑似星状病毒感染。

7.2病原检测

7.2.1RT-PCR反应

7.2.11仪器设备

7.2.11.1生物安全柜。

7.2.11.2PCR基因扩增仪。

7.2.11.3台式低温高速离心机（最大转速为15000r/min）.

7.2.11.4无RNA酶离心管（1.5mL）。

7.2.11.5PCR反应管（0.2mL）。

7.2.11.6微量移液器（最大量程分别为10uL、20nL、100uL、1000uL）。

7.2.11.7无RNA酶带滤芯枪头。

7.2.11.8核酸电泳仪。

7.2.11.9核酸电泳槽。

7.2.11.10紫外凝胶成像仪。

7.2.11.11电子天平：精度为0.01g。

7.2.11.12电磁炉或微波炉。

7.2.12试剂与材料

7.2.12.1DEPC水。

7.2.12.2商品化RNA提取试剂盒。

7.2.12.3RT反应试剂盒。

7.2.12.4PCR反应试剂。

7.2.12.51.0%琼脂糖凝胶,见A.2。

7.2.12.61XTAE缓冲液，见A.3。

7.2.12.7核酸染料。

7.2.12.8核酸电泳加样缓冲液,见A.4。

7.2.12.9DNA分子量标准，要求在100bp〜2000bp之间，有5条以上的指示条带。

7.2.12.10阳性对照标准品,使用鹅星状病毒SDPY株（03TCCNO:V201808,见附录C）,或其他背

景清楚的鹅星状病毒。

7.2.12.11阴性对照标准品，为健康鹅正常组织或未感染鹅星状病毒鹅胚尿囊液。

7.2.12.12RT-PCR检测所需引物：

——上游引物引5'-TGGTGGTGYTTYCTCAARA-3'；

——下游引物R：5,-GYCKGTCATCMCCRTARCA-3,,扩增片段长度为601bp,引物浓度为10umol/Lo

7.2.1.3试验程序

7.2.1.3.1RNA提取

按RNA提取试剂盒说明书提取样品和对照组的RNA。提取的RNA应立即检测，否则应置于-70℃冻存。

7.2.1.3.2RT-PCR反应

7.2.1.3.2.1反转录体系及程序

4

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RNaseInhibitor0.5uL,M-MLVbuffer2yL,RandomPrimers1.0uL,dNTPs(2.5mmol/L)

1uL,RNaseM-MLV0.5uL,RNA模板5uL,共计10uL反转录反应程序为30℃10min,42℃60min,

70℃15min,4℃终止。

7.2.1.3.2.2PCR反应体系及程序

在试剂准备区配制PCR反应液，在样品制备区进行加样,反应体系如下：10XPCRBuffer2.5uL,

dNTPs(2.5mmol/L)2^L,弓|物F(10umol/L)和R(10umol/L)各0.5uL,模板cDMA3nL,rTaq

DNA聚合酶0.25uL,加DEPC水至25UL。

瞬时离心，置于PCR基因扩增仪内进行扩增，反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s,55℃30

s,72℃30s,30个循环;72c延伸10min。

7.2.1.3.2.3琼脂糖凝胶电泳

1.0与琼脂糖凝胶板的制备：称取1g琼脂糖，加入100矶1XTAE缓冲液中。加热融化后加5UL核酸

染料溶液，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。

待凝胶冷却凝固后拔出梳子(胶中形成加样孔)，放入电泳槽中，力口1XTAE缓冲液淹没胶面。

加样：取6uL〜8uLPCR扩增产物和2口L加样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳同时设标

准DNAMarker,阴性对照、阳性对照。

电泳：电压80v〜100V或电流40mA〜50mA,电泳30min〜40min。最后，由凝胶成像系统观察并拍

照记录。

7.2.1.4结果判定

7.2.1.4.1试验成立的条件

阳性对照出现601bp的扩漕条带，且阴性对照无扩增条带时，判定试验结果成立。

7.2.1.4.2试验结果的判定

7.2.1.4.2.1在试验成立的前提下，待检样品出现601bp的条带，判定待检样品为鹅星状病毒PCR阳

性，必要时，对扩增片段进行序列测定。

7.2.1.4.2.2在试验成立的前提下，待检样品无条带，则为鹅星状病毒PCR阴性(见B.1)。

7.2.2实时荧光定量RT-PCR

7.2.2.1仪器设备

7.2.2.1.1生物安全柜。

7.2.2.1.2台式低温高速离心机(最大转速为15000r/min)。

7.2.2.1.3无RNA睡的离心管(1.5mL)。

7.2.2.1.4无RNA酶的荧光定量PCR管。

7.2.2.1.5微量移液器(最大量程分别为10PL、20uL、100uL.1000uL),

7.2.2.1.6无RNA酶带滤芯的枪头。

7.2.2.1.7荧光定量PCR仪。

7.2.2.2试剂与材料

7.2.2.2.1DEPC水。

7.2.2.2.2商品化RNA提取试剂盒。

5

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7.2.2.2.3一步法荧光定量RT-PCR试剂盒。

7.2.2.2.4阳性对照标准品，使用鹅星状病毒SDPY株(CCTCCNO：V201808),或其他背景清楚的鹅星

状病毒。

7.2.2.2.5阴性对照标准品，为健康鹅正常组织或未感染鹅星状病毒鹅胚尿囊液。

7.2.2.2.6荧光定量RT-PCR检测所需引物及探针：

——上游引物F：5'-GGTGGGCTAATAACGGAACTCAG-3'：

——下游引物R：5'-GACCTATTTCCTTGCGGATCAC3；

——探针P：5'FAM-TCGGCTCAACATCGCTGATGGG-BHQ3,扩增片段长度为89bp,引物浓度为10P

mol/Lo

7.2.2.3试验程序

7.2.2.3.1RNA提取

RNA提取参照7.2.1.3.U

7.2.2.3.2实时荧光定量RT-PCR反应体系及程序

在实验室洁净区域，将试剂盒中预混液、引物和探针取出，置于冰上融化，将下列试剂一次加入到

无RNA酶的荧光定量PCR管中。反应体系如下:2X0neStepRT-PCRBufferIII10uL,TabaraExTaq

HS0.4nL,PrimeScriptRTEnzymeMixII0.4PL,引物F(10nmol/L)和引物R(10ymol/L)各

0.4uL,探针P(10umol/L)0.8uL,模板RNA2uL,力口ddH#至20uL。反应液混匀后置于

LightCycle产96荧光定量PCR仪按照以下程序进行扩增:42c反转录5min,95℃10s；95c变性5s,

60℃退火20s(收集信号),进行40个循环。

7.2.2.4结果判定

7.2.2.4.1试验成立的条件

阳性对照出现S型扩增曲线，且阴性对照无扩增曲线时，判定检测结果有效。

7.2.2.4.2试验结果的判定

7.2.2.4.2.1Ct值＜30,且出现S型扩增曲线，表明样品中存在鹅星状病毒，判定为阳性。

7.2.2.4.2.2无Ct值，且无扩增曲线，或Ct值＞35,表明样品中无鹅星状病毒，判定为阴性。

7.2.2.4.2.330VCI值＜35的样品，判定为可疑，需重新检测(见B.2)。

8病毒抗体检测(间接ELISA)

8.1仪器设备

8.1.1台式高速离心机(最大转速为15()0()rpm)。

8.1.2酶标仪。

8.1.3微量移液器：最大量程分别为10UL、20uL.100pL.1000uL.

8.1.4聚苯乙烯板。

8.1.5水平振荡器。

8.1.637℃培养箱。

8.2试剂与材料

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8.2.1标准阳性血清，见【）.1。

8.2.2标准阴性血清，见D.2。

8.2.3鹅星状病毒抗原，见D.3。

8.2.4酶标二抗：兔抗鹅辣杈过氧化物酶标记的IgG,效价应在1:32以匕

8.2.5包被液,见A.5。

8.2.6洗涤液，见A.6。

8.2.7样品稀释液（封闭液），见A.7。

8.2.8底物溶液,TMB底物显色液。

8.2.9终止液（浓度为2M）,见A.8。

8.3操作步骤

8.3.1将0RF2蛋白抗原按照浓度为6.5mg/mL用1X碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释2000倍,每孔100u

L加入到96孔聚苯乙烯板中，4℃孵育过夜。孵育后洗涤液洗5次，甩干板上残余液体。

8.3.2用样品稀释液将被检血清样品稀释40倍，注意不要稀释对照血清。确保每个样品换一个吸头,

做好样品的标记。稀释的样品血清充分混匀后，加入包被孔。

8.3.3每孔加入200uL封闭液，37℃温箱孵育1h,用&3.1方法洗板。

8.3.4在Al、A2孔各加100PL阴性血清对照，A3、A4孔各加100PL阳性血清对照。

8.3.5将100uL稀释好的待检血清加入其他各孔，混匀后，37℃孵育1h,用&3.1方法洗板。

8.3.6酶标二抗用样品稀释液按1:200倍稀释，每孔加入100uL,37℃孵育1h,用8.3.1方法洗板。

8.3.7每孔加入100uLTMB显色液，37℃避光条件下孵育15min。

8.3.8每孔加入50HL终止液，轻轻振荡，终止反应。

8.3.9将酶标板置于酶标仪中，于450nm测定各孔样品的吸光值（0D）。

8.4结果判定

8.4.1试验成立的条件

鹅星状病毒间接ELISA检测方法阴性对■照0D均值=（ODA1+0DA2）/2；阳性对照0D均值=（0M+OD.v,）

/2；阳性对照平均值减去阴性对照平均值，其差必须大于0.04；阴性对照平均值必须小于等于（）.17,试

验条件成立，否则重复测定。

8.4.2试验结果的判定

8.4.2.1当样品OD.15O>O.21时，样品判定为鹅星状病毒抗体阳性。

8.4.2.2当样品OD.,5O<O.17,样品判定为鹅星状病毒抗体阴性。

8.4.2.3当样品0.17VOD450Vo.21,判为可疑，需重复测定。

9鹅星状病毒感染综合判定

根据第6章、第7章、第8章中的判定结果，可对鹅星状病毒感染进行综合判定。

9.1若患鹅与第6章中所描述相符，且第7章、第8章中结果均呈阳性，则可判定为鹅星状病毒感染。

9.2若患鹅与第6章中所描述部分相符，但第7章、第8章中结果均呈阳性，则可判定为鹅星状病毒

感染。

9.3若患鹅在第7章中的结果呈阳性，但在第8章中的结果呈阴性，也可判定为鹅星状病毒感染。反

之则不成立。

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附录A

(资料性)

相关试剂的配制(试剂要求分析纯)

A.1磷酸盐缓冲液(PBS,0.01mol/LpH7.4)

NaCl8.0g

KC10.2g

KM。』0.2g

Na2HPO(.12H2O0.2g

水加至1000mL

A.21.0*琼脂糖凝胶的配制

琼脂糖LOg

0.5XTAE电泳缓冲液加至100mL

微波炉中完全融化，待冷至50C〜60C时加入核酸染料，摇匀。倒入板上凝固后，取下梳子，备

用。

A.31XTAE电泳缓冲液的配制

A.3.1配制0.5mol/L乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na2)溶液(pH8.0)

乙二胺四乙酸钠(EDTA-Naz.2H.0)18.61g

灭菌双蒸水80.0mL

氢氧化钠调pH至8.0

水加至100mL

用于配制A.3.2中的50XTAE电泳缓冲液。

A.3.2配制50XTAE电泳缓冲液

羟基甲基氨基甲烷(Tris)242g

冰醋酸57.1mL

0.5mol/L乙二胺四乙酸钠(EDTA-Na2)溶液(pH8.0)100mL

灭菌超纯水加至1000mL

用于配制A.3.3中的1XTAE电泳缓冲液。

A.3.3配制1XTAE电泳缓冲液

50XTAE电泳缓冲液20mL

水加至1000mL

A.4核酸电泳加样缓冲液(10X)

聚蔗糖25g

灭菌双蒸水100mL

滨酚蓝0.1g

二甲苯青0.1g

A.5包被液(0.05mol/LpH9.6)

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Na2cOB0.2756g

NaHCOs0.6216g

水加至100ml.

A.6洗涤液

PBS1000mL

Tween-200.5mL

A.7样品稀释液（封闭液）

脱脂奶粉5.0g

洗涤液100mL

A.8终止液（2M）

112so4(98%)58mL

水442mL

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附录B

（资料性）

PCR及荧光定量PCR结果图

B.1PCR产物大小对照

ZOOObp

lOOObp

750bp

500bp

250bp

lOObp

V为分子量标准；l为阴性对照,2为阳性对照。

图B.1PCR产物大小对照图

B.2荧光定量PCR扩增曲线

1为阳性对照，2为阴性对照。

图B.2荧光定量PCR扩增曲线

10

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附录C

（资料性）

阳性对照病毒（SDPY）

C.1SDPY鹅星状病毒的来源

SDPY鹅星状病毒，是一种鹅源病毒，由山东农业大学禽病学实验室分离并鉴定，保藏于中国典型培

养物保藏中心（CCTCC）,其保藏编号为CCTCCNO:V201808。该病毒可由山东农业大学禽病学实验室提

供，由13日龄血清抗体阴性鹅胚接种病毒后，收集死亡胚体尿囊液后离心所得，病毒滴度21（r°ELD5。。

C.2SDPY鹅星状病毒涉及的专利信息

该病毒株涉及以下专利：

•种防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗及其制备方法。专利号：ZL201810494586.X,专利公布日：

2020.0