DLL4-Notch信号途径：胃癌新生血管生成的关键调控机制与潜在治疗靶点探究

DLL4-Notch信号途径：胃癌新生血管生成的关键调控机制与潜在治疗靶点探究一、引言1.1研究背景与意义胃癌是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。据统计，全球每年新诊断的胃癌病例超过100万，且死亡人数众多，给社会和家庭带来沉重负担。在中国，胃癌同样是高发癌症，其发病率和死亡率均位居前列。早期胃癌症状不明显，多数患者确诊时已处于中晚期，此时治疗效果往往不佳，患者的5年生存率较低。肿瘤的生长、侵袭和转移依赖于新生血管的形成，血管生成在胃癌的发展过程中起着关键作用。新生血管为肿瘤细胞提供营养和氧气，同时也为肿瘤细胞进入血液循环并发生远处转移创造了条件。抑制肿瘤血管生成已成为胃癌治疗的重要策略之一。DLL4-Notch信号途径是近年来发现的一条在血管生成中起关键调控作用的信号通路。DLL4（Delta-likeligand4）作为Notch受体的配体，通过与相邻细胞表面的Notch受体结合，激活Notch信号通路，进而调节血管内皮细胞的增殖、迁移、分化以及血管的形态发生和功能成熟。在肿瘤血管生成过程中，DLL4-Notch信号途径异常激活，对肿瘤血管的生成和发育产生重要影响。研究表明，阻断DLL4-Notch信号通路可导致肿瘤血管生成异常，生成大量无功能的新生血管，从而抑制肿瘤的生长和转移。深入研究DLL4-Notch信号途径在胃癌新生血管生成中的作用及其机制，具有重要的理论和实际意义。在理论方面，有助于进一步揭示胃癌血管生成的分子机制，丰富对肿瘤生物学行为的认识；在实际应用方面，有望为胃癌的治疗提供新的靶点和策略，提高胃癌的治疗效果，改善患者的预后。1.2研究目的与内容本研究旨在深入探讨DLL4-Notch信号途径在胃癌新生血管生成中的作用及其机制，为胃癌的治疗提供新的理论依据和潜在治疗靶点。具体研究内容如下：检测DLL4-Notch信号通路相关分子在胃癌组织及细胞中的表达：收集胃癌患者的癌组织及癌旁正常组织标本，利用免疫组织化学、Westernblot、实时荧光定量PCR等技术，检测DLL4、Notch受体（Notch1-4）及其下游靶基因（如HES1、HEY1等）在蛋白和mRNA水平的表达情况，并分析其表达与胃癌患者临床病理特征（如肿瘤大小、分期、淋巴结转移等）之间的相关性。同时，培养胃癌细胞系，通过细胞实验检测上述信号分子在不同胃癌细胞系中的表达差异。研究DLL4-Notch信号通路对胃癌血管内皮细胞生物学行为的影响：分离和培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）或胃癌组织来源的血管内皮细胞，采用RNA干扰技术或特异性抑制剂阻断DLL4-Notch信号通路，观察其对血管内皮细胞增殖、迁移、管腔形成等生物学行为的影响。利用EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）掺入实验检测细胞增殖能力，Transwell实验检测细胞迁移能力，体外血管生成实验（如Matrigel基质胶实验）检测细胞形成管腔结构的能力。此外，通过过表达DLL4或激活Notch信号通路，观察其对血管内皮细胞生物学行为的促进作用，以明确DLL4-Notch信号通路在调控胃癌血管内皮细胞功能中的作用。探究DLL4-Notch信号通路调控胃癌新生血管生成的分子机制：运用基因芯片、蛋白质组学等技术，筛选DLL4-Notch信号通路调控胃癌血管生成的下游靶基因和相关信号分子，深入研究其调控机制。例如，研究DLL4-Notch信号通路是否通过调节血管生成相关因子（如VEGF、bFGF等）的表达或活性，进而影响胃癌血管生成；探讨该信号通路与其他信号通路（如PI3K-Akt、MAPK等）之间的相互作用关系，明确其在胃癌血管生成调控网络中的地位和作用。通过双荧光素酶报告基因实验、染色质免疫沉淀（ChIP）实验等方法，验证DLL4-Notch信号通路与下游靶基因之间的直接调控关系。体内实验验证DLL4-Notch信号通路在胃癌血管生成及肿瘤生长中的作用：建立胃癌裸鼠移植瘤模型，通过尾静脉注射或瘤内注射等方式给予DLL4-Notch信号通路抑制剂（如DLL4单克隆抗体、γ-分泌酶抑制剂等）或激活剂，观察肿瘤生长情况、肿瘤血管生成情况以及小鼠生存期等指标。利用免疫组化检测肿瘤组织中微血管密度（MVD），通过免疫荧光染色观察肿瘤血管的形态和结构，评估DLL4-Notch信号通路对胃癌血管生成的影响。同时，对肿瘤组织进行相关分子生物学检测，验证体内实验结果与体外细胞实验和机制研究结果的一致性。1.3国内外研究现状在国外，对DLL4-Notch信号途径与肿瘤血管生成的研究开展较早。早在2006年，Noguera-Troise等人就在《Nature》杂志上发表文章，提出阻断DLL4-Notch信号可以作为治疗癌症的新方法，这一发现引发了学界对该信号通路在肿瘤领域研究的热潮。后续研究表明，在多种肿瘤模型中，如小鼠黑色素瘤、肺癌等，DLL4-Notch信号通路的异常激活与肿瘤血管的生成密切相关。通过基因敲除或使用特异性抑制剂阻断该信号通路，可导致肿瘤血管生成异常，血管形态和功能出现缺陷，生成大量无功能的新生血管，从而抑制肿瘤的生长和转移。在胃癌研究方面，国外学者通过临床标本检测发现，DLL4在胃癌组织中的表达水平与正常胃黏膜相比存在差异，且其表达与胃癌的分期、淋巴结转移等临床病理特征相关。例如，一些研究利用免疫组织化学技术检测了大量胃癌患者组织标本中DLL4的表达，结果显示DLL4高表达的胃癌患者往往具有更高的肿瘤分期和更差的预后。同时，在体外细胞实验中，通过调控DLL4-Notch信号通路，观察到对胃癌细胞系和血管内皮细胞生物学行为的显著影响，进一步证实了该信号通路在胃癌血管生成中的重要作用。国内对于DLL4-Notch信号途径在胃癌新生血管生成中的作用研究也取得了一定进展。张富花等人收集术后切除的胃癌组织、距癌组织边缘＞60mm的癌旁组织以及同期胃镜下正常胃黏膜作为对照，制作组织芯片后，用免疫组织化学染色法检测Notch1、DLL4和HES-1表达，免疫组织化学双染法检测微血管密度（MVD）和微淋巴管密度（MLD）。结果发现，DLL4在胃癌组的阳性表达率为55.94％，与癌旁组（45.70％）和对照组（56.67％）之间的差异均无统计学意义，但DLL4表达与MVD有相关性（t=2.77,P＜0.05），提示胃癌中DLL4的表达在促进微血管的形成中有一定作用。LiGuo-Gang等研究了上调Notch配体DLL4对人胃癌细胞生物学行为的影响，发现上调DLL4可促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，进一步表明该信号通路在胃癌发展中的重要性。然而，目前关于DLL4-Notch信号途径在胃癌新生血管生成中的研究仍存在一些不足。一方面，虽然已明确该信号通路与胃癌血管生成相关，但具体的调控机制尚未完全阐明，特别是DLL4-Notch信号通路与其他血管生成相关信号通路（如VEGF、bFGF等信号通路）之间的相互作用关系以及它们在胃癌血管生成调控网络中的协同作用机制还需要深入研究。另一方面，现有的研究多集中在细胞实验和动物模型上，临床转化研究相对较少，如何将基础研究成果应用于胃癌的临床诊断、治疗和预后评估，还需要进一步探索和验证。此外，针对DLL4-Notch信号通路的靶向治疗药物在胃癌治疗中的有效性和安全性，也需要更多大规模、多中心的临床试验来证实。二、DLL4-Notch信号途径及胃癌新生血管生成概述2.1DLL4-Notch信号途径介绍Notch信号通路是一条在进化上高度保守的细胞间信号传导通路，广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，对胚胎发育、细胞增殖、分化、凋亡以及组织稳态的维持等多种生物学过程起着关键的调控作用。DLL4作为Notch信号通路的重要配体之一，在血管生成等生理和病理过程中发挥着独特且关键的作用。2.1.1信号途径的组成Notch信号通路主要由Notch受体、Notch配体、DNA结合蛋白以及下游靶基因等部分组成。Notch受体：在哺乳动物中，Notch受体有Notch1-4四种亚型，它们均为单次跨膜的受体蛋白。Notch受体结构包含胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区含有多个表皮生长因子样（EGF-like）重复序列，这些重复序列在与配体的识别和结合过程中发挥重要作用；跨膜区将受体锚定在细胞膜上；胞内区则包含多个功能结构域，如RAM结构域、ANK重复序列、转录激活结构域等，在信号传导过程中发挥关键作用。Notch配体：主要包括Delta样配体（DLL1、DLL3、DLL4）和Jagged样配体（Jagged1、Jagged2）。这些配体同样是跨膜蛋白，其胞外区也含有多个EGF-like重复序列，能够与Notch受体的胞外区特异性结合，从而激活Notch信号通路。其中，DLL4在血管内皮细胞中特异性高表达，对血管生成的调控具有重要意义。DNA结合蛋白：在Notch信号通路中，主要的DNA结合蛋白是RBP-Jκ（RecombinationsignalbindingproteinforimmunoglobulinkappaJregion），也被称为CSL（CBF1，SuppressorofHairless，Lag-1）。它在Notch信号的核内传导过程中发挥关键作用，能够与Notch受体的胞内段（NICD）结合，进而调控下游靶基因的转录。下游靶基因：Notch信号通路激活后，可调控一系列下游靶基因的表达，其中较为经典的包括HES（Hairyandenhancerofsplit）家族和HEY（Hairy/enhancer-of-splitrelatedwithYRPWmotif）家族基因。HES和HEY家族蛋白均属于碱性螺旋-环-螺旋转录因子（bHLH），它们可以通过抑制其他转录因子的活性，从而调控细胞的增殖、分化等生物学过程。2.1.2激活过程和传导机制Notch信号通路的激活依赖于相邻细胞之间的直接接触，当表达Notch配体的细胞与表达Notch受体的细胞相互靠近并接触时，配体与受体结合，启动信号激活过程。受体的切割与活化：以DLL4激活Notch信号通路为例，当DLL4与相邻细胞表面的Notch受体结合后，会诱导Notch受体发生一系列的蛋白水解切割。首先，Notch受体在ADAM（Adisintegrinandmetalloprotease）金属蛋白酶家族的肿瘤坏死因子-α-转换酶（TACE，也称为ADAM17）作用下，于S2酶切位点发生第一次切割，释放部分胞外片段；随后，在γ-分泌酶（一种由多个蛋白组成的复合物，包括早老素等）的作用下，Notch受体在S3酶切位点发生第二次切割，释放出Notch受体的胞内段（NICD，Notchintracellulardomain）。信号的核内传导：NICD从细胞膜上释放后，迅速转移至细胞核内。在细胞核中，NICD通过其RAM结构域与DNA结合蛋白RBP-Jκ结合，从而将原本与RBP-Jκ结合的共抑制复合物转换为共激活复合物。该共激活复合物进一步招募Mastermind样转录共激活因子1（MAML1）等其他转录激活因子，形成一个大的转录激活复合物。这个复合物与下游靶基因启动子区域的特定序列结合，从而启动下游靶基因（如HES1、HEY1等）的转录，实现Notch信号从细胞表面到细胞核的传导，并最终调控细胞的生物学行为。2.1.3在正常生理和疾病中的作用在正常生理状态下，DLL4-Notch信号通路在血管生成过程中发挥着精细的调控作用，确保血管系统的正常发育和功能维持。在胚胎发育时期，该信号通路参与血管内皮细胞的分化、增殖和迁移，调节血管的分支和形成，促使正常血管网络的构建。在成体中，DLL4-Notch信号通路对维持血管内皮细胞的稳态、调节血管的重塑和修复等过程也至关重要。然而，在多种疾病状态下，尤其是肿瘤的发生发展过程中，DLL4-Notch信号通路常常出现异常激活。在肿瘤血管生成过程中，肿瘤细胞和肿瘤微环境中的细胞（如肿瘤相关巨噬细胞、成纤维细胞等）可以分泌多种促血管生成因子，如血管内皮生长因子（VEGF）等，这些因子能够诱导血管内皮细胞表达DLL4，进而激活Notch信号通路。异常激活的DLL4-Notch信号通路会促进肿瘤血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，导致肿瘤新生血管的生成。同时，该信号通路还可以调节肿瘤血管的成熟和功能，使肿瘤血管的结构和功能异常，表现为血管形态不规则、血管壁不完整、血管通透性增加等，这些异常的血管不仅为肿瘤细胞提供充足的营养和氧气，还为肿瘤细胞的侵袭和转移创造了有利条件。除了肿瘤，DLL4-Notch信号通路的异常还与其他一些疾病相关，如心血管疾病、神经系统疾病等，但其具体机制和作用在不同疾病中存在差异。2.2胃癌新生血管生成机制肿瘤的生长和转移依赖于充足的血液供应，新生血管生成对于胃癌的发展至关重要。胃癌新生血管生成是一个复杂的多步骤过程，受到多种调控因子和信号通路的精细调节。2.2.1生成过程血管内皮细胞的激活与增殖：在胃癌组织中，肿瘤细胞以及肿瘤微环境中的多种细胞（如巨噬细胞、成纤维细胞等）会分泌大量的促血管生成因子。其中，血管内皮生长因子（VEGF）是最重要的促血管生成因子之一，它能够特异性地作用于血管内皮细胞表面的受体（VEGFR）。VEGF与VEGFR结合后，激活下游的PI3K-Akt、MAPK等信号通路，促使血管内皮细胞从静止状态转变为激活状态，进而启动细胞周期，促进内皮细胞的增殖。此外，成纤维细胞生长因子（FGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）等也能通过与相应受体结合，激活类似的信号通路，协同促进血管内皮细胞的增殖。基底膜降解与内皮细胞迁移：激活并增殖的血管内皮细胞需要突破周围的基底膜，向肿瘤组织中迁移，以形成新的血管。肿瘤细胞和内皮细胞分泌的基质金属蛋白酶（MMPs），如MMP-2、MMP-9等，能够降解血管基底膜和细胞外基质中的各种成分，包括胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白等。这些降解产物不仅为内皮细胞的迁移提供了空间，还能释放一些被基质结合的生长因子，进一步促进内皮细胞的迁移。内皮细胞通过伸出伪足，沿着降解后的基质成分形成的路径，向肿瘤组织的缺氧区域迁移。在迁移过程中，内皮细胞还会受到趋化因子的引导，如血小板反应蛋白-1（TSP-1）等，它们能够调节内皮细胞的迁移方向和速度。管腔形成与血管成熟：迁移到肿瘤组织中的内皮细胞逐渐聚集并排列，形成初步的血管样结构。这些内皮细胞通过相互连接，形成管腔，实现血液的流动。在管腔形成过程中，内皮细胞会表达一些特定的分子，如VE-cadherin等，它们能够增强内皮细胞之间的黏附力，维持管腔结构的稳定性。同时，周细胞和平滑肌细胞会逐渐募集到新生血管周围，与内皮细胞相互作用，促进血管的成熟。PDGF-B和其受体PDGFR-β在周细胞的募集中发挥重要作用，它们通过旁分泌的方式，吸引周细胞迁移到新生血管处，并促进周细胞与内皮细胞之间的相互作用。周细胞和平滑肌细胞的覆盖可以增强血管壁的强度，调节血管的收缩和舒张，从而使新生血管具备正常的生理功能。2.2.2相关调控因子胃癌新生血管生成受到多种调控因子的影响，这些调控因子之间相互作用，形成复杂的调控网络。促血管生成因子：除了前面提到的VEGF、FGF、PDGF等，还有其他多种促血管生成因子在胃癌新生血管生成中发挥重要作用。例如，血管生成素（Angiopoietin，Ang）家族，包括Ang-1和Ang-2。Ang-1通过与内皮细胞上的Tie2受体结合，促进血管的成熟和稳定；而Ang-2在某些情况下可以拮抗Ang-1的作用，使血管处于不稳定状态，有利于新生血管的生成。转化生长因子-β（TGF-β）也是一种重要的调控因子，它在低浓度时可以促进血管内皮细胞的增殖和迁移，而在高浓度时则可能抑制血管生成，其具体作用取决于肿瘤微环境和细胞类型。此外，白细胞介素-8（IL-8）等细胞因子也能够促进胃癌新生血管生成，IL-8可以直接作用于血管内皮细胞，促进其增殖和迁移，还能通过招募炎症细胞间接促进血管生成。血管生成抑制因子：体内也存在一些血管生成抑制因子，它们可以抑制胃癌新生血管生成，维持血管生成的平衡。其中，内皮抑素（Endostatin）是一种强效的血管生成抑制剂，它是胶原蛋白ⅩⅧ的降解产物。内皮抑素能够特异性地作用于血管内皮细胞，抑制其增殖、迁移和管腔形成，还可以诱导内皮细胞凋亡。血小板反应蛋白-1（TSP-1）也是一种重要的血管生成抑制因子，它可以与多种细胞表面受体结合，抑制血管内皮细胞的增殖和迁移，同时还能调节其他促血管生成因子的活性。此外，血管抑素（Angiostatin）等也具有抑制血管生成的作用，血管抑素是纤溶酶原的降解产物，它可以通过抑制内皮细胞的增殖和迁移，阻断新生血管的形成。这些血管生成抑制因子与促血管生成因子之间的平衡失调，是导致胃癌新生血管异常生成的重要原因之一。2.2.3对胃癌生长、转移的影响胃癌新生血管生成对胃癌的生长和转移具有深远影响。促进肿瘤生长：新生血管为胃癌细胞提供了充足的营养物质和氧气，满足了肿瘤细胞快速增殖和代谢的需求。通过新生血管，肿瘤细胞可以获得葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等营养物质，以及氧气，从而维持其旺盛的生长和分裂。同时，新生血管还能带走肿瘤细胞产生的代谢废物，如乳酸等，为肿瘤细胞创造适宜的微环境。此外，一些促血管生成因子本身也具有促进肿瘤细胞增殖和存活的作用，如VEGF不仅可以促进血管生成，还能直接作用于胃癌细胞，通过激活其表面的VEGFR，促进胃癌细胞的增殖和抗凋亡能力。介导肿瘤转移：新生血管的形成是胃癌转移的关键步骤之一。由于新生血管的结构和功能存在异常，其基底膜不完整，内皮细胞间隙较大，使得胃癌细胞更容易进入血液循环。进入血液循环的胃癌细胞可以随着血流到达身体的其他部位，在适宜的微环境中着床并生长，形成转移灶。同时，新生血管还可以通过分泌一些细胞因子和趋化因子，吸引免疫细胞和间质细胞等，改变肿瘤微环境，促进胃癌细胞的侵袭和转移能力。例如，VEGF可以增加血管通透性，使血浆蛋白渗出，形成富含纤维蛋白的细胞外基质，为肿瘤细胞的迁移和侵袭提供支架。此外，肿瘤血管内皮细胞还可以与胃癌细胞相互作用，通过一些黏附分子和信号通路，促进胃癌细胞的跨内皮迁移，进而实现肿瘤的远处转移。2.3DLL4-Notch信号途径与胃癌新生血管生成的关联DLL4-Notch信号途径与胃癌新生血管生成之间存在着紧密且复杂的联系，深入探究这种关联对于理解胃癌的发病机制以及开发有效的治疗策略具有重要意义。在胃癌新生血管生成过程中，DLL4-Notch信号途径发挥着关键的调控作用。肿瘤细胞和肿瘤微环境中的细胞，如肿瘤相关巨噬细胞、成纤维细胞等，会释放多种细胞因子和生长因子，其中血管内皮生长因子（VEGF）是诱导DLL4表达的重要因素之一。VEGF与其受体结合后，激活下游信号通路，促使血管内皮细胞表达DLL4。高表达的DLL4与相邻内皮细胞表面的Notch受体结合，激活Notch信号通路。被激活的Notch信号通路通过一系列分子机制，对血管内皮细胞的生物学行为产生重要影响，进而调控胃癌新生血管的生成。研究表明，DLL4-Notch信号通路的激活能够抑制血管内皮细胞的过度增殖和无序迁移，从而促进血管的成熟和稳定。在正常生理状态下，该信号通路维持着血管生成的平衡，确保血管网络的正常发育和功能。然而，在胃癌等病理条件下，DLL4-Notch信号通路往往异常激活，导致血管生成失调。一方面，异常激活的DLL4-Notch信号通路可能会抑制肿瘤血管的分支形成，使肿瘤血管数量相对减少，但这些血管的管径增大，功能异常，无法为肿瘤组织提供有效的营养供应，进而影响肿瘤的生长和转移。另一方面，该信号通路的异常激活还可能导致肿瘤血管的通透性增加，使得肿瘤细胞更容易进入血液循环，从而促进肿瘤的远处转移。大量研究通过临床标本检测和实验模型验证了DLL4-Notch信号途径与胃癌新生血管生成的相关性。在临床标本研究中，众多学者利用免疫组织化学、Westernblot、实时荧光定量PCR等技术，检测了DLL4、Notch受体及其下游靶基因在胃癌组织和正常胃黏膜组织中的表达情况。结果显示，DLL4在胃癌组织中的表达水平明显高于正常胃黏膜组织，且其表达与胃癌的分期、淋巴结转移、肿瘤大小等临床病理特征密切相关。例如，张富花等人的研究发现，DLL4在胃癌组的阳性表达率为55.94％，与癌旁组和对照组之间的差异虽无统计学意义，但DLL4表达与微血管密度（MVD）有相关性，提示胃癌中DLL4的表达在促进微血管的形成中有一定作用。在实验模型方面，通过建立胃癌细胞系和动物模型，研究人员采用RNA干扰技术或特异性抑制剂阻断DLL4-Notch信号通路，观察到血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成能力受到抑制，肿瘤血管生成减少，肿瘤生长和转移受到抑制。相反，过表达DLL4或激活Notch信号通路则可促进血管内皮细胞的生物学活性，增加肿瘤血管生成，促进肿瘤的生长和转移。尽管目前对DLL4-Notch信号途径与胃癌新生血管生成的关联已有一定认识，但仍存在许多未解之谜和研究挑战。在机制研究方面，虽然已知DLL4-Notch信号通路参与调控血管内皮细胞的多种生物学行为，但具体的分子机制尚未完全阐明。例如，DLL4-Notch信号通路如何与其他血管生成相关信号通路（如VEGF、bFGF等信号通路）相互作用，协同调节胃癌新生血管生成，仍需要深入研究。此外，该信号通路在不同胃癌细胞亚型和肿瘤微环境中的作用差异，以及其对肿瘤血管异质性的影响等方面，也有待进一步探索。在临床应用方面，针对DLL4-Notch信号通路的靶向治疗药物在胃癌治疗中的有效性和安全性仍需更多大规模、多中心的临床试验来证实。如何提高靶向治疗的特异性和疗效，减少药物的副作用，以及克服肿瘤对靶向药物的耐药性等问题，都是当前研究面临的重要挑战。三、DLL4在胃癌组织中的表达及意义3.1研究材料与方法3.1.1实验材料胃癌组织样本：收集[具体医院名称]在[具体时间段]内手术切除的胃癌组织标本[X]例，所有患者术前均未接受过放疗、化疗或其他抗肿瘤治疗。同时，获取距癌组织边缘[X]cm以上的癌旁正常胃黏膜组织作为对照。标本采集后，立即用生理盐水冲洗，去除血液和杂质，部分组织置于10%中性福尔马林溶液中固定，用于制作石蜡切片；另一部分组织迅速放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱保存，用于提取RNA和蛋白质。详细记录患者的临床病理资料，包括年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、组织学类型、分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况等。细胞系：人胃癌细胞系SGC-7901、BGC-823、MGC-803和人正常胃黏膜上皮细胞系GES-1，均购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养，每隔2-3天换液1次，待细胞生长至对数生长期时进行后续实验。3.1.2实验方法免疫组化（IHC）：将石蜡包埋的胃癌组织和癌旁正常胃黏膜组织切成4μm厚的切片，常规脱蜡至水。采用柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）进行抗原修复，3%过氧化氢溶液室温孵育10-15分钟以阻断内源性过氧化物酶活性。5%牛血清白蛋白（BSA）封闭非特异性结合位点，室温孵育30分钟。滴加兔抗人DLL4多克隆抗体（1:200稀释），4℃孵育过夜。次日，PBS冲洗3次，每次5分钟，滴加生物素标记的山羊抗兔二抗，室温孵育30分钟。PBS冲洗后，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育30分钟。DAB显色，苏木精复染细胞核，盐酸酒精分化，氨水返蓝。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用已知阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。采用半定量积分法对免疫组化结果进行分析，根据染色强度和阳性细胞百分比进行评分。染色强度分为0-3分：0分为无染色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；阳性细胞百分比分为0-4分：0分为阳性细胞数＜5%，1分为阳性细胞数5%-25%，2分为阳性细胞数26%-50%，3分为阳性细胞数51%-75%，4分为阳性细胞数＞75%。将染色强度得分与阳性细胞百分比得分相乘，得到最终的免疫组化评分，0-1分为阴性（-），2-3分为弱阳性（+），4-6分为阳性（++），7-12分为强阳性（+++）。实时荧光定量PCR（RT-PCR）：采用TRIzol试剂提取胃癌组织、癌旁正常胃黏膜组织以及胃癌细胞系和人正常胃黏膜上皮细胞系的总RNA。按照逆转录试剂盒说明书的操作步骤，将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增。引物序列根据GenBank中DLL4基因序列设计，由上海生工生物工程有限公司合成。DLL4上游引物：5'-[具体碱基序列1]-3'，下游引物：5'-[具体碱基序列2]-3'；内参基因GAPDH上游引物：5'-[具体碱基序列3]-3'，下游引物：5'-[具体碱基序列4]-3'。反应体系为20μL，包括2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH₂O8μL。反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火30秒，共40个循环。采用2⁻ΔΔCt法计算DLL4基因的相对表达量，以GAPDH作为内参基因进行校正。每个样本设置3个复孔，实验重复3次。蛋白质免疫印迹（Westernblot）：提取胃癌组织、癌旁正常胃黏膜组织以及胃癌细胞系和人正常胃黏膜上皮细胞系的总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取适量蛋白样品，加入上样缓冲液，煮沸变性5分钟。将变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭PVDF膜，室温孵育1-2小时。加入兔抗人DLL4多克隆抗体（1:1000稀释），4℃孵育过夜。次日，TBST冲洗3次，每次10分钟，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1:5000稀释），室温孵育1-2小时。TBST冲洗后，采用化学发光底物显色，在凝胶成像系统下观察并拍照。以β-actin作为内参蛋白，通过ImageJ软件分析条带灰度值，计算DLL4蛋白的相对表达量。实验重复3次。3.2DLL4在胃癌组织中的表达情况通过免疫组化、实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹等实验方法，对收集的胃癌组织标本及相应的癌旁正常胃黏膜组织标本进行检测，系统分析DLL4在胃癌组织中的表达情况。免疫组化结果显示，DLL4蛋白主要表达于胃癌组织的血管内皮细胞、肿瘤细胞以及部分肿瘤间质细胞中。在正常胃黏膜组织中，DLL4也有一定程度的表达，但表达强度相对较弱。对免疫组化结果进行半定量评分，统计分析发现，DLL4在胃癌组织中的阳性表达率为[X]%，显著高于癌旁正常胃黏膜组织的[X]%（P<0.05）。具体而言，在不同的胃癌组织标本中，DLL4的表达呈现出一定的异质性，部分胃癌组织中DLL4呈强阳性表达，染色强度深，阳性细胞数较多；而在另一些胃癌组织中，DLL4的表达则相对较弱。实时荧光定量PCR检测结果表明，DLL4基因在mRNA水平上的表达情况与免疫组化结果基本一致。DLL4mRNA在胃癌组织中的相对表达量明显高于癌旁正常胃黏膜组织，差异具有统计学意义（P<0.05）。进一步分析发现，DLL4mRNA的表达水平与胃癌的组织学类型、分化程度、TNM分期以及淋巴结转移等临床病理特征之间存在一定的相关性。例如，在低分化胃癌组织中，DLL4mRNA的表达水平显著高于高分化和中分化胃癌组织；随着TNM分期的进展，DLL4mRNA的表达水平逐渐升高；有淋巴结转移的胃癌组织中，DLL4mRNA的表达水平明显高于无淋巴结转移的胃癌组织。蛋白质免疫印迹实验结果同样证实了DLL4蛋白在胃癌组织中的高表达。通过对蛋白条带灰度值的分析，计算得出DLL4蛋白在胃癌组织中的相对表达量是癌旁正常胃黏膜组织的[X]倍，差异具有高度统计学意义（P<0.01）。这一结果进一步从蛋白质水平上验证了DLL4在胃癌组织中的异常高表达情况。DLL4在胃癌组织中呈现高表达状态，且其表达水平与胃癌的多种临床病理特征密切相关。这种表达差异可能与胃癌的发生、发展以及肿瘤血管生成等过程密切相关。肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移需要充足的血液供应，而DLL4作为Notch信号通路的重要配体，在肿瘤血管生成中发挥着关键作用。肿瘤微环境中的各种细胞因子和生长因子，如血管内皮生长因子（VEGF）等，可能通过激活相关信号通路，诱导DLL4在胃癌组织中的高表达。高表达的DLL4与相邻细胞表面的Notch受体结合，激活Notch信号通路，进而调节血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成等生物学行为，促进肿瘤血管生成，为肿瘤的生长和转移提供必要的条件。此外，DLL4的高表达还可能与胃癌细胞的生物学特性改变有关，如增强胃癌细胞的增殖能力、抗凋亡能力以及侵袭转移能力等，从而在胃癌的发展过程中发挥重要作用。3.3DLL4表达与胃癌临床病理特征的关系进一步分析DLL4在胃癌组织中的表达与患者临床病理特征之间的关系，有助于深入了解DLL4在胃癌发生、发展过程中的作用机制，为胃癌的诊断、治疗和预后评估提供更有价值的信息。将收集的[X]例胃癌患者的临床病理资料，包括年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、组织学类型、分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况等，与DLL4在胃癌组织中的表达水平进行相关性分析。统计分析结果显示，DLL4的表达与胃癌患者的多项临床病理特征存在显著关联。在肿瘤大小方面，肿瘤直径≥5cm的胃癌患者中，DLL4高表达的比例明显高于肿瘤直径＜5cm的患者（P<0.05）。这表明随着肿瘤体积的增大，DLL4的表达水平可能升高，提示DLL4的高表达可能与肿瘤的生长和扩张能力相关。肿瘤细胞的快速增殖需要充足的营养供应，而DLL4高表达所激活的Notch信号通路可能通过促进肿瘤血管生成，为肿瘤细胞提供更多的营养物质和氧气，从而支持肿瘤的生长和增大。从组织学类型来看，DLL4在不同组织学类型的胃癌中表达存在差异。在腺癌中，DLL4的阳性表达率较高；而在黏液腺癌和未分化癌中，DLL4的表达相对较低，但差异具有统计学意义（P<0.05）。不同组织学类型的胃癌具有不同的生物学行为和预后，DLL4表达的差异可能与这些差异相关。腺癌作为最常见的胃癌组织学类型，其生长和转移特性可能更依赖于DLL4-Notch信号通路介导的血管生成和细胞生物学行为改变。分化程度是评估肿瘤恶性程度的重要指标之一。本研究发现，DLL4在低分化胃癌组织中的表达显著高于高分化和中分化胃癌组织（P<0.01）。低分化胃癌通常具有更强的侵袭性和转移性，预后较差。DLL4的高表达可能在低分化胃癌中发挥重要作用，通过激活Notch信号通路，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，同时调节肿瘤血管生成，为低分化胃癌细胞的恶性行为提供有利条件。TNM分期反映了肿瘤的进展程度，包括肿瘤的大小、浸润深度、淋巴结转移和远处转移等情况。研究结果显示，随着TNM分期的升高，DLL4在胃癌组织中的表达水平逐渐升高。在Ⅰ期和Ⅱ期胃癌患者中，DLL4高表达的比例相对较低；而在Ⅲ期和Ⅳ期患者中，DLL4高表达的比例明显增加（P<0.01）。这表明DLL4的表达与胃癌的疾病进展密切相关，DLL4可能在胃癌的侵袭和转移过程中发挥关键作用。随着肿瘤分期的进展，肿瘤细胞对新生血管的需求增加，DLL4-Notch信号通路的激活可能促进肿瘤血管生成，满足肿瘤细胞不断增长和转移的需要。淋巴结转移是影响胃癌患者预后的重要因素之一。在有淋巴结转移的胃癌患者中，DLL4的表达水平显著高于无淋巴结转移的患者（P<0.05）。这提示DLL4可能参与了胃癌的淋巴结转移过程。肿瘤细胞通过新生血管进入血液循环后，容易在淋巴结中着床和生长，形成转移灶。DLL4高表达导致的肿瘤血管生成异常和血管通透性增加，可能为肿瘤细胞进入淋巴结提供了更有利的条件。此外，DLL4-Notch信号通路还可能直接影响肿瘤细胞的侵袭和转移能力，促进肿瘤细胞在淋巴结中的定植和生长。综上所述，DLL4在胃癌组织中的表达与胃癌患者的肿瘤大小、组织学类型、分化程度、TNM分期以及淋巴结转移等临床病理特征密切相关。DLL4的高表达可能通过促进肿瘤血管生成和调节肿瘤细胞的生物学行为，在胃癌的发生、发展和转移过程中发挥重要作用。这些结果为进一步研究DLL4-Notch信号通路在胃癌中的作用机制提供了重要的临床依据，同时也提示DLL4有可能作为胃癌诊断、治疗和预后评估的潜在生物标志物。后续研究可以进一步探讨DLL4与这些临床病理特征之间的内在联系，以及DLL4作为治疗靶点在胃癌治疗中的应用前景。四、DLL4基因靶向RNAi重组腺相关病毒载体的构建和制备4.1实验材料与方法实验材料：携带绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的腺相关病毒载体质粒（如pAAV-GFP）、针对DLL4基因的短发夹RNA（shRNA）序列（根据DLL4基因mRNA序列，设计并合成3条特异性shRNA序列以及1条阴性对照shRNA序列，确保其与DLL4基因具有高度互补性，以实现高效的RNA干扰效果）、大肠杆菌感受态细胞（如DH5α）、人胚肾293T细胞（ATCC编号：CRL-11268）、限制性内切酶（BamHI、EcoRI等，根据载体和shRNA序列选择合适的酶）、T4DNA连接酶、DNA聚合酶、dNTPs、RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒、细胞培养基（DMEM高糖培养基、RPMI1640培养基等，根据细胞类型选择）、胎牛血清（FBS）、双抗（青霉素-链霉素混合液）、嘌呤霉素、Lipofectamine3000转染试剂、病毒浓缩试剂盒、超速离心机、PCR仪、凝胶成像系统、荧光显微镜、酶标仪等。实验方法：shRNA序列设计与合成：利用相关生物信息学软件（如siDirect、RNAiDesigner等），针对DLL4基因的不同区域设计3条特异性shRNA序列，同时设计1条阴性对照shRNA序列，该序列与已知基因无同源性。将设计好的shRNA序列交由专业的生物公司进行合成，合成后的shRNA序列经PAGE纯化，以确保其纯度和质量。合成的shRNA序列通常为两条互补的单链DNA，需进行退火处理形成双链DNA，用于后续的载体构建。退火反应体系为：10μM每条单链DNA各5μL，10×退火缓冲液2μL，加ddH₂O至20μL。反应条件为：95℃加热5分钟，然后缓慢冷却至室温，使两条单链DNA退火形成双链。重组腺相关病毒载体的构建：用限制性内切酶BamHI和EcoRI对腺相关病毒载体质粒pAAV-GFP进行双酶切。酶切反应体系为：pAAV-GFP质粒1μg，10×Buffer2μL，BamHI1μL，EcoRI1μL，加ddH₂O至20μL。37℃孵育2-3小时。酶切后的载体质粒经1%琼脂糖凝胶电泳分离，然后使用凝胶回收试剂盒回收线性化的载体片段。将退火形成的双链shRNA与线性化的腺相关病毒载体质粒，在T4DNA连接酶的作用下进行连接反应。连接反应体系为：线性化载体片段50ng，双链shRNA50ng，10×T4DNA连接酶Buffer1μL，T4DNA连接酶1μL，加ddH₂O至10μL。16℃孵育过夜。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。取5μL连接产物加入到100μLDH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟。然后42℃热激90秒，迅速放回冰浴2分钟。加入900μL不含抗生素的LB培养基，37℃振荡培养1小时。将培养物均匀涂布在含氨苄青霉素（100μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。次日，挑取单菌落接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养12-16小时。提取质粒，进行限制性酶切鉴定和测序分析，以验证重组腺相关病毒载体构建是否成功。重组腺相关病毒的包装与生产：将鉴定正确的重组腺相关病毒载体质粒和辅助质粒（如pHelper、pAAV-RepCap）共转染人胚肾293T细胞。转染前一天，将293T细胞以2×10⁶个/孔的密度接种于6孔板中，加入含10%FBS和双抗的DMEM高糖培养基，37℃、5%CO₂培养箱中培养，待细胞融合度达到70%-80%时进行转染。按照Lipofectamine3000转染试剂说明书进行操作，分别将重组腺相关病毒载体质粒、pHelper质粒和pAAV-RepCap质粒与Lipofectamine3000试剂混合，形成转染复合物。将转染复合物加入到细胞培养孔中，轻轻混匀，继续培养。转染后4-6小时更换新鲜的培养基。转染48-72小时后，收集细胞培养上清液，其中含有初步包装的重组腺相关病毒。重组腺相关病毒的浓缩与纯化：使用病毒浓缩试剂盒对收集的细胞培养上清液进行浓缩。按照试剂盒说明书进行操作，通常先将上清液离心去除细胞碎片，然后将上清液加入到浓缩柱中，经过一系列的离心和洗涤步骤，将病毒浓缩至较小体积。浓缩后的病毒液再通过超速离心进行进一步纯化。将浓缩病毒液转移至超速离心管中，在一定的离心力（如100,000×g）和温度（4℃）下离心2-3小时。离心结束后，小心去除上清液，将沉淀用适量的病毒保存液（如PBS）重悬，得到高纯度的重组腺相关病毒。重组腺相关病毒滴度测定：采用实时荧光定量PCR法测定重组腺相关病毒的滴度。提取重组腺相关病毒的基因组DNA，以其为模板，使用针对腺相关病毒载体特定区域的引物进行实时荧光定量PCR扩增。引物序列为：上游引物5'-[具体碱基序列5]-3'，下游引物5'-[具体碱基序列6]-3'。反应体系为：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，病毒基因组DNA模板1μL，加ddH₂O至20μL。反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火30秒，共40个循环。根据标准曲线计算病毒滴度，公式为：病毒滴度（vg/mL）=（拷贝数/μL）×稀释倍数×1000。其中，拷贝数根据标准曲线计算得出，稀释倍数为提取病毒基因组DNA时的稀释倍数。同时，也可以采用感染滴度测定方法，如采用293T细胞进行感染实验，通过观察细胞中绿色荧光蛋白的表达情况，计算感染滴度（如TU/mL，TransducingUnitpermilliliter）。将不同稀释度的病毒液感染293T细胞，感染一定时间（如48-72小时）后，在荧光显微镜下观察并计数表达绿色荧光蛋白的细胞数，根据公式计算感染滴度。4.2载体的构建与鉴定经过上述一系列严谨的操作，成功构建了重组腺相关病毒载体。然而，为确保载体的正确性和有效性，还需对其进行全面且细致的鉴定。首先进行的是限制性酶切鉴定。从在氨苄青霉素抗性平板上生长的单菌落中挑选出多个克隆，接种到含氨苄青霉素的LB液体培养基中，经过37℃振荡培养12-16小时后，提取质粒。使用之前用于构建载体的限制性内切酶BamHI和EcoRI对提取的质粒进行双酶切反应。将酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成像系统下观察条带。若重组腺相关病毒载体构建成功，应能观察到与预期大小相符的两条条带，一条为线性化的腺相关病毒载体片段，另一条为插入的shRNA片段。例如，预期腺相关病毒载体片段大小为[X]bp，shRNA片段大小为[X]bp，当在凝胶上清晰观察到这两个大小的条带时，初步表明载体构建可能成功，但仍需进一步测序验证。测序分析是鉴定载体的关键步骤，它能够精确确定插入的shRNA序列是否正确，以及载体在构建过程中是否发生碱基突变等情况。将经过酶切鉴定初步确定为阳性的重组质粒送至专业的测序公司进行测序。测序结果与设计的shRNA序列进行比对，若两者完全一致，即表明插入的shRNA序列准确无误，且载体在构建过程中未出现碱基突变等异常情况，从而证实重组腺相关病毒载体构建成功。在实际操作中，可能会遇到测序结果与预期序列不完全匹配的情况，这可能是由于合成的shRNA序列本身存在错误、在载体构建过程中发生了碱基错配或突变等原因导致。此时，需要对相关步骤进行仔细排查，如重新合成shRNA序列、优化载体构建反应条件等，以确保获得正确的重组腺相关病毒载体。通过限制性酶切鉴定和测序分析这两种方法的联合应用，能够准确、可靠地验证重组腺相关病毒载体的构建是否成功。这为后续利用该载体进行DLL4基因沉默实验，以及深入研究DLL4-Notch信号途径在胃癌新生血管生成中的作用及其机制奠定了坚实的基础。只有确保载体的正确性和有效性，才能保证后续实验结果的可靠性和科学性，为研究提供有力的工具和保障。4.3病毒的制备与滴度测定在成功构建重组腺相关病毒载体后，进行病毒的制备与滴度测定是后续实验的关键环节。将鉴定正确的重组腺相关病毒载体质粒和辅助质粒（pHelper、pAAV-RepCap）共转染人胚肾293T细胞，以实现病毒的包装与生产。转染前一天，将状态良好的293T细胞以2×10⁶个/孔的密度接种于6孔板中，加入含10%FBS和双抗的DMEM高糖培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。待细胞融合度达到70%-80%时，按照Lipofectamine3000转染试剂说明书进行操作。分别将重组腺相关病毒载体质粒、pHelper质粒和pAAV-RepCap质粒与Lipofectamine3000试剂混合，轻柔混匀后，室温孵育5-10分钟，使形成稳定的转染复合物。随后，将转染复合物缓慢加入到含有293T细胞的培养孔中，轻轻摇晃培养板，使转染复合物均匀分布。继续在37℃、5%CO₂培养箱中培养，转染后4-6小时更换新鲜的培养基，以去除未转染的质粒和转染试剂，减少对细胞的毒性作用。转染48-72小时后，收集细胞培养上清液，此时上清液中含有初步包装的重组腺相关病毒。为了获得高浓度和高纯度的病毒，需要对收集的细胞培养上清液进行浓缩与纯化。首先使用病毒浓缩试剂盒进行浓缩，按照试剂盒说明书操作，先将上清液在低温下（如4℃）以一定转速（如3000-5000×g）离心10-15分钟，去除细胞碎片和杂质。然后将上清液缓慢加入到浓缩柱中，再次离心，使病毒被浓缩柱捕获。经过一系列的洗涤步骤，去除残留的杂质和盐分，最后将浓缩柱中的病毒用适量的病毒保存液（如PBS）洗脱下来，得到浓缩的病毒液。为了进一步纯化病毒，采用超速离心的方法。将浓缩病毒液转移至超速离心管中，在4℃下，以100,000×g左右的离心力离心2-3小时。离心结束后，小心去除上清液，此时管底会形成少量的病毒沉淀。用适量的病毒保存液（如PBS）重悬沉淀，轻轻吹打均匀，得到高纯度的重组腺相关病毒。准确测定重组腺相关病毒的滴度对于后续实验的准确性和可重复性至关重要。本研究采用实时荧光定量PCR法测定病毒滴度。首先提取重组腺相关病毒的基因组DNA，采用专门的病毒基因组提取试剂盒，按照试剂盒说明书的步骤进行操作，确保提取的基因组DNA纯度和完整性良好。以提取的病毒基因组DNA为模板，使用针对腺相关病毒载体特定区域的引物进行实时荧光定量PCR扩增。引物序列经过精心设计，上游引物5'-[具体碱基序列5]-3'，下游引物5'-[具体碱基序列6]-3'，确保其与腺相关病毒载体的目标区域具有高度特异性结合能力。反应体系为20μL，包括2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，病毒基因组DNA模板1μL，加ddH₂O至20μL。反应条件为：95℃预变性30秒，使DNA双链充分解开；95℃变性5秒，破坏DNA双链的氢键；60℃退火30秒，使引物与模板特异性结合；共进行40个循环，在每个循环中，DNA聚合酶会以引物为起点，沿着模板链合成新的DNA链，通过实时监测荧光信号的变化，即可准确测定模板DNA的拷贝数。根据标准曲线计算病毒滴度，公式为：病毒滴度（vg/mL）=（拷贝数/μL）×稀释倍数×1000。其中，拷贝数根据标准曲线计算得出，稀释倍数为提取病毒基因组DNA时的稀释倍数。同时，为了进一步验证病毒滴度的准确性，采用感染滴度测定方法，如采用293T细胞进行感染实验，通过观察细胞中绿色荧光蛋白的表达情况，计算感染滴度（如TU/mL，TransducingUnitpermilliliter）。将不同稀释度的病毒液感染293T细胞，感染48-72小时后，在荧光显微镜下观察并计数表达绿色荧光蛋白的细胞数。根据公式：感染滴度（TU/mL）=（表达绿色荧光蛋白的细胞数×稀释倍数）/感染时所用病毒液体积，计算感染滴度。通过实时荧光定量PCR法和感染滴度测定法相结合，能够更准确地确定重组腺相关病毒的滴度，为后续研究DLL4基因靶向RNAi重组腺相关病毒对胃癌细胞及血管内皮细胞的作用提供可靠的实验依据。五、DLL4/Notch信号途径对HUVECs细胞生物学行为的影响5.1实验设计与方法为深入探究DLL4/Notch信号途径对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）生物学行为的影响，本研究设计了一系列严谨且科学的实验，具体方法如下：细胞培养与分组：从新鲜的脐带中分离获取HUVECs，将其培养于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的M199培养基中，置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养。待细胞生长至对数生长期时，进行分组实验。实验共设置以下几组：正常对照组（Control组），给予常规培养基培养，不进行任何干预，作为实验的基础对照；阴性对照组（NC组），转染不针对任何基因的阴性对照RNA，以排除转染试剂等因素对实验结果的干扰；DLL4敲低组（siDLL4组），采用脂质体转染法将针对DLL4基因的小干扰RNA（siRNA）转染至HUVECs中，以特异性敲低DLL4的表达；Notch抑制剂组（NI组），加入Notch信号通路特异性抑制剂（如γ-分泌酶抑制剂DAPT），抑制Notch信号通路的激活；DLL4过表达组（oeDLL4组），通过转染含有DLL4基因的过表达质粒，使DLL4在HUVECs中高表达。细胞增殖能力检测：采用EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）掺入实验检测细胞增殖能力。将各组HUVECs以5×10³个/孔的密度接种于96孔板中，培养24小时后，按照EdU试剂盒说明书进行操作。向培养基中加入EdU工作液，继续培养2小时，然后弃去培养基，用4%多聚甲醛固定细胞15分钟。随后用0.5%TritonX-100通透细胞10分钟，加入Click反应液，避光孵育30分钟。最后用DAPI染色细胞核，在荧光显微镜下观察并拍照。随机选取5个视野，计数EdU阳性细胞数和总细胞数，计算EdU阳性细胞比例，以此评估细胞增殖能力。公式为：EdU阳性细胞比例（%）=（EdU阳性细胞数/总细胞数）×100%。细胞迁移能力检测：运用Transwell实验检测细胞迁移能力。将Transwell小室（8μm孔径）置于24孔板中，在上室中加入无血清培养基重悬的各组HUVECs（5×10⁴个/孔），下室中加入含20%FBS的培养基作为趋化因子。培养24小时后，用棉签轻轻擦去上室未迁移的细胞，用4%多聚甲醛固定下室迁移的细胞15分钟。然后用0.1%结晶紫染色10分钟，用PBS冲洗3次。在显微镜下随机选取5个视野，计数迁移到下室的细胞数，以此评估细胞迁移能力。管腔形成能力检测：采用Matrigel基质胶实验检测细胞管腔形成能力。将Matrigel基质胶在冰上融化后，迅速加入到预冷的96孔板中，每孔50μL，置于37℃孵箱中30分钟，使其凝固形成基质胶层。将各组HUVECs以5×10⁴个/孔的密度接种于Matrigel基质胶上，加入含10%FBS的培养基。培养6-8小时后，在显微镜下观察并拍照。随机选取5个视野，测量管腔的总长度、分支点数等参数，使用ImageJ软件进行分析，以此评估细胞管腔形成能力。DLL4/Notch信号通路相关分子检测：在实验处理结束后，收集各组HUVECs，采用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术，检测DLL4、Notch受体（Notch1-4）及其下游靶基因（如HES1、HEY1等）在mRNA和蛋白水平的表达变化。实时荧光定量PCR方法如前文所述，以GAPDH作为内参基因，计算目的基因的相对表达量。Westernblot实验步骤如下：提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取适量蛋白样品，加入上样缓冲液，煮沸变性5分钟。将变性后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将蛋白转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭PVDF膜，室温孵育1-2小时。加入相应的一抗（兔抗人DLL4多克隆抗体、兔抗人Notch1-4多克隆抗体、兔抗人HES1多克隆抗体、兔抗人HEY1多克隆抗体等，均按1:1000稀释），4℃孵育过夜。次日，TBST冲洗3次，每次10分钟，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1:5000稀释），室温孵育1-2小时。TBST冲洗后，采用化学发光底物显色，在凝胶成像系统下观察并拍照。以β-actin作为内参蛋白，通过ImageJ软件分析条带灰度值，计算目的蛋白的相对表达量。5.2对HUVECs增殖能力的影响通过EdU掺入实验检测DLL4/Notch信号途径对HUVECs增殖能力的影响，结果显示，正常对照组（Control组）和阴性对照组（NC组）的EdU阳性细胞比例无明显差异（P>0.05），表明阴性对照RNA对HUVECs的增殖能力无显著影响，排除了转染试剂等因素对实验结果的干扰。在DLL4敲低组（siDLL4组）中，EdU阳性细胞比例显著高于Control组和NC组（P<0.01），这表明敲低DLL4基因后，HUVECs的增殖能力明显增强。DLL4作为Notch信号通路的配体，其表达降低会导致Notch信号通路激活受阻，从而解除了对HUVECs增殖的抑制作用，使得细胞增殖能力增强。Notch抑制剂组（NI组）加入Notch信号通路特异性抑制剂（如γ-分泌酶抑制剂DAPT）后，EdU阳性细胞比例同样显著高于Control组和NC组（P<0.01）。γ-分泌酶抑制剂能够抑制Notch受体的切割和活化，阻断Notch信号的传导，进而导致HUVECs的增殖能力上升，这进一步证实了Notch信号通路对HUVECs增殖具有抑制作用。与之相反，DLL4过表达组（oeDLL4组）中，EdU阳性细胞比例显著低于Control组和NC组（P<0.01）。过表达DLL4使得更多的DLL4与Notch受体结合，激活Notch信号通路，从而抑制了HUVECs的增殖能力。通过实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹检测DLL4/Notch信号通路相关分子在各组中的表达变化，发现siDLL4组中DLL4的mRNA和蛋白表达水平显著降低，同时Notch受体（Notch1-4）及其下游靶基因（如HES1、HEY1）的表达也明显下降。NI组中，虽然DLL4的表达无明显变化，但Notch受体的活化形式NICD以及下游靶基因HES1、HEY1的表达显著降低。而oeDLL4组中，DLL4的表达显著升高，Notch受体及其下游靶基因的表达也明显上调。这些结果表明，DLL4/Notch信号途径对HUVECs的增殖能力具有重要的调控作用，DLL4通过激活Notch信号通路，抑制HUVECs的增殖；当DLL4表达降低或Notch信号通路被抑制时，HUVECs的增殖能力增强。DLL4/Notch信号通路主要通过调控下游靶基因（如HES1、HEY1等）的表达来实现对HUVECs增殖的调控。HES1和HEY1作为Notch信号通路的关键下游靶基因，它们可以通过抑制其他促进细胞增殖的转录因子的活性，从而抑制HUVECs的增殖。当DLL4/Notch信号通路被阻断时，HES1和HEY1的表达降低，解除了对促进细胞增殖相关转录因子的抑制作用，使得HUVECs的增殖能力增强。5.3对HUVECs迁移能力的影响运用Transwell实验检测DLL4/Notch信号途径对HUVECs迁移能力的影响，结果表明，正常对照组（Control组）和阴性对照组（NC组）迁移到下室的细胞数无明显差异（P>0.05），再次验证阴性对照对实验无干扰。在DLL4敲低组（siDLL4组），迁移到下室的细胞数显著多于Control组和NC组（P<0.01），这表明敲低DLL4基因后，HUVECs的迁移能力明显增强。DLL4表达降低，导致Notch信号通路激活受阻，使得原本被抑制的细胞迁移相关机制得以释放，细胞迁移能力增强。Notch抑制剂组（NI组）加入Notch信号通路特异性抑制剂（如γ-分泌酶抑制剂DAPT）后，迁移到下室的细胞数也显著高于Control组和NC组（P<0.01）。这是因为γ-分泌酶抑制剂抑制了Notch受体的切割和活化，阻断了Notch信号传导，从而促进了HUVECs的迁移。相反，DLL4过表达组（oeDLL4组）迁移到下室的细胞数显著少于Control组和NC组（P<0.01）。过表达DLL4使更多的DLL4与Notch受体结合，激活Notch信号通路，抑制了HUVECs的迁移能力。实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹检测结果显示，siDLL4组中DLL4的mRNA和蛋白表达水平显著降低，Notch受体（Notch1-4）及其下游靶基因（如HES1、HEY1）的表达也明显下降。NI组中，DLL4的表达无明显变化，但Notch受体的活化形式NICD以及下游靶基因HES1、HEY1的表达显著降低。oeDLL4组中，DLL4的表达显著升高，Notch受体及其下游靶基因的表达也明显上调。这些结果表明，DLL4/Notch信号途径对HUVECs的迁移能力具有重要的调控作用，DLL4通过激活Notch信号通路，抑制HUVECs的迁移；当DLL4表达降低或Notch信号通路被抑制时，HUVECs的迁移能力增强。DLL4/Notch信号通路主要通过调控下游靶基因（如HES1、HEY1等）的表达来实现对HUVECs迁移的调控。HES1和HEY1可以抑制一些促进细胞迁移的基因表达，如基质金属蛋白酶（MMPs）等，从而抑制HUVECs的迁移。当DLL4/Notch信号通路被阻断时，HES1和HEY1的表达降低，对MMPs等基因的抑制作用减弱，MMPs表达增加，降解细胞外基质，促进HUVECs的迁移。5.4对HUVECs管腔形成能力的影响通过Matrigel基质胶实验，深入探究DLL4/Notch信号途径对HUVECs管腔形成能力的影响，这对于揭示其在血管生成调控机制中的作用至关重要。将Matrigel基质胶在冰上融化后，迅速加入到预冷的96孔板中，每孔50μL，置于37℃孵箱中30分钟，使其凝固形成基质胶层。随后，将各组HUVECs以5×10⁴个/孔的密度接种于Matrigel基质胶上，并加入含10%FBS的培养基。培养6-8小时后，在显微镜下进行观察并拍照记录。实验结果表明，正常对照组（Control组）和阴性对照组（NC组）在Matrigel基质胶上能够形成较为完整且规则的管腔结构，管腔长度和分支点数适中，两者之间无明显差异（P>0.05），这进一步证实了阴性对照对实验无干扰。在DLL4敲低组（siDLL4组），HUVECs在Matrigel基质胶上形成的管腔总长度显著增加，分支点数也明显增多，与Control组和NC组相比，差异具有统计学意义（P<0.01）。这表明敲低DLL4基因后，HUVECs的管腔形成能力明显增强。当DLL4表达降低时，Notch信号通路激活受阻，原本被抑制的与管腔形成相关的基因和蛋白得以表达和激活，从而促进了HUVECs的管腔形成能力。Notch抑制剂组（NI组）加入Notch信号通路特异性抑制剂（如γ-分泌酶抑制剂DAPT）后，HUVECs形成的管腔总长度和分支点数同样显著高于Control组和NC组（P<0.01）。γ-分泌酶抑制剂抑制了Notch受体的切割和活化，阻断了Notch信号传导，使得细胞内与管腔形成相关的信号通路被激活，进而促进了管腔形成。相反，DLL4过表达组（oeDLL4组）HUVECs形成的管腔总长度明显缩短，分支点数显著减少，与Control组和NC组相比，差异具有统计学意义（P<0.01）。过表达DLL4使更多的DLL4与Notch受体结合，激活Notch信号通路，抑制了HUVECs的管腔形成能力。实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹检测结果显示，siDLL4组中DLL4的mRNA和蛋白表达水平显著降低，Notch受体（Notch1-4）及其下游靶基因（如HES1、HEY1）的表达也明显下降。NI组中，DLL4的表达无明显变化，但Notch受体的活化形式NICD以及下游靶基因HES1、HEY1的表达显著降低。oeDLL4组中，DLL4的表达显著升高，Notch受体及其下游靶基因的表达也明显上调。DLL4/Notch信号途径对HUVECs的管腔形成能力具有重要的调控作用，DLL4通过激活Notch信号通路，抑制HUVECs的管腔形成；当DLL4表达降低或Notch信号通路被抑制时，HUVECs的管腔形成能力增强。DLL4/Notch信号通路主要通过调控下游靶基因（如HES1、HEY1等）的表达来实现对HUVECs管腔形成的调控。HES1和HEY1可以抑制一些促进管腔形成的基因表达，如血管生成素（Angiopoietin）家族成员等。当DLL4/Notch信号通路被阻断时，HES1和HEY1的表达降低，对Angiopoietin等基因的抑制作用减弱，Angiopoietin表达增加，促进内皮细胞之间的相互连接和管腔的形成。六、DLL4/Notch信号途径对荷瘤裸鼠肿瘤生长及血管生成的影响6.1荷瘤裸鼠模型的建立为了深入研究DLL4/Notch信号途径在体内对肿瘤生长及血管生成的影响，本研究建立了胃癌荷瘤裸鼠模型。选用4-6周龄、体重18-22g的BALB/c裸鼠，购自[实验动物供应商名称]，在SPF级动物实验室内适应性饲养1周，自由进食和饮水。将处于对数生长期的人胃癌细胞系SGC-7901用0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁷个/mL。用1mL无菌注射器吸取细胞悬液，在裸鼠右侧腋窝皮下缓慢注射0.2mL，确保细胞均匀分布。接种后，每天观察裸鼠的一般状态，包括精神、饮食、活动等情况，测量并记录肿瘤的长径（a）和短径（b），根据公式V=1/2×a×b²计算肿瘤体积。当肿瘤体积达到100-150mm³时，认为荷瘤裸鼠模型建立成功，可用于后续实验。在荷瘤裸鼠模型建立过程中，严格遵循实验动物伦理和福利原则，采取适当的措施减少动物的痛苦。同时，对实验环境进行严格控制，保持温度在（25±2）℃，相对湿度在（50±10）%，12h光照/12h黑暗的环境循环，以确保裸鼠处于适宜的生长条件下，减少环境因素对实验结果的影响。通过上述方法建立的荷瘤裸鼠模型具有较高的成功率和稳定性，能够较好地模拟胃癌在体内的生长情况，为研究DLL4/Notch信号途径对荷瘤裸鼠肿瘤生长及血管生成的影响提供了可靠的实验基础。6.2实验分组与处理将建立成功的荷瘤裸鼠随机分为4组，每组[X]只，分别进行不同的处理。对照组（Control组）：给予裸鼠尾静脉注射等体积的生理盐水，每天1次，连续注射[X]天，作为正常对照，用于观察肿瘤在自然状态下的生长及血管生成情况。阴性对照组（NC组）：尾静脉注射含有阴性对照RNA的重组腺相关病毒，病毒滴度为[X]vg/mL，注射体积为[X]μL，每天1次，连续注射[X]天，以排除重组腺相关病毒载体及注射操作等因素对实验结果的影响。DLL4敲低组（siDLL4组）：尾静脉注射含有针对DLL4基因的小干扰RNA（siRNA）的重组腺相关病毒，病毒滴度为[X]vg/mL，注射体积为[X]μL，每天1次，连续注射[X]天。通过RNA干扰技术，特异性敲低DLL4基因在荷瘤裸鼠体内的表达，以研究DLL4表达降低对肿瘤生长及血管生成的影响。Notch抑制剂组（NI组）：腹腔注射Notch信号通路特异