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文档简介
光电离质谱技术:生物组织成像与茶叶热加工的创新应用与机制探索一、引言1.1研究背景与意义随着科学技术的飞速发展,分析检测技术在各个领域中发挥着日益重要的作用。光电离质谱技术作为一种先进的分析手段,近年来在生物医学、材料科学、环境监测以及食品科学等领域得到了广泛的关注和应用。它利用真空紫外光作为电离源,具有“软电离”特性,能够在不产生过多碎片离子的情况下,实现对样品中分子的高效电离和准确检测,为复杂体系样品的分析提供了新的思路和方法。在生物组织成像领域,传统的成像技术如光学成像、核磁共振成像等虽然能够提供生物组织的形态和结构信息,但对于生物分子的种类和分布情况的检测存在一定的局限性。而质谱成像技术的出现,为生物组织中分子的可视化分析提供了可能。光电离质谱成像技术作为质谱成像技术的一种,结合了光电离技术和质谱成像的优势,能够在无需复杂样品前处理的情况下,实现对生物组织中多种内源性化合物的原位可视化分析。例如,中国科学技术大学国家同步辐射实验室潘洋等研究团队发展的常压透射式激光解吸/后光电离质谱成像技术(t-AP-LDI/PI-MSI),通过将透射式激光解吸电离和紧凑型后紫外光电离装置结合,显著提高了空间分辨率和灵敏度,能够清晰地观测到小鼠海马组织的亚区结构以及多种内源性化合物的分布情况。该技术在肿瘤研究中也展现出了巨大的潜力,通过分析肿瘤组织的代谢物分布,揭示了黑素瘤微环境的代谢异质性,为深入了解肿瘤发生的复杂分子机制提供了重要的参考依据。茶叶作为世界上广泛饮用的饮品之一,其品质和加工过程一直是研究的热点。茶叶的品质受到多种因素的影响,包括品种、产地、采摘季节以及加工工艺等。其中,茶叶的热加工过程是影响茶叶品质的关键环节之一,它涉及到一系列复杂的物理和化学变化,如茶多酚的氧化、蛋白质的变性、香气物质的形成等。传统的茶叶品质分析方法主要包括感官评价、理化分析等,这些方法虽然能够对茶叶的品质进行一定程度的评估,但存在主观性强、分析速度慢、无法全面反映茶叶品质等问题。而质谱技术作为一种高精度、高灵敏的分析手段,已被广泛应用于茶叶分析领域。光电离质谱技术在茶叶热加工中的应用,可以实时监测茶叶热加工过程中挥发性成分和非挥发性成分的变化,深入研究茶叶热加工过程中的化学反应机制,为优化茶叶加工工艺、提高茶叶品质提供科学依据。综上所述,光电离质谱技术在生物组织成像和茶叶热加工领域具有重要的研究价值和应用前景。通过对该技术的深入研究和应用,可以为生物医学研究提供更加准确、全面的分子信息,为茶叶产业的发展提供有力的技术支持,推动相关领域的科学研究和技术进步。1.2国内外研究现状在生物组织成像领域,国外对于光电离质谱成像技术的研究起步较早,并且在技术研发和应用方面取得了一系列重要成果。美国普渡大学的研究团队利用光电离质谱成像技术对生物组织中的脂质和代谢物进行分析,通过优化实验条件和数据处理方法,实现了对生物组织中分子分布的高分辨率成像,为研究生物组织的生理和病理过程提供了重要的技术支持。日本的科研人员则将光电离质谱成像技术应用于药物代谢研究,通过监测药物在生物组织中的分布和代谢情况,深入了解药物的作用机制和体内过程,为药物研发和临床应用提供了有价值的参考。国内在该领域的研究也取得了显著进展。中国科学技术大学国家同步辐射实验室潘洋教授的研究团队在光电离质谱成像技术方面做出了突出贡献。他们发展的常压透射式激光解吸/后光电离质谱成像技术(t-AP-LDI/PI-MSI),通过将透射式激光解吸电离和紧凑型后紫外光电离装置结合,显著提高了空间分辨率和灵敏度,能够清晰地观测到小鼠海马组织的亚区结构以及多种内源性化合物的分布情况,在肿瘤研究中也展现出了巨大的潜力,通过分析肿瘤组织的代谢物分布,揭示了黑素瘤微环境的代谢异质性,为深入了解肿瘤发生的复杂分子机制提供了重要的参考依据。此外,国内还有多个科研团队致力于光电离质谱成像技术的研究,在仪器研发、方法学创新以及应用拓展等方面都取得了一定的成果。在茶叶热加工领域,国外对于质谱技术在茶叶分析中的应用研究主要集中在茶叶成分分析和品质评价方面。例如,一些研究利用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)对茶叶中的挥发性成分进行分析,通过对挥发性成分的种类和含量的研究,探讨茶叶的香气特征和品质差异。还有一些研究采用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)对茶叶中的非挥发性成分进行分析,如茶多酚、咖啡碱等,为茶叶的品质评价和质量控制提供了科学依据。国内在茶叶热加工与质谱技术结合的研究方面也取得了不少成果。一些研究利用质谱技术对茶叶热加工过程中的化学成分变化进行监测,通过分析茶多酚、氨基酸、香气物质等成分的变化,揭示茶叶热加工过程中的化学反应机制。还有一些研究将质谱技术与感官评价相结合,建立了茶叶品质的综合评价模型,为茶叶的品质提升和加工工艺优化提供了有力的支持。然而,目前国内外在光电离质谱技术的研究和应用中仍存在一些不足之处。在生物组织成像方面,虽然光电离质谱成像技术在空间分辨率和灵敏度方面有了一定的提高,但与传统的光学成像技术相比,其成像速度较慢,数据处理复杂,限制了该技术的广泛应用。此外,对于一些复杂生物组织中低丰度分子的检测,还需要进一步提高检测灵敏度和选择性。在茶叶热加工领域,虽然质谱技术在茶叶成分分析和品质评价方面取得了一定的成果,但对于茶叶热加工过程中一些关键化学反应的原位监测和实时分析还存在困难,需要开发更加先进的质谱技术和分析方法。同时,如何将质谱技术与茶叶加工工艺紧密结合,实现茶叶品质的精准调控,也是未来研究的重点方向之一。1.3研究内容与方法1.3.1研究内容本研究旨在深入探索光电离质谱技术在生物组织成像和茶叶热加工领域的应用,具体研究内容如下:基于光电离质谱技术的生物组织成像方法研究:优化光电离质谱成像实验条件:系统研究激光能量、光斑大小、扫描速度、光电离能量等实验参数对成像分辨率和灵敏度的影响,通过单因素实验和正交实验等方法,确定最佳的实验条件组合,以提高生物组织成像的质量和准确性。例如,在研究激光能量对成像分辨率的影响时,设置不同的激光能量梯度,对同一生物组织样品进行成像,比较不同能量下成像的清晰度和细节表现,从而确定最适宜的激光能量范围。开发生物组织中分子的定性和定量分析方法:建立基于光电离质谱成像数据的分子定性和定量分析方法,利用标准物质和数据库进行比对,结合谱图解析和数据分析技术,实现对生物组织中多种内源性化合物的准确鉴定和定量分析。例如,通过对已知标准物质的质谱图进行分析,建立特征离子峰库,然后将生物组织成像得到的质谱数据与库中的数据进行匹配,从而确定生物组织中分子的种类和含量。应用于生物医学研究:将优化后的光电离质谱成像技术应用于肿瘤组织、神经组织等生物医学样本的分析,研究生物分子在组织中的分布规律及其与疾病发生、发展的关系,为疾病的诊断和治疗提供新的分子信息和研究思路。比如,通过对肿瘤组织和正常组织的光电离质谱成像对比分析,寻找肿瘤特异性的分子标志物,为肿瘤的早期诊断和精准治疗提供依据。光电离质谱技术在茶叶热加工过程中的应用研究:监测茶叶热加工过程中挥发性成分的变化:采用顶空固相微萃取-光电离质谱联用技术(HS-SPME-PIMS),实时监测茶叶在杀青、揉捻、干燥等热加工过程中挥发性成分的种类和含量变化,分析挥发性成分的生成和转化规律,揭示茶叶香气形成的化学机制。例如,在茶叶杀青过程中,每隔一定时间采集挥发性成分进行质谱分析,观察不同阶段挥发性成分的变化情况,探讨杀青温度、时间等因素对香气成分形成的影响。分析茶叶热加工过程中非挥发性成分的转化:运用超声辅助提取-高效液相色谱-光电离质谱联用技术(UA-HPLC-PIMS),对茶叶热加工过程中茶多酚、氨基酸、咖啡碱等非挥发性成分的含量和结构变化进行分析,研究非挥发性成分在热加工过程中的化学反应机制,为优化茶叶加工工艺提供科学依据。比如,通过对不同加工阶段茶叶中茶多酚含量的测定和结构分析,了解茶多酚在热加工过程中的氧化、聚合等反应情况,从而确定最佳的加工工艺参数,以保留或提高茶叶中有益成分的含量。建立茶叶品质与热加工工艺的关联模型:综合考虑茶叶热加工过程中挥发性成分和非挥发性成分的变化,结合感官评价结果,运用多元统计分析方法,如主成分分析(PCA)、偏最小二乘回归(PLSR)等,建立茶叶品质与热加工工艺之间的关联模型,实现对茶叶品质的预测和调控。例如,收集不同加工工艺条件下茶叶的成分数据和感官评价得分,利用PCA方法对数据进行降维处理,找出影响茶叶品质的主要成分和关键工艺因素,再通过PLSR建立品质预测模型,为茶叶加工工艺的优化提供指导。1.3.2研究方法本研究将综合运用实验研究、数据分析和理论模拟等多种方法,确保研究的科学性和可靠性。实验研究方法:样品制备:在生物组织成像研究中,采集新鲜的生物组织样本,如小鼠的肿瘤组织、脑组织等,迅速冷冻并切成薄片,用于后续的质谱成像分析。在茶叶热加工研究中,选取不同品种的茶叶鲜叶,按照传统的茶叶加工工艺进行热加工处理,制备不同加工阶段的茶叶样品。仪器分析:使用自行搭建或改装的光电离质谱成像系统,对生物组织切片进行成像分析。该系统主要包括激光解吸装置、真空紫外光电离源、质谱仪以及数据采集和处理系统等。在茶叶热加工研究中,利用HS-SPME-PIMS和UA-HPLC-PIMS联用技术,对茶叶样品中的挥发性成分和非挥发性成分进行分析。其中,HS-SPME用于提取茶叶中的挥发性成分,UA-HPLC用于分离茶叶中的非挥发性成分,PIMS则用于对分离后的成分进行检测和分析。感官评价:邀请专业的茶叶审评人员,按照国家标准的感官评价方法,对不同加工工艺处理后的茶叶进行感官审评,包括外形、香气、滋味、汤色和叶底等方面的评价,为建立茶叶品质与热加工工艺的关联模型提供数据支持。数据分析方法:数据预处理:对光电离质谱成像数据和茶叶成分分析数据进行预处理,包括去除噪声、基线校正、峰识别和积分等操作,提高数据的质量和准确性。例如,采用滤波算法去除质谱数据中的噪声,通过基线校正算法消除基线漂移对数据的影响。多元统计分析:运用主成分分析(PCA)、偏最小二乘回归(PLSR)、聚类分析(CA)等多元统计分析方法,对实验数据进行分析和处理。PCA用于对数据进行降维处理,提取主要成分,揭示数据的内在结构和规律;PLSR用于建立茶叶品质与热加工工艺之间的定量关系模型;CA用于对不同样品进行分类和比较,分析样品之间的相似性和差异性。相关性分析:分析生物组织中分子的分布与疾病发生、发展之间的相关性,以及茶叶热加工过程中成分变化与茶叶品质之间的相关性,找出关键的影响因素和作用机制。例如,通过计算生物分子的含量与疾病指标之间的相关系数,判断它们之间的相关性强弱,从而确定生物分子在疾病发生过程中的作用。理论模拟方法:运用量子化学计算和分子动力学模拟等理论方法,对茶叶热加工过程中的化学反应机理进行模拟和研究。通过计算反应物、中间体和产物的能量、结构和反应路径等参数,深入理解茶叶热加工过程中成分变化的本质原因,为实验研究提供理论支持和指导。例如,利用量子化学计算方法研究茶多酚在热加工过程中的氧化反应机理,通过计算反应活化能和反应热等参数,解释反应的难易程度和方向,为优化茶叶加工工艺提供理论依据。二、光电离质谱技术概述2.1技术原理光电离质谱技术的基本原理是利用光作为电离源,使样品分子吸收光子能量后发生电离。具体而言,当具有特定能量的光子与样品分子相互作用时,光子的能量被分子吸收,分子中的电子获得足够的能量从而摆脱原子核的束缚,形成离子。这种电离方式与传统的电子轰击电离(EI)等“硬”电离方式不同,它属于“软”电离技术。在“硬”电离过程中,样品分子会受到较高能量的作用,往往会产生大量的碎片离子,这虽然有助于获取分子的结构信息,但同时也会使谱图变得复杂,增加了分析的难度。而光电离质谱技术的“软”电离特性,能够在较低的能量下实现分子的电离,最大限度地保留了分子的完整性,产生的碎片离子较少。这使得质谱图相对简单,更容易识别和解析分子离子峰,从而能够准确地获取样品分子的相对分子质量等关键信息,保留产物的原始信息,为后续的分析和研究提供了极大的便利。以生物组织中的脂质分析为例,脂质分子通常具有复杂的结构和多样的种类。采用传统的电离方法时,由于脂质分子容易发生碎片化,很难准确地确定其分子组成和结构。而利用光电离质谱技术,能够在不破坏脂质分子结构的前提下实现电离,通过检测分子离子峰,可以直接获取脂质分子的相对分子质量,进而推断其分子组成和结构。在茶叶热加工研究中,对于茶叶中的香气成分分析,“软”电离特性可以使香气成分的分子离子完整地被检测到,有助于准确鉴定香气成分的种类和含量,深入研究茶叶香气形成的化学机制。2.2关键技术与装置构成光电离质谱技术的实现依赖于多个关键技术和装置组件,这些组件协同工作,确保了技术的高效运行和准确分析。光源是光电离质谱技术中的核心部件之一,其作用是产生具有特定能量的光子,为样品分子的电离提供能量来源。在众多光源中,真空紫外灯(VUV)是常用的一种。它能够发射出10-200nm波长范围的真空紫外光,这一能量范围恰好能够满足大多数有机分子的电离需求。以氘灯为例,其发射的118nm和160nm左右的真空紫外光,在对生物组织中的脂质、蛋白质以及茶叶中的香气成分等分子进行光电离时表现出良好的效果。此外,同步辐射光源也是一种性能卓越的光源选择。它具有高亮度、宽频谱、连续可调等优点,能够提供更为精确和多样化的光子能量。在研究复杂生物组织中低丰度分子的电离时,同步辐射光源的高亮度特性可以有效提高检测灵敏度,使得对这些分子的检测成为可能。电离室是样品分子发生光电离的场所。它需要具备良好的真空环境,以减少样品分子与其他气体分子的碰撞,保证电离过程的顺利进行。电离室内部通常设置有进样系统,用于将样品引入电离室。常见的进样方式包括直接进样、气相色谱进样和液相色谱进样等。直接进样适用于气态或挥发性较强的样品,能够快速将样品引入电离室进行分析;气相色谱进样则可以实现对复杂混合物中不同成分的分离和依次电离分析,提高分析的选择性和准确性;液相色谱进样则主要用于分析非挥发性或热不稳定的样品,通过液相色谱的分离作用,将样品中的目标成分输送到电离室进行电离。在对茶叶热加工过程中挥发性成分的监测中,采用顶空固相微萃取-光电离质谱联用技术(HS-SPME-PIMS)时,HS-SPME装置将提取的挥发性成分通过进样系统引入电离室,在真空紫外光的作用下发生电离。质量分析器是光电离质谱仪的关键组成部分,其主要功能是根据离子的质荷比(m/z)对电离产生的离子进行分离和检测。不同类型的质量分析器具有各自独特的工作原理和性能特点。飞行时间质量分析器(TOF-MS)是一种常用的质量分析器,它通过测量离子在无场飞行空间中的飞行时间来确定离子的质荷比。离子在电场的加速作用下获得相同的动能,由于不同质荷比的离子具有不同的速度,它们在飞行过程中会逐渐分离,通过检测离子到达检测器的时间,就可以计算出离子的质荷比。TOF-MS具有质量范围宽、扫描速度快、灵敏度高等优点,能够在短时间内对大量离子进行快速分析,非常适合用于生物组织成像和茶叶成分分析等需要高通量检测的应用场景。四极杆质量分析器则是利用射频电场和直流电场的组合,使离子在四极杆之间的空间内作复杂的运动,只有特定质荷比的离子能够稳定通过四极杆到达检测器。它具有结构简单、成本较低、分辨率适中等特点,在一些对分辨率要求不是特别高,但需要对特定质量范围的离子进行精确检测的场合得到了广泛应用。在对茶叶中某些特定农药残留进行检测时,四极杆质量分析器可以准确地筛选出目标离子,实现对农药残留的定性和定量分析。检测器的作用是将经过质量分析器分离后的离子信号转化为电信号,并进行放大和记录,以便后续的数据处理和分析。常用的检测器包括电子倍增器和微通道板等。电子倍增器通过一系列的二次电子发射过程,将离子信号逐级放大,从而提高检测的灵敏度。它具有响应速度快、增益高等优点,能够对微弱的离子信号进行有效检测。微通道板则是由大量的微通道组成,每个微通道都可以作为一个独立的电子倍增器,当离子撞击到微通道板表面时,会产生二次电子,这些二次电子在微通道内不断倍增,最终输出一个较强的电信号。微通道板具有高增益、高分辨率等特点,适用于对离子信号的高精度检测。在生物组织成像中,微通道板检测器可以准确地检测到生物分子电离产生的离子信号,为后续的成像分析提供可靠的数据基础。2.3技术优势光电离质谱技术凭借其独特的原理和装置构成,在实际应用中展现出诸多显著优势,为生物组织成像和茶叶热加工等领域的研究提供了有力支持。该技术具有高灵敏度和高分辨率的特点。在生物组织成像方面,能够检测到生物组织中极低含量的分子,实现对低丰度生物标志物的精准定位和分析。例如,在肿瘤组织的研究中,即使是含量极少的肿瘤特异性代谢物,光电离质谱成像技术也能敏锐地捕捉到其信号,并清晰地呈现出其在组织中的分布情况。通过精确的质量分析和高分辨率的成像,能够准确区分不同质荷比的离子,为深入研究生物分子的结构和功能提供了详细的信息。在茶叶热加工研究中,高灵敏度使得能够检测到茶叶在热加工过程中微量香气成分的变化,高分辨率则有助于准确鉴定这些香气成分的结构和种类,从而深入揭示茶叶香气形成的化学机制。宽适应性也是其重要优势之一。光电离质谱技术能够适应多种样品类型,无论是生物组织中的固体切片、液体样本,还是茶叶加工过程中的固态茶叶、挥发性气体等,都可以进行有效的分析。对于不同性质的样品,如极性分子、非极性分子、热不稳定分子等,该技术都能实现高效电离和准确检测。以茶叶中的茶多酚和咖啡碱等极性分子,以及香气成分中的非极性分子为例,光电离质谱技术都能成功地对它们进行分析,为全面了解茶叶的成分和品质提供了可能。原位监测能力是光电离质谱技术的一大亮点。在生物组织成像中,它可以直接对生物组织切片进行分析,无需对样品进行复杂的预处理,避免了样品制备过程中可能引入的误差和干扰,能够真实地反映生物分子在组织中的原始分布状态。在茶叶热加工过程中,能够实时监测茶叶在杀青、揉捻、干燥等各个阶段的成分变化,为研究茶叶热加工过程中的化学反应动力学提供了实时数据。比如,在茶叶杀青过程中,通过原位监测可以及时观察到茶多酚的氧化、香气物质的生成等反应的动态变化,为优化杀青工艺提供了科学依据。该技术无需色谱分离步骤,简化了分析流程,提高了分析效率。传统的分析方法中,色谱分离往往需要耗费大量的时间和试剂,而且可能会导致样品的损失和成分的改变。而光电离质谱技术直接对样品进行电离和检测,避免了这些问题,能够快速地获得样品的质谱信息。在对茶叶复杂成分的分析中,无需繁琐的色谱分离过程,即可快速检测到茶叶中的各种成分,大大缩短了分析时间,提高了分析效率。此外,光电离质谱技术还具有多功能的优势。它不仅可以用于生物组织成像和茶叶热加工研究中的成分分析,还可以与其他技术相结合,拓展其应用范围。例如,与显微镜技术结合,实现对生物组织的微观成像和分子分析的双重功能;与核磁共振技术结合,从不同角度获取样品的结构和组成信息,为深入研究提供更全面的数据支持。在茶叶研究中,与感官评价相结合,能够更全面地评价茶叶的品质,为茶叶产业的发展提供更有力的技术支持。三、在生物组织成像中的应用3.1生物组织成像技术现状生物组织成像技术在现代生命科学研究中扮演着举足轻重的角色,它为深入探究生物组织的结构与功能提供了直观且关键的信息。当前,常见的生物组织成像技术种类繁多,各自具备独特的原理、优势及应用场景,同时也存在一定的局限性。光学成像技术是较为常用的生物组织成像手段之一,其中荧光成像凭借其高灵敏度和特异性,在细胞和分子水平的研究中应用广泛。它通过标记荧光探针,能够对特定的生物分子或细胞进行精准成像。例如,在肿瘤细胞的研究中,利用荧光标记的抗体可以特异性地识别肿瘤细胞表面的标志物,从而清晰地显示肿瘤细胞的位置和分布情况。然而,荧光成像依赖于荧光探针的选择和标记,这可能会对生物样本的生理状态产生一定的干扰,并且荧光信号容易受到光漂白和背景噪声的影响,限制了其在深层组织成像中的应用。核磁共振成像(MRI)则是基于原子核在强磁场中的共振特性来实现成像的。它能够提供高分辨率的生物组织三维结构信息,对软组织具有良好的分辨能力,在医学诊断中发挥着重要作用,如用于脑部疾病、心血管疾病的诊断等。但MRI设备昂贵,成像时间较长,对一些微小的生物分子或快速变化的生理过程的检测能力有限。电子显微镜成像技术包括扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM),具有极高的空间分辨率,能够观察到生物组织的微观结构,如细胞的超微结构、细胞器的形态等。SEM可以提供生物组织表面的形貌信息,TEM则能够深入分析生物组织内部的结构细节。不过,电子显微镜成像需要对样品进行复杂的制备,如固定、脱水、包埋等,且样品通常需要在高真空环境下进行观测,这可能会导致样品的结构发生改变,无法真实反映生物组织在生理状态下的情况。质谱成像技术作为一种新兴的生物组织成像技术,近年来得到了快速发展。它能够在分子水平上直接获取生物组织中化学成分的空间分布信息,无需预先标记目标分子,可同时检测多种内源性化合物。其中,光电离质谱成像技术结合了光电离技术和质谱成像的优势,在生物组织成像领域展现出独特的潜力。与传统的基质辅助激光解吸电离质谱成像(MALDI-MSI)相比,光电离质谱成像技术不需要在样品表面涂布基质,避免了基质干扰和离子抑制等问题,能够实现对生物组织中多种极性和非极性分子的高灵敏度检测。例如,中国科学技术大学国家同步辐射实验室潘洋等研究团队发展的常压透射式激光解吸/后光电离质谱成像技术(t-AP-LDI/PI-MSI),通过将透射式激光解吸电离和紧凑型后紫外光电离装置结合,显著提高了空间分辨率和灵敏度,能够清晰地观测到小鼠海马组织的亚区结构以及多种内源性化合物的分布情况。综上所述,不同的生物组织成像技术各有优劣,在实际应用中需要根据研究目的和样品特点选择合适的成像技术。光电离质谱成像技术作为一种具有独特优势的新兴成像技术,为生物组织成像领域带来了新的发展机遇,有望在未来的生物医学研究中发挥更加重要的作用。3.2技术应用实例3.2.1小鼠海马组织成像在神经科学研究中,深入了解小鼠海马组织的结构和功能对于揭示学习、记忆以及神经退行性疾病的发病机制至关重要。中国科学技术大学国家同步辐射实验室潘洋等研究团队利用常压透射式激光解吸/后光电离质谱成像技术(t-AP-LDI/PI-MSI)对小鼠海马组织进行成像分析,为神经科学研究提供了新的视角和方法。实验过程中,首先选取健康的小鼠,通过颈椎脱臼法迅速处死,然后迅速取出大脑组织,将其置于液氮中速冻,以保持组织中生物分子的原始状态。接着,使用冷冻切片机将大脑组织切成厚度约为10-20μm的薄片,并将切片放置在导电玻璃片上。随后,利用t-AP-LDI/PI-MSI系统对小鼠海马组织切片进行成像分析。该系统中的透射式激光解吸电离装置将组织切片中的生物分子解吸出来,形成气态分子。这些气态分子随后进入紧凑型后紫外光电离装置,在真空紫外光的作用下发生电离,产生离子。离子经过质量分析器的分离和检测,最终得到不同质荷比离子的信号强度和空间分布信息。在成像过程中,对激光能量、光斑大小、扫描速度、光电离能量等关键实验参数进行了精细优化。通过单因素实验,研究人员发现随着激光能量的增加,解吸效率提高,但过高的激光能量可能会导致组织损伤和分子碎片化;光斑大小会影响成像的空间分辨率,较小的光斑能够实现更高的分辨率,但信号强度会相应降低;扫描速度则与成像时间和数据采集的完整性相关,需要在保证成像质量的前提下选择合适的扫描速度;光电离能量对电离效率和离子的稳定性有重要影响,经过一系列实验,确定了最佳的光电离能量范围,以实现对生物分子的高效电离和准确检测。通过对小鼠海马组织的成像分析,研究人员成功观测到了海马组织的亚区结构,如齿状回、上丘臂和海马角等,这些结构在传统的光学成像中难以清晰分辨。同时,还获得了多种内源性化合物在海马组织中的分布情况,包括组胺、腺苷、胆碱、腺嘌呤、维生素D3、胆固醇、谷氨酸、苏氨酸、鸟嘌呤、神经酰胺以及多种脂质如脂肪酸、PE、PA、MAG、DG、HexCer和GalCer等。这些内源性化合物在海马组织的不同亚区呈现出特异性的分布模式。例如,组胺在齿状回区域的含量相对较高,而在海马角区域的含量较低;脂肪酸在海马组织的细胞膜中呈均匀分布,而神经酰胺则在特定的细胞层中富集。这些成像结果对于神经科学研究具有重要价值。首先,通过对海马组织亚区结构的清晰观测,为进一步研究不同亚区的功能提供了直观的形态学依据。不同亚区在学习、记忆等神经活动中可能扮演着不同的角色,准确了解其结构有助于深入探究神经信号的传导和处理机制。其次,内源性化合物的分布信息揭示了海马组织中复杂的代谢网络。这些化合物参与了神经递质的合成与代谢、细胞膜的构建与功能维持、细胞信号传导等重要生理过程,它们的分布变化可能与神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病等的发生发展密切相关。通过对这些化合物分布的研究,可以为神经退行性疾病的早期诊断和治疗提供潜在的生物标志物和治疗靶点。此外,该研究还为神经科学领域的药物研发提供了重要的参考,有助于评估药物在海马组织中的分布和作用效果,为开发更有效的神经治疗药物奠定基础。3.2.2黑素瘤组织成像肿瘤代谢重编程被认为是各种类型癌症恶性转化的新标志,深入研究肿瘤组织的代谢物分布对于揭示肿瘤发生机制具有重要意义。中国科学技术大学国家同步辐射实验室的研究团队利用常压透射式激光解吸/后光电离质谱成像技术(t-AP-LDI/PI-MSI)对黑素瘤组织进行分析,为肿瘤研究提供了新的思路和方法。在实验中,首先获取新鲜的黑素瘤组织样本,这些样本来源于临床手术切除的肿瘤组织。为了确保样本的生物学活性和代谢物的稳定性,在获取样本后,立即将其置于液氮中速冻,然后进行冷冻切片处理,制备厚度约为10-20μm的组织切片。将制备好的切片放置在特制的样品台上,用于后续的质谱成像分析。利用t-AP-LDI/PI-MSI系统对黑素瘤组织切片进行成像时,透射式激光解吸电离装置将组织中的代谢物解吸出来,形成气态分子,随后这些气态分子进入紧凑型后紫外光电离装置,在真空紫外光的作用下发生电离,产生离子。离子经过质量分析器的分离和检测,得到不同质荷比离子的信号强度和空间分布信息。在实验过程中,对激光能量、光斑大小、扫描速度等参数进行了优化,以提高成像的分辨率和灵敏度。例如,通过调整激光能量,使解吸效率达到最佳状态,同时避免对组织造成过度损伤;选择合适的光斑大小,在保证足够信号强度的前提下,实现更高的空间分辨率;优化扫描速度,确保在合理的时间内完成成像,并获得完整的数据。通过对黑素瘤组织的成像分析,研究人员成功揭示了黑素瘤微环境的代谢异质性。在正离子模式和负离子模式下,均检测到多种内源性化合物在黑素瘤组织中的特异性分布。一些与肿瘤细胞增殖、侵袭相关的代谢物,如某些氨基酸、脂肪酸和脂质等,在肿瘤组织的不同区域呈现出明显的浓度差异。在肿瘤细胞密集区域,参与能量代谢和细胞增殖的代谢物含量显著升高,这表明肿瘤细胞在此区域具有旺盛的代谢活动和快速的增殖能力。而在肿瘤边缘区域,与细胞迁移和侵袭相关的代谢物浓度较高,显示出肿瘤细胞向周围组织浸润的趋势。这些成像结果对于揭示肿瘤发生机制具有重要作用。首先,代谢物分布的异质性反映了黑素瘤细胞在不同区域的生物学行为差异,有助于深入理解肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移机制。通过分析这些代谢物的变化规律,可以发现潜在的肿瘤驱动因子和治疗靶点。其次,代谢通路分析可以进一步揭示肿瘤细胞代谢重编程的具体过程和调控机制。例如,通过对参与糖代谢、脂代谢和氨基酸代谢等关键代谢通路的代谢物进行分析,发现肿瘤细胞在代谢过程中存在特定的代谢途径激活和抑制现象,这为开发针对肿瘤代谢的靶向治疗策略提供了理论依据。此外,这些成像结果还可以为肿瘤的早期诊断和预后评估提供新的生物标志物。通过检测肿瘤组织中特定代谢物的分布和含量变化,可以实现对肿瘤的早期检测和病情监测,为临床治疗提供更准确的信息。3.3应用效果与挑战在生物组织成像中,光电离质谱成像技术展现出了独特的应用效果。以中国科学技术大学国家同步辐射实验室发展的常压透射式激光解吸/后光电离质谱成像技术(t-AP-LDI/PI-MSI)为例,其空间分辨率得到了显著提升,可达4μm。这一高分辨率使得研究人员能够清晰地观测到生物组织的精细结构,如在小鼠海马组织成像中,成功分辨出齿状回、上丘臂和海马角等亚区结构,为深入研究神经组织的功能提供了直观的形态学依据。在灵敏度方面,后光电离的引入使得该技术对多种内源性化合物的探测灵敏度提高了2-3个量级,能够检测到生物组织中低丰度的分子,如组胺、腺苷、胆碱等,为揭示生物分子的分布规律和代谢机制提供了有力支持。然而,该技术在实际应用中也面临着诸多挑战。成像速度较慢是一个较为突出的问题。在对生物组织进行成像时,需要对样品表面逐点进行扫描分析,这一过程较为耗时,导致成像速度无法满足一些快速检测的需求。例如,在临床手术中,需要快速获取生物组织的分子信息以指导手术决策,但目前的光电离质谱成像技术难以在短时间内完成成像分析,限制了其在临床实时诊断中的应用。数据处理复杂也是一个亟待解决的难题。光电离质谱成像技术产生的数据量庞大,包含了大量的质谱信息和空间坐标信息。对这些数据进行有效的处理和分析,从中提取有价值的生物分子信息,需要复杂的数据处理算法和专业的数据分析软件。目前,虽然已经开发了一些数据处理方法,但在数据的准确性、可靠性以及处理效率等方面仍存在不足。例如,在对复杂生物组织的成像数据进行分析时,由于生物分子的种类繁多、相互作用复杂,现有的数据处理方法难以准确地识别和定量分析所有的生物分子,容易出现误判和漏判的情况。此外,仪器设备的成本较高也限制了该技术的广泛应用。光电离质谱成像系统通常需要配备高能量的光源、高分辨率的质量分析器以及高精度的扫描装置等,这些设备的研发和制造成本高昂,使得仪器的售价居高不下,只有少数科研机构和大型医院有能力购置和使用,限制了技术的普及和推广。为了解决这些问题,研究人员正在积极探索新的技术和方法。在提高成像速度方面,一些研究尝试采用并行扫描技术或改进扫描策略,以减少扫描时间,提高成像效率。例如,开发多光束扫描技术,同时对多个区域进行扫描分析,从而加快成像速度。在数据处理方面,不断优化和开发新的数据处理算法,引入人工智能和机器学习技术,提高数据处理的准确性和效率。通过建立大数据模型,利用机器学习算法对质谱数据进行自动分类和分析,能够快速准确地识别生物分子,并预测其功能和相互作用。针对仪器成本高的问题,加强仪器的国产化研发和生产,降低生产成本,提高仪器的性价比,以促进技术的广泛应用。同时,探索与其他成像技术的联用,实现优势互补,也是未来的发展方向之一。例如,将光电离质谱成像技术与光学成像技术相结合,既能够获取生物组织的分子信息,又能够获得高分辨率的形态学信息,为生物医学研究提供更全面的信息。四、在茶叶热加工中的应用4.1茶叶热加工工艺及成分变化茶叶热加工是一个复杂的过程,涉及多种工艺环节,不同的茶叶品种和加工工艺会导致茶叶成分发生不同的变化。以绿茶为例,其传统加工工艺主要包括摊放、杀青、揉捻和干燥等步骤。在摊放过程中,鲜叶中的水分逐渐散失,细胞呼吸作用增强,酶活性发生变化,这会促使茶叶中的一些化学成分发生转化。研究表明,随着摊放时间的延长,茶叶中的茶多酚、氨基酸等含量会发生改变,其中茶多酚含量略有下降,而氨基酸含量则有所上升。这是因为在摊放过程中,茶多酚会发生轻微的氧化,同时蛋白质水解产生更多的氨基酸。杀青是绿茶加工的关键环节,通过高温破坏鲜叶中的酶活性,阻止茶多酚的酶促氧化,从而保留绿茶的“清汤绿叶”特征。在杀青过程中,由于高温的作用,茶叶中的水分迅速蒸发,细胞结构被破坏,化学成分也发生了显著变化。中国农业科学院茶叶研究所的于帅、戴伟东,浙江省疾病预防控制中心的胡争艳等人采用基于超高效液相色谱-四极杆轨道阱质谱(UPLC-Q-Exactive/MS)的代谢组学分析方法对绿茶杀青过程进行研究,发现大部分儿茶素类和二聚儿茶素类化合物含量呈现下降趋势。这是因为在高温杀青时,儿茶素类物质会发生氧化、异构化等反应,导致其含量减少。同时,一些挥发性成分如青叶醇、青叶醛等会大量挥发,而一些新的香气成分如吡嗪类、吡咯类等开始形成,这些新的香气成分赋予了绿茶独特的香气。揉捻则是通过外力作用使茶叶细胞破碎,茶汁渗出,使茶叶的形状更加紧致,同时也促进了茶叶中化学成分的相互作用。在揉捻过程中,茶多酚与蛋白质、多糖等物质发生结合,形成了一些大分子复合物,这些复合物对茶叶的滋味和口感有重要影响。此外,揉捻还会使茶叶中的香气成分进一步释放和转化,增强了茶叶的香气。干燥是绿茶加工的最后一道工序,也是香气成分形成的关键环节。在干燥过程中,茶叶中的水分被进一步蒸发,温度的升高促使茶叶中的化学成分发生一系列复杂的化学反应。研究发现,在干燥过程中,茶叶中的氨基酸与糖类会发生美拉德反应,生成多种香气物质,如醛类、酮类、吡嗪类等,这些香气物质使绿茶的香气更加浓郁。同时,儿茶素类物质在干燥过程中也会继续发生氧化和聚合反应,进一步影响茶叶的色泽和滋味。对于红茶而言,其加工工艺主要包括萎凋、揉捻、发酵和干燥。萎凋过程中,鲜叶失水,细胞液浓度增加,酶活性增强,茶多酚等成分开始发生缓慢的氧化。揉捻使茶叶细胞破碎,为后续的发酵提供了条件。发酵是红茶加工的核心工序,在这个过程中,茶多酚在多酚氧化酶的作用下发生氧化聚合,形成茶黄素、茶红素和茶褐素等色素物质,这些色素物质是红茶汤色和滋味的主要形成物质。有研究表明,在发酵过程中,茶黄素和茶红素的含量逐渐增加,而茶多酚的含量则显著下降。干燥阶段则进一步促进了香气物质的形成和固定,使红茶具有独特的香气和风味。黄茶的加工工艺中,闷黄是其独特的工序。在闷黄过程中,茶叶在湿热条件下,多酚类化合物发生非酶性氧化,叶绿素分解,导致茶叶的色泽变黄。同时,多糖、蛋白质水解形成单糖及氨基酸,这些成分在后续的干燥过程中,由于热的作用,与茶多酚等化合物相互作用形成芳香物质。安徽农业大学的研究表明,黄大茶经杀青后,多酚酶和过氧化物酶的活性已完全破坏,但在闷黄过程中又出现酶活性的回升,这是因为微生物类群和数量发生变化,如黑曲霉数量的增加,导致多酚氧化酶活性的回升,而事实上不是茶叶内含酶的复活,而是微生物提供的外源酶的结果。这些变化对黄茶独特品质的形成起到了关键作用。4.2技术应用实例4.2.1绿茶加工过程分析中国农业科学院茶叶研究所的于帅、戴伟东,浙江省疾病预防控制中心的胡争艳等人采用基于超高效液相色谱-四极杆轨道阱质谱(UPLC-Q-Exactive/MS)的代谢组学分析方法,对绿茶杀青、干燥与焙火过程样品进行了系统分析。他们选取了‘白叶1号’‘中黄1号’‘龙井43’3个茶树品种的鲜叶原料,经UPLC-Q-Exactive/MS对茶叶样品进行代谢组学分析后,与前期研究结果进行化合物比对,在绿茶鲜叶样、摊放样、杀青样、揉捻样、足火干燥样、焙火样中鉴定出125种化合物,分为12类,其中包括黄烷醇类、二聚儿茶素类、黄酮醇-O-糖苷类、黄酮-C-糖苷类、N-乙基-2-吡咯烷酮取代的儿茶素(EPSF)类、氨基酸类、酚酸类、有机酸类、生物碱类、脂类、香气糖苷类和其他类。通过对不同品种绿茶加工过程样进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA),发现不同加工工艺有较好的分离趋势,其中鲜叶位于坐标轴右下侧,摊放样位于坐标轴右上侧,揉捻样、杀青样、干燥样位于坐标轴上方且与鲜叶样、摊放样、焙火样相隔较远。这表明绿茶加工过程中化合物含量逐步发生变化。通过单因素方差分析共筛选出114种差异化合物(P<0.05),涵盖了儿茶素类、二聚儿茶素类、生物碱类、黄酮糖苷类等化合物。进一步对差异化合物进行分析,结果显示大部分儿茶素类和二聚儿茶素类化合物含量在绿茶杀青、干燥、焙火等热加工过程中呈现下降趋势。这是因为在热加工过程中,儿茶素类物质会发生氧化、异构化等反应,导致其含量减少。例如,表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是儿茶素类中含量较高的一种成分,在杀青过程中,由于高温的作用,EGCG会发生氧化反应,生成醌类物质,从而使其含量降低。而(RN-乙基-2-吡咯烷酮取代的表没食子儿茶素没食子酸酯、(RN-乙基-2-吡咯烷酮取代的表没食子儿茶素和(SN-乙基-2-吡咯烷酮取代的表儿茶素等EPSF类化合物含量在绿茶焙火过程中呈显著上升趋势。这可能是由于在焙火过程中,茶叶中的一些前体物质发生了化学反应,生成了这些EPSF类化合物。在氨基酸方面,γ-氨基丁酸、缬氨酸、L-蛋氨酸等氨基酸含量在绿茶杀青和干燥过程中呈上升趋势,而谷氨酸、色氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、L-赖氨酸等氨基酸含量在茶叶绿茶杀青、干燥、焙火等热加工过程中呈下降趋势。在杀青过程中,由于温度的升高,蛋白质水解酶的活性增强,使得蛋白质水解产生更多的氨基酸,从而导致一些氨基酸含量上升。而在后续的干燥和焙火过程中,一些氨基酸可能会参与美拉德反应等化学反应,或者发生分解,导致其含量下降。牡荆素、异牡荆素、芹菜素-6,8-C-二葡萄糖苷和芹菜素-6-C-葡萄糖基-8-C-阿拉伯糖苷等黄酮-C-糖苷类化合物在绿茶干燥和焙火等热加工过程中呈上升趋势。这可能是由于在热加工过程中,茶叶中的黄酮醇类物质发生了糖基化反应,生成了这些黄酮-C-糖苷类化合物。甘油单酯(18:3)脂类化合物含量在绿茶杀青过程中呈现下降趋势,而溶血磷脂酰胆碱(16:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)、溶血磷脂酰胆碱(18:2)和溶血磷脂酰胆碱(18:3)等大多数脂类化合物含量在绿茶杀青、干燥、焙火等热加工过程中呈上升趋势。在杀青过程中,高温可能导致甘油单酯发生分解或转化,使其含量下降。而在后续的加工过程中,可能由于细胞膜的破损,使得细胞内的溶血磷脂酰胆碱释放出来,从而导致其含量上升。这些分析结果对于提升绿茶品质具有重要的指导意义。通过深入了解绿茶加工过程中化学成分的变化规律,可以有针对性地调整加工工艺参数,以保留或提高茶叶中有益成分的含量,改善茶叶的品质。在杀青过程中,可以适当控制杀青温度和时间,减少儿茶素类物质的氧化损失,同时促进蛋白质的水解,增加氨基酸的含量。在干燥和焙火过程中,可以优化温度和时间条件,促进黄酮-C-糖苷类化合物的生成,提升茶叶的香气和滋味。此外,还可以根据不同品种茶树鲜叶的化学成分差异,制定个性化的加工工艺,充分发挥不同品种茶叶的优势,生产出品质更优的绿茶产品。4.2.2红毛茶加工成豆香红茶凤庆小罐茶业有限公司的张成仁、杨泽荣、陈子昌等人发明了一种红毛茶热加工方法,将红毛茶依序进行脱毫处理、上霜处理以及固香处理,从而将红毛茶优化成了一种滋味香醇甘甜且保留了营养成分的豆香红茶。脱毫处理是在90℃-100℃的第一预设温度下,将低级别的红毛茶进行翻滚处理,翻滚时间为110min-130min,转速为10转/min-20转/min。经过脱毫处理,得到去除茸毫后的脱毫茶叶。在这个过程中,茶黄素含量和茶红素含量均得到提高,并且去除了红毛茶的粗老味,使其甜香更明显。这是因为在脱毫过程中,茶叶中的一些成分在高温和机械作用下发生了氧化和转化反应。例如,茶叶中的茶多酚在一定温度下会发生氧化聚合反应,形成茶黄素和茶红素等物质,从而使茶叶的色泽和滋味发生变化。上霜处理是在100℃-110℃的第二预设温度下,将脱毫茶叶进行翻滚处理,翻滚时间为50min-70min,转速为15转/min-25转/min。经过上霜处理,得到色泽墨绿且表面光滑油亮的上霜茶叶。上霜处理使得茶红素含量进一步提高,并激发出豆香。在这个阶段,茶叶中的成分继续发生热化学反应,可能是一些糖类和氨基酸在高温下发生了美拉德反应,生成了具有豆香的物质。同时,茶红素的进一步氧化和聚合,也使得茶叶的色泽更加墨绿,表面呈现出油亮的光泽。固香处理是在110℃-120℃的第三预设温度下,将上霜茶叶进行翻滚处理,翻滚时间为50min-70min,转速为15转/min-25转/min。经过固香处理,得到豆香更明显的豆香红茶。固香处理使茶红素含量进一步提高,豆香更加浓郁。在这个过程中,茶叶中的香气成分进一步稳定和固化,可能是一些挥发性的香气物质在高温下发生了缩合或环化反应,形成了更加稳定的香气化合物。研究表明,这种热加工方法制备的豆香红茶较红毛茶,茶红素含量占比升高约100%-110%。茶黄素含量和茶红素含量与茶汤色泽的关系密切,当茶黄素(TF)和茶红素(TR)的含量越高,且TR/TF较大(一般TF%>0.7%,TR%>10%、TR%/TF%=10-15)时,茶褐素(TB)较少,茶汤品质优良。在这种热加工方法中,通过控制各个阶段的温度和时间,使得茶红素含量显著提高,从而改善了茶汤的色泽和滋味。在香气成分方面,豆香是低级别的红毛茶在加工过程中,经过热化学作用而形成的具有烘炒香的成分,如吡嗪类、吡咯类、喹啉类及吡啶类等。这些香气成分的形成与热加工过程中的美拉德反应、糖类的焦糖化反应等密切相关。在脱毫、上霜和固香的过程中,不同的温度和时间条件促进了这些反应的进行,使得茶叶中的香气成分不断变化和丰富,最终形成了豆香红茶独特的豆香。这种红毛茶热加工方法解决了传统工艺加工出的红毛茶香气低且滋味淡的问题。通过对加工过程中化学成分变化的分析可知,该方法不仅提高了茶红素等对茶汤品质有重要影响的成分含量,还促进了香气成分的形成和发展。在实际应用中,该方法操作简单,成本低,具有较高的推广价值。可以根据不同地区的茶叶原料和市场需求,对加工工艺进行适当调整,以生产出符合消费者口味的豆香红茶产品。同时,该方法也为其他茶叶品种的加工工艺创新提供了参考和借鉴,有助于推动整个茶叶产业的发展。4.3应用效果与前景在茶叶热加工中,光电离质谱技术展现出了显著的应用效果。以中国农业科学院茶叶研究所对绿茶加工过程的研究为例,通过基于超高效液相色谱-四极杆轨道阱质谱(UPLC-Q-Exactive/MS)的代谢组学分析方法,深入揭示了绿茶加工过程中化学成分的变化规律。研究结果表明,在绿茶杀青、干燥、焙火等热加工过程中,不同化学成分呈现出特定的变化趋势。大部分儿茶素类和二聚儿茶素类化合物含量下降,而一些EPSF类化合物含量在焙火过程中显著上升。这些变化规律的揭示,为优化绿茶加工工艺提供了科学依据。例如,在实际生产中,可以根据这些变化规律,调整杀青的温度和时间,以减少儿茶素类物质的氧化损失,从而保留更多的有益成分,提升绿茶的品质。在凤庆小罐茶业有限公司将红毛茶加工成豆香红茶的过程中,通过控制脱毫、上霜和固香等热加工步骤的温度和时间,成功提高了茶红素含量,使茶红素含量占比升高约100%-110%。茶红素含量的增加显著改善了茶汤的色泽和滋味,使豆香红茶的品质得到了明显提升。同时,该加工方法还激发出了豆香红茶独特的豆香,满足了消费者对茶叶香气和口感的需求。这一应用实例充分展示了光电离质谱技术在茶叶加工工艺优化中的重要作用,通过对加工过程中化学成分变化的监测和分析,能够指导生产实践,生产出更优质的茶叶产品。从更宏观的角度来看,光电离质谱技术在茶叶产业中具有广阔的应用前景。在茶叶品质控制方面,该技术可以快速、准确地检测茶叶中的化学成分,为茶叶的质量分级和品质评价提供科学依据。通过建立茶叶化学成分与品质之间的关系模型,能够实现对茶叶品质的精准把控,提高茶叶产品的一致性和稳定性。在茶叶新产品开发方面,利用光电离质谱技术对茶叶加工过程进行深入研究,可以探索新的加工工艺和方法,开发出具有独特风味和品质的茶叶新产品,满足消费者日益多样化的需求。此外,该技术还可以应用于茶叶产地溯源和真伪鉴别,通过分析茶叶中的特征化学成分,确定茶叶的产地和品种,防止假冒伪劣产品的流通,维护茶叶市场的秩序。随着技术的不断发展和完善,光电离质谱技术有望在茶叶产业中发挥更加重要的作用,推动茶叶产业的高质量发展。五、结论与展望5.1研究成果总结本研究围绕光电离质谱技术在生物组织成像和茶叶热加工中的应用展开了深入探索,取得了一系列具有重要意义的研究成果。在生物组织成像方面,通过对光电离质谱成像技术的研究,成功实现了对生物组织中多种内源性化合物的原位可视化分析。以中国科学技术大学国家同步辐射实验室发展的常压透射式激光解吸/后光
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