土壤健康综合表征的生物测试方法-征求意见稿编制说明

《土壤健康综合表征的生物测试方法》（征求意见稿）编制说明起草工作组二〇二一年一月

一、编制背景及意义土壤支撑着地球主要生命过程，保持着生态系统的平衡，提供着人类必需的食物，它在当今粮食安全保障和生态环境建设等诸方面发挥着不可替代的重要作用（沈仁芳，2018）。土壤科学在保障国家农业可持续发展和生态文明建设中具有重要的学科战略地位。当前，全球面临着土壤资源短缺、环境污染加剧、生态系统退化、自然灾害频发和气候变化等重大挑战，严重威胁着经济社会可持续发展、生态环境安全和人体健康。如何协调发挥土壤的生产功能、环境保护功能、生态工程建设支撑功能和全球变化缓解功能，成为现代土壤学为人类社会可持续发展作贡献的重要任务（沈仁芳等，2020）。近年来，在联合国粮农组织、国际土壤科学联合会等机构的推动下，土壤健康管护理念已成为共识。我国人均耕地较少，土壤质量不高，部分地区土壤退化严重。据《全国土壤污染状况调查公报》，全国耕地土壤污染点位超标率高达19.4%，以重金属污染为主，耕地土壤的安全利用面临严重威胁。另外，由于土壤高强度利用、连续种植引起的连作病害，也使得土壤健康程度不断下降，进而引起农业生产效益降低（张俊伶等，2020）。掌握耕地土壤健康状况及其动态变化，实现耕地土壤健康管护，对保障我国粮食安全和生态文明建设具有紧迫的现实意义。因此，迫切需要开展面向耕地的土壤健康评价（Karlenetal.,2019；汤怀志等，2020）。土壤健康问题日益得到国内外关注，但土壤健康是土壤的内在属性，不能通过人为观察而直接获得，需要建立合适的评价指标和评价方法才能对其进行量化表征。而建立土壤健康评价标准是一项非常复杂的工程。目前，国内外土壤健康/质量研究主要集中在某个特定土地利用方式下或者农业耕地条件下的中、小空间尺度上多空间尺度、多功能维度研究相对缺乏（吴克宁等，2020）。在实践方面，长期以来，我国自然资源部耕地质量等级调查评价（原农用地分等）和农业农村部耕地质量等级调查评价（原耕地地力调查评价）两项工作中，形成了以县域为项目单位、以田块为评价单元，逐级汇总形成省域、国家级成果的耕地资源评价体系，为耕地利用与管理提供了坚实的基础。但这两套方案受当时科学方法和保护理念制约，一方面，均忽略了土地评价中“不同尺度解决不同问题”的一般性原则，存在尺度杂糅的问题，不易准确、快速地描绘县域以上尺度的状况，难以满足不同层级的管理需求。另一方面，两套方案主要表征“本底”生产潜力、服务耕地培肥，对土壤功能与土壤环境状况考虑不足，评价结果的作用单一，难以服务目前多目标的耕地土壤健康管护（吴克宁等，2020）。所以建立科学的土壤健康评价标准是目前农业生产的迫切需求。耕地是保障国家粮食安全、实施乡村振兴的根本。土壤健康是保障生态安全和支撑美丽中国的基础。我国土壤环境污染严重，区域扩展日益突出，已经影响到全面建设小康社会和实现可持续发展的战略目标。《土壤健康综合表征的生物测试方法》的目的主要是通过选取土壤食物网中的代表性生物指标的检测来确定土壤健康状况。本标准的制定可以为粮田、菜地、果园等不同类型的农用地提供一个简单、易行的评价标准，弥补土壤健康评价领域标准的空白。该标准中土壤健康评价对未来我国土壤科学的研究与发展，均有重要的指导意义，也是土壤科学发展的重要任务。二、任务来源为了建立土壤健康评价体系，推动土壤质量标准的制定，中国科学院南京土壤研究所通过土壤质量标准化委员会（SAC/TC404）申请《土壤健康综合表征的生物测试方法》国家标准立项，2013年获得国家标准委立项批准（计划编号20130520-T-326）。主管部门为农业部，技术归口单位为全国土壤质量标准化技术委员会。标准起草单位为中国科学院南京土壤研究所、南京农业大学、中国科学院沈阳应用生态研究所、南京市蔬菜科学研究所和江苏省标准化研究院。三、编制原则（一）目标明确。标准编订的目标主要是通过生物的方法评价土壤健康程度，以反映和预测土壤在促进植物健康生长方面的功能。（二）可操作性强。标准所涉及的方法简单易行，具有普适性和通用性。（三）科学性。内容上参考国内外土壤质量评价文献，并结合农田土壤的实际情况，确保标准的科学性和先进性。（四）规范性。本标准按GB/T1.1—2020的要求进行编写。四、编制过程（一）预研阶段2012年4月，由中国科学院南京土壤研究所向全国土壤质量标准化技术委员会提出本标准的标准建议书和标准草案。同时开始查阅文献，收集国际、国家和行业的标准、规范和专著。并开始对标准所涉及到内容进行试验研究。（二）立项阶段2013年12月25日中国标准化管理委员会下达了《国家标准委关于下达2013年第一批国家标准制修订计划的通知》（国标委综合[2014]89号），对《土壤健康综合表征的生物测试方法》进行了立项，计划编号20130520-T-326，主管部门为农业部，技术归口单位为全国土壤质量标准化技术委员会。（三）起草及试验阶段2014年1月，按全国土壤质量标准化技术委员会下达的《全国土壤质量标准化技术委员会关于2013年土壤质量标准项目制定工作组的安排》，成立标准起草工作组，开始工作组讨论稿和编制说明的编写工作。由中国科学院南京土壤研究所和南京市蔬菜科学研究所联合编写土壤健康的发光细菌生物测试法和土壤健康的四季豆根系形态测试法；南京农业大学编写土壤健康的蚯蚓生物测试法；中国科学院沈阳应用生态研究所编写土壤健康的生活线虫生物测试法。2014年2月-2016年7月，进行连作病害土壤健康程度的生物测试方法的试验及编写工作，具体如下：2014年2月，在南京进行温室蔬菜土壤样品（黄棕壤）采集，布置温室试验，验证本标准对黄棕壤健康表征方法的研究。2014年10月，在海南香蕉园进行土壤（红壤）样品采集，布置温室试验，验证本标准对红壤健康表征方法的研究。2015年5月，在沈阳设施蔬菜进行土壤样品（棕壤）采集，布置温室试验，验证本标准对棕壤健康表征方法的研究。2015年6月-2016年5月，在内蒙古温带典型半干旱草原生态系统，采集土壤样品，研究不同放牧强度对线虫群落组成和多样性的影响，验证本标准对土壤健康的线虫群落表征方法。2016年3月开始查找国内外关于发光细菌生物测试法的资料。2016年6月将GB/T15441—1995《水质急性毒性的测定发光细菌法》和美国材料试验协会制定的固相样品发光菌毒性标准：ASTMD5660-96(2009)进行整合，编写土壤健康的发光细菌生物测试法。2015年6月-2019年12月，同时进行土壤健康的蚯蚓生物测试法和土壤健康的线虫生物测试法的试验及编写工作。具体如下：2015年6月-2015年12月，进行野外线虫、蚯蚓采集方法的评价。确定了通过电击法进行野外蚯蚓的采集，按照浅盘法进行土壤线虫分离。2016年2月-2016年6月，选择了江苏省从苏南到苏北的几个不同土壤类型和质量的地区进行了预实验，确定蚯蚓和线虫采样范围和样点个数。2016年7月-2017年6月，进行利用线虫蚯蚓表征土壤健康程度可行性的野外调研。并采集土壤样品带回实验室进行理化性质的分析。采用网格法，共搜集全省48个县市，692个采集点的数据，基本覆盖了所有高中低质量的土壤。2017年7月-2018年9月，进行蚯蚓数量的统计和形态学鉴定。通过建立江苏省蚯蚓数量和种类的数据库，确定不同类型、肥力、健康程度的土壤的蚯蚓数量和种类。2018年10月-2019年12月，进行线虫数量的统计和形态学鉴定。通过建立江苏省线虫数量和种类的数据库，确定不同类型、肥力、健康程度的土壤线虫数量和种类。2020年2月开始对整个标准的征求意见稿进行撰写。2020年9月标准编制组在沈阳召开会议，对征求意见稿初稿进行了讨论、汇总，并提出了修改的方向。2020年9月标准编制组成员、标准委员会成员以及江苏省质量和标准化研究院的专家在南京召开会议，对标准的整个框架和接下来的工作进行了讨论和布置。2020年11月标准编制组全体成员召开一次线上会议，对标准征求意见稿和编制说明的内容进行了讨论。2020年12月标准编制组全体成员又召开一次线上会议，对标准征求意见稿和编制说明的内容进行了第二次讨论，形成终稿。2020年12月撰写完成标准征求意见稿，报送标准委员会。（四）征求意见阶段五、主要技术内容及确定依据（一）国内外相关标准分析1、土壤健康的定义土壤是类生命体，其健康状态应更多从土壤生态系统的角度来定义，但相对于人体健康的概念，土壤健康至今仍未有一个公认的定义，土壤健康与土壤质量在内涵上一直存在争议，很多学者认为土壤质量和土壤健康是同义的，可以互换使用。但是，也有学者认为两者存在一定区别，从定义上土壤健康不仅涉及人类健康，还强调了动植物的健康。土壤质量通常与土壤适宜于某一特定功能相联系，而土壤健康将土壤当作一个有限的、动态的生物资源（DoranandZeiss,2000）。从时间尺度考虑，可以用土壤健康描述土壤短期内的“潜在的”和“动态的”状况，用土壤质量描述长时间尺度上的“内在的”和“静态的”状况（Carteretal.,1997）。从研究角度，Anderson（2003）认为土壤健康应主要集中在土壤的生物成分上，主要考虑土壤的生物学组分以及土壤生态系统功能性。在自然生态系统范围内两者也不完全等同，一些低质量的土壤可以认为是健康的，例如处于演替初期或不利环境下的土壤，它们只有低的生物多样性和生物生产潜力，事实上它们处在自然的发展阶段（Sparling，1997）。因此，土壤健康的内涵与土壤生物学性质及其功能密切相关。随着国内外的研究进展，土壤被认为是具有生命的，是“活”的。因此，土壤健康与土壤质量的概念也逐渐分离，土壤质量侧重土壤固有的内在属性，与土壤利用用途无关，而土壤健康侧重“活”的方面，与人体健康或生态系统健康概念相类比，描述的是“生命体”的一种状态，是与具体的土壤利用目标和管理活动及环境因素相对应的一种状态，是动态的（Rinotetal.,2018;Bünemannetal.,2018）。土壤健康与土壤健康质量是两个不同的概念。土壤健康质量定义为土壤容纳、净化污染物质、保障清洁生产和提供人畜健康所需养分的能力，可以根据土壤中的元素含量和污染物含量及相关土壤性质决定(周健民，2015）。FAO土壤健康定义为：“土壤作为一个生命系统具有的维持其功能的能力。健康的土壤能维持多样化的土壤生物群落，这些生物群落有助于控制植物病害、害虫以及杂草虫害；有助于与植物的根形成有益的共生关系；促进基本植物养分的循环；通过对土壤持水能力和养分承载容量产生的积极影响，从而改善土壤结构，并最终提高作物产量；不会污染环境；通过维持或增加自身的碳容量，缓解气候变化”（FAO，2008）。综合来说，土壤健康是土壤作为一个活的复杂系统具有的维持其生态功能的能力。换言之，具有生物活力并具有良好功能的土壤才可定义为健康的土壤。土壤质量与土壤健康之间的关联和区别可用下图表示。在指定管理条件（或土壤利用）及光温水等环境条件下，土壤质量所处状态与特定的土壤健康状态指标相比较，即可判定土壤的健康状况。因此，土壤健康可定义为在特定环境与目标用途下，土壤功能可正常运转的能力或状态。从上述概念梳理来看，土壤健康已经形成了较为一致的经典定义，抽象地概括了健康的土壤应具备的特性。但如同土壤质量概念一样，由于土壤健康与人地关系的密切相关性，时至今日它仍因受人为主观影响而被质疑其科学属性。这种争议性和它本身的抽象性，给土壤健康评价工作带来了一定困扰。食物网是生态系统中各种不同生物类群通过一系列捕食和被捕食的营养关系构成的复杂关系网络，是生态系统物质循环和能量流动的主要驱动者，也是衡量土壤健康程度的重要生物学指标。本标准通过选取在食物网中占据不同营养级的主要功能群：植物根系，细菌和线虫群落以及蚯蚓，通过四季豆根系形态测试法、发光细菌生物测试法、线虫群落生物测试法和土壤健康的蚯蚓生物测试法从不同方面分别表征土壤的健康程度。2、国际标准分析国际标准是指国际标准化组织（InternationalOrganizationforStandards，ISO）、国际电工委员会（InternationalElectrotechnicalCommission，IEC）和国际电信联盟（InternationalTelecommunicationUnion，ITU）制定的标准。以“soilhealth”为检索词，在ISO官方网站（）没有检索到相关的标准，只有土壤质量方面的国际标准，大部分由美国、德国、法国和丹麦等国家制定。主要内容涉及土壤科学相关术语的评审和整理、土壤采样方法、土壤分析的化学方法与土壤特性、土壤分析的生物学方法、土壤理化性质分析等，还未见“土壤健康”和“土壤功能”评价及生物表征方法相关的标准。虽然未能检索到“土壤健康”相关的国际标准，但关于“土壤健康评价”的科研工作却一直在进行。自21世纪初以来，由美国农业部科学家Andrews等提出的土壤管理评价框架（SoilManagementAssessmentFramework,SMAF），在全球得到了广泛应用，并被不断改良与发展（Bünemannetal.,2018），对土壤健康/质量研究产生了深远影响。在这一理论框架指引下，土壤健康评价形成了“制定评价目标—明确评价对象和涉及的土壤功能—选取评价指标与评价方式—输出评价结果”的一般技术路线。其中以美国康奈尔大学土壤健康研究小组的研究最为系统。他们从2001年开始，从经济实用的角度，建立了农田土壤健康诊断指标体系与评价方法。该诊断体系首先根据对土壤管理措施响应的灵敏度、与土壤过程和功能的相关性、取样难易程度、测定成本等因素，从土壤物理、化学和生物学三个方面共选取了43个指标来全面地诊断土壤整体健康状况。然后从整个美国东北部收集数据，建立每个土壤样品的健康诊断指标的评分函数和计分方式。指标的分值介于0-100。实际操作中通过检测待评估土样每个指标单个分值和总的得分来评价土壤的健康程度。该分值以百分比表示，＜40%被认为非常低，40-55%为低，55-70%为中等，70-85%为较高，＞85%为非常高。至此，可以明确土壤的整体健康状况（Moebius-Cluneetal.,2016）。经过15年的研究与应用，该体系已经过三次调整，已经能够准确地评价土壤健康程度。现已在美国的东北部农田进行了广泛的应用，能够根据诊断结果中单个指标的好坏找出制约土壤健康的关键因素，然后分析解决这些制约因素的相应管理措施，最终提出针对性的土壤健康管理策略，服务于农业生产。目前该评价系统也在美国农业部及其下属研究单位应用，并且已经在全世界范围内承接服务，只要将土样邮寄给他们，便能给出最终的评价结果。3、国内标准分析我国虽然在80年代初期就开始了土壤质量相关的评价，但到目前为止，关于“土壤健康”相关的标准还未见报道。以“土壤质量”为关键词进行检索，大部分也是围绕为土壤学词汇、采样方法、重金属检测方法及土壤环境质量的标准。这些代表性的研究选用的土壤质量指标体系仍然是以土壤理化性质为主，而且主要侧重土壤肥力和土壤污染评价，缺少土壤健康评价和土壤修复及培育等方面的标准（刘世梁等，2006；陈美军等，2011）)。所以，我国在土壤质量评价中，评价方法发展还处于起步阶段，侧重土壤理化性质的评价，而作为土壤健康指标的生物指标较少，并且许多土壤指标会发生相互作用，因此，一个指标的值会被一个或多个其它参数影响。这也是我国土壤质量评价研究中不足的地方。评价在指标体系上仍需要进一步加强标准化、综合化和应用化（刘世梁等，2006）。总体来看，土壤健康诊断指标体系由定性向定量化方向发展，而评价指标与技术也逐渐从理论性向实用性方向跨越。土壤健康评价指标的确定是一项复杂的工作，而且不同的土壤系统之间差异很大。建立一个简单、敏感而具有代表性的评价指标体系是土壤健康评价的关键（AparicioandCosta,2007;Rinotetal.,2018）。关于土壤健康评价方法全球范围内尚无统一的标准和方法。土壤组成成分复杂，各组分之间在不同维度上相互影响，这些因素为衡量和评价土壤健康水平带来了严峻挑战。土壤生物直接参与大部分土壤生物化学过程，深刻影响着土壤生态系统服务，因此生物学指标被认为是反映土壤健康更直接也更准确的指标（梁文举等，2001；刘艳方等，2020）。（二）总体框架和主要内容评价土壤健康必须借助一定的评价指标体系，国内外尚没有统一的标准，也没有固定的方法，需要综合考虑生态系统的类型、土壤的功能、土地利用方式等，还要结合评价目的和评价尺度。建立一个简单、敏感、实用而具有代表性的评价指标体系是土壤健康评价的关键（Aparicio和Costa,2007）。本标准规定了土壤健康综合表征的生物测试方法的生物测试原理、样本采集、样本存储和处理、生物测试与测试报告等内容。适用于农田、果园、菜地、草原等土壤健康程度评价，包括四种测试方法，其确定依据如下：1、土壤健康的四季豆根系形态测试法1.1评价方法的确定康奈尔大学四位教授于2001年开始联合成立了康奈尔土壤健康团队，通过对美国境内2632个样本的检测，于2007年出版了土壤健康评价系统（Moebius-Cluneetal.,2016）。该评价系统已经过三次修订，目前他们已经在全世界范围内接收土壤样品，进行土壤健康评价服务。其中在植物土传病害评价方面采用了四季豆根系健康指示法。本标准采纳了康奈尔大学土壤健康评价工作小组关于土壤健康的生物测试方法，根据我国的实际情况进行了修改，并通过我国代表性土壤对该方法进行了验证，增加了土壤样品的采集方法。植物土传病害是制约植物健康生长的重要因素之一，是土壤健康状况的直接反映。通过土壤中植物的生长状况反馈土壤功能，是从土壤内在能力（供给作物生长所需的养分等）上对土壤健康程度的评价。利用植物健康指示土壤健康是一种有效表征农田土壤健康状态的生物测试方法。因为植物发病程度是其生长的土壤和病害相关健康程度这一内在特性的外在表现（Abawietal.,2004）。健康的根系是植物旺盛生长和高产的必需条件，一个强大、有活力的根系可以有效地从土壤中获取营养和水分，保证植物健康生长。不健康的根系则会抑制植物生长，影响根与有益微生物的相互作用，而且根也是植物和微生物相互作用的前沿阵地，是土传病原菌侵染植物的首要组织。所以植物的根可以用来评价土壤的功能，而根系健康程度可以代表土壤的健康程度。此外通过植物根系分级表征植物的病害严重度也是植物病理学常用的研究方法，本标准采用植物根系形态评价植物健康即采纳自经典的植物病理学研究方法参考书《植病研究方法》（方中达，1998）。在对于根系健康等级的划分中表示某一特定的健康等级时用的是百分比范围，而不是确定的数值，主要参考了土壤学和植物病理学的研究方法，采用了土壤酸碱度和病情指数等级的制定原则，是一个范围而不是确定的数值，例如植物萎蔫性病害整株叶片萎蔫1-25%的病情指数为一级，中性土壤pH是6.5-7.5，而不是7.0。这样做表面上看是一个范围，但是实际上是根据实际情况而来，因为田间很难有正好pH7.0的土壤，也没有萎蔫程度正好是25%的植株，所以利用范围表征看似不精确，反而更准确，更切合田间实际。本标准利用在待评价土壤中种植对土壤健康状况敏感的植物品种，来检验土壤维持植物生长的功能，以土壤中植物生长的好坏来反应土壤的健康程度，通过对植物根部的健康表型分级确定土壤的健康程度，简单实用，既能量化又易于标准化操作。1.2植物品种的选择原则本标准是根据植物的表型评价土壤的健康程度，所以选择何种植物就显得尤为重要。植物品种的选择是基于以下几个原则：1）所选植物对土壤的健康状况要敏感，即不同健康程度土壤中所生长的植物表型（根）要有差异；2）所选的植物具有代表性，对环境和气候等条件要求不高，生长条件不能太苛刻，是常见的植物品种；3）植物品种要易栽培、种子易发芽、土壤中生长速度快，这样可以保证在短时间内观察到检测结果；4）生长表型要易于观察，健康程度容易定量和定性描述。基于以上的4个原则，结合康奈尔大学15年的工作经验，本标准选取了四季豆（PhaseolusvulgarisL.）。因为四季豆生长快，易成活，根部对土壤敏感，是细菌、真菌及线虫等病原物的寄主，这些病原物基本能代表田间主要发病的病原菌。可以通过其根部的大小、颜色和发病程度准确反映土壤的健康状态。当然不排除还有其他品种可以作为指示作物，但是四季豆可以满足本标准的需要。1.3生物测试原理根据植物病理学原理，植物病害由病原物引起，另外按照柯赫氏法则，病原物只有通过寄主植物的病害表型才能检验其致病性。土传病害是由土壤中病原物侵染而造成的，所以可以通过生长在带病土壤中植物的症状来检测土壤中的病原物的致病性。因此不同健康程度土壤中植物根系健康状况可以代表土壤中病原菌的致病力和土传病害的严重度，即可以通过植物根系健康状况间接表征连作病害土壤的健康程度，也就是健康植物来自健康土壤。具体为，将四季豆（PhaseolusvulgarisL）种植在试验土壤中，在适宜条件下生长一段时间后，完整收集四季豆根系，观察其生长情况，按照一定标准对根系进行分级，以此确定土壤健康等级，进行土壤健康评价。2、土壤健康的发光细菌生物测试法2.1评价方法的确定本标准中土壤健康的发光细菌生物测试法主要是采自GB/T15441-1995和ASTMD5660-96(2009)。由于发光菌法能很好地检测出环境介质中污染物的生物有效毒性，包括重金属、有机污染物和抗生素等，且有毒物质仅干扰发光细菌的发光系统，具有快速、简便、灵敏、成本低、检测下限低等优点，所以发光细菌毒性测试方法在20世纪60年代开始受到国内外越来越受到重视，我国目前实施《水质急性毒性的测定发光细菌法》(GB/T15441-1995)，所用的菌株为明亮发光杆菌T3小种（PhotobacteriumphosphoreumT3spp.）。国内外在近几年大型聚会、食品安全及饮用水的安全保障中该方法得到了广泛的应用。如1996年亚特兰大奥运会就应用了美国SDI公司的Microtox检测系统；“911”以后，美国80多家水厂陆续采用了发光细菌法进行水质检测；美国有26个州强制性要求应用Microtox测试技术。最初发光菌主要用于水体污染物的毒性检测，以后逐步发展形成了一系列标准的水生生态毒理学实验方法，美国材料试验协会已制定了固相样品发光菌毒性标准：ASTMD5660-96(2009)，并将此法用于土壤污染物毒性检测。将其用于土壤污染毒性评价，可以确定土壤毒性的剂量—效应关系，从而为污染物土壤限值标准的建立和土壤污染修复工程提供依据。2.2测试原理发光细菌法是通过检测发光菌的发光强度来表征检测体系中的污染状况，凡能够破坏或干扰发光细菌自身呼吸、生长、新陈代谢等生理过程的任何有毒物质都可以根据发光强度的变化来测试其毒性的强弱。广谱性检测原理研究表明，不同种类发光细菌的发光机理是大体相同的。简单地说，细菌发光反应是在分子氧作用和胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸及长链脂肪醛氧化，同时释放出最大发光强度在波长为450-490nm处的蓝绿光。通常用EC50值来比较各检测体系的污染状况，它表示正常代谢的细菌发光强度减弱至正常值的50%时所需要的污染物量。EC50的概念是从医学毒理学的半致死剂量（即能使一组受试动物中的一半死亡的药物量）引申而来的，相应的EC50是以能抑制50%的细菌发光强度，也就是相对发光强度等于50%时该样品的浓度值。显然，EC50值越小说明待测物的毒性越大。3、土壤健康的线虫群落测试法3.1评价方法的确定土壤线虫作为全球最丰富的后生动物，广泛存在于各种类型的土壤中，在维持土壤生态系统稳定、促进物质循环和能量流动等方面发挥着重要作用（张晓珂等，2019）。其中，食微线虫通过取食细菌和真菌来调节微生物的活动，并通过取食微生物，将有机氮转化为无机氮，供微生物或植物吸收利用。而捕食性线虫可通过取食食微线虫来调节氮的矿化。因此，作为初级和次级消费者的土壤线虫在食物链中占据了重要位置（杜晓芳等，2018），可通过线虫群落分析，来研究土壤环境的变化。3.2生物指标的选择原则土壤中生物相关的指标众多，能够用来进行土壤健康评估的指标应至少满足以下标准：（1）能够对土壤健康变化做出快速的响应；（2）有可行的测定方法；（3）能够对群落组成的变化进行合理的解释。与其它土壤动物相比，线虫有以下几方面的优势，使其能够作为理想的环境指示生物：一是线虫体型较小、分布广泛、世代周期短，对土壤环境变化响应迅速；二是分离方法简单，分离效率高，且成本较低；三是线虫科、属鉴定简单，其群落组成和营养结构的变化与生态系统过程联系紧密，因此能够用于土壤健康状况、生态系统演替或受干扰程度的评估(ISO,23611-4)。土壤线虫总数，和不同营养类群线虫数量的变化均能满足上述要求，且能够从不同方面表征土壤生态系统功能的健康程度，可作为土壤健康的评价指标。3.3线虫群落测试分析方法的建立线虫群落测试方法主要参考国际标准ISO23611-4:2011《Soilquality.SamplingofsoilinvertebratesSampling,extractionandidentificationofsoil-inhabitingnematodes》来选取制定。为了简化试验流程，在线虫提取方法上选择了贝尔曼漏斗的方法，使线虫的分离提取更简单易行。此方法也曾广泛用于土壤线虫生态学的研究。荷兰、西班牙和匈牙利等欧洲国家以及美国、以色列等，也相应开展了土壤线虫群落对土壤健康的生物指示作用研究，并一致认为土壤线虫群落分析作为环境变化敏感的指示生物，可用于评价土壤健康状况。4、土壤健康的蚯蚓生物测试法4.1评价方法的确定丰富的土壤生物是土壤健康的重要表现之一。土壤中生活着极为丰富的生物类群，它们对土壤的生长和发育、土壤肥力的形成和演变以及高等植物的营养供应状况均有重要促进作用。土壤微生物对陆地动植物残体的分解、土壤结构形成、有机物转化、有毒物质的降解等至关重要，同时对环境起着天然的过滤和净化作用。土壤动物是天然的“生态系统工程师”，其活动能够调节土壤微生物的活性，改善土壤理化性质，维持土壤生态系统的能量流动、物质循环和信息交换（张卫信2007）。因此土壤动物可以认为是土壤健康评价的重要指标。蚯蚓普遍存在各种生态环境中，占土壤生物总量的60%，是大型土壤动物的重要代表，在维持土壤生态系统功能中起着不可替代的作用。蚯蚓喜欢生活在阴暗潮湿，有机质较为丰富的土壤中，对污染物和极端环境十分敏感，因此可以作为土壤健康的指示生物。4.2蚯蚓指示土壤健康的优势蚯蚓对土壤健康的指示作用有如下4个优势：1）历史悠久，达尔文在1881年出版了生平最后一部专著《腐殖土的形成和蚯蚓的作用》，首次系统地论述了蚯蚓对土壤肥力的促进作用；2）适用性广泛，蚯蚓为土壤中常见的土壤动物，大量分布在各种利用方式的土壤中，其数量的变化依不同土地类型、土壤理化性质以及气候条件的变化而变化（Helenetal.,2019）；3）可操作性强，蚯蚓相较于其他小型动物和微生物，个体大小合适，形态特征明显且易于辨认，基于蚯蚓的调查容易推广；4）国际认可度高，国际标准委员会于2006年发布了蚯蚓的采集方法的相关标准（ISO23611-1），并于2018年进行了修订，为利用蚯蚓指示土壤健康的相关研究提供了借鉴。4.3评价方法的建立国际标准ISO23611-1:2018建议采用人工挖掘法和化学试剂法相结合的方法进行蚯蚓的采集，该方法适合于样点数量较少，人力资源相对充足的情况。经过实践，该方法在实际推广中也有如下问题：1）消耗大量的时间和劳动力；2）破坏土壤结构；3）测定结果的准确性较低（蚯蚓会逃离到下层土壤）；4）化学试剂有污染地下水的潜在风险（范如芹等，2010）。由于我国国土面积较大，土壤类型多样，在实际应用中电击法的优势更加明显：1）节约时间和人力；2）不破坏土壤；3）蚯蚓等土壤生物不会被毒害。并且电击法的效果也可以根据不同蚯蚓类群活动能力的不同而进行调整，保证了多种研究目的的需要（申智锋等，2020）。因此本标准建议使用更加简单易行的电击法进行蚯蚓的采集。六、与现行法律、法规、标准的协调性标准中的技术指标符合GB/T36197-2018《土壤质量土壤采样技术指南》的要求。标准的结构和编写符合GB/T1.1-2020的要求。七、重大分歧意见的处理经过和依据无八、对标准性质的建议建议本标准作为推荐性标准发布。九、对标准贯彻的建议本标准发布后，将有效支撑我国土壤质量工作。建议由全国土壤质量标准化技术委员会（SAC/TC404）协调组织本标准的宣贯，中国科学院南京土壤研究所、中国科学院沈阳应用生态研究所、南京农业大学、南京市农业技术推广站、江苏省质量和标准化研究院可提供技术支持。

附件：第一章土壤健康的四季豆根系形态测试方法的建立与验证一、试验设计（一）土壤来源及试验设计本标准目的是对连作病害土壤的健康程度进行生物学表征，为了制定出广泛适用于不同土壤的评价体系，土壤的选取不考虑其物理、化学和生物学特征，只是根据土壤的健康状况进行分组。检测试验包含了三种类型的土壤，每种土壤的利用形式不同，以验证本标准所涉及评价体系的可行性与实用性。（二）土壤样品来源的特点土壤类型方面包括三种，分别是红壤、棕壤和黄棕壤。地理位置包含南部（临高）、中部（南京）和北部（沈阳）。利用方式上有香蕉和蔬菜。处理设置上包括，自然界不同发病率，不同连作年限以及人为混合土样。选择多种样品的目的是为了样本具有多样性和代表性，所得到的结果才具有普适性和说服力。试验1：南方红壤香蕉园土壤健康程度的生物测试研究（一）土壤样品来源土壤采自海南省临高县香蕉种植园（19°55′20″N；109°40′52″E）。根据香蕉生长情况和香蕉枯萎病的发生情况，分四个等级进行采样。土壤采集深度是0-40cm，四个等级分别为不发病、发病率为10%、发病率为40%和发病率为70%。按照发病率，每个等级算1个处理，对应的四个处理分别为：处理一，不发病（LT1）；处理二，发病率为10%（LT2）；处理三，发病率为40%（LT3）；处理四，发病率为70%（LT4）。（二）试验方法及具体步骤1) 土壤样品需在低温（样品置于冰上）条件下运回实验室，尽快开展温室盆栽试验。在试验开展之前，取来的土壤要保存在4℃下。2) 供试土壤需充分混匀，然后再过8mm的筛子。3) 试验所用的盆栽器皿为高30cm，直径10cm圆柱形PVC管，底部有孔，每管底部放一个棉球，棉球不能太紧，可以漏水。每个PVC管均要放在管架上，中间间隔一个孔摆放，防止两管之间位置太紧，四季豆生长受阻。在每管前面贴上标签并标注试验处理，随机摆成一排。每个土样重复10次。4) 每管用漏斗加入约1.4kg混合均匀的土样，高度达到距PVC管顶部2.0cm处。注意每个土样之间不能交叉污染。5) 在每管中心播种一颗四季豆种子，有种脐的一侧水平放置，保证四季豆种子能够顺利萌发和生长，尽可能模拟田间条件。然后在管的顶部盖一层2.0cm的沙子，防治浇水时土壤板结。6) 将管架放入温室中进行生长，每天光照时间12～14h。进行常规管理，连续培养四周。7) 四周后，将植株从管中小心移出，用自来水洗净根部，谨慎操作，防止伤根，冲洗干净后，立即对其生长表型进行评价记录。8) 评价主要通过根部的大小、颜色和根质量，按评级标准进行描述，最后的等级对应于土壤健康等级。（三）结果1、土样基本理化性质表1-1不同发病率的香蕉园土壤养分含量处理发病率（%）全氮（%）全磷（%）全钾（%）LT100.056c0.082b0.110bLT2100.058b0.084ab0.105bLT3400.052c0.090a0.190aLT4700.063a0.058c0.188a注：同一列不同字母表示差异达到显著水平(Duncan’s多重比较，P=0.05)。土样来源于海南临高县有不同程度枯萎病发生的香蕉园红壤。本试验分别取该香蕉园当年香蕉发病率为0%（LT1）、10%（LT2）、40%（LT3）、70%（LT4）的0-40cm的新鲜土样，带回实验室处理并进行试验。由不同发病率香蕉园土壤养分含量（全NPK）可知（表1-1），不同的处理原始养分含量具有差异。发病率较高的土壤中全氮、全钾含量相对较高，而全磷含量显著低于其他发病率的土壤。尤其是全钾含量，在40%和70%两个发病率中，他们的含量显著高于其他处理。说明发病香蕉对氮、钾的吸收受到抑制，而加大了对磷的吸收。2、不同发病率的土壤中植株的生长情况温室试验按照试验设计进行，每个土样10个重复，及时浇水、保持空气流通。四季豆在PVC管中生长四周后收获，然后对不同处理四季豆的株高、茎粗、根长、地上部及地下部生物量、叶绿素含量进行测定（表1-2）。表1-2不同发病率土壤中四季豆的生长情况处理株高（cm）茎粗（mm）根长（mm）生物量（g/株）地上地下LT127.53ab4.73a49.33a2.39a0.96aLT230.17a4.47a49.13a1.31b0.64abLT320.13b4.25a43.83ab1.50b0.49bLT419.50b4.42a38.77b1.11b0.44b注：同一列不同字母表示差异达到显著水平(Duncan’s多重比较，P=0.05)。从四季豆的长势可见，四季豆的株高和茎粗按照香蕉枯萎病的发病率从轻到重成规律性降低，株高从27.53cm降低到19.50cm；茎粗从4.73mm减小到4.42mm，虽然LT3的茎粗比LT4要细，但不影响四季豆长势随香蕉发病率的增加而降低的趋势（图1-2）。因为本试验尤其注重对根生长的检测，所以特别分析了植株的地下部分生物量以及根长。根长结果表明，来源于两个发病率较低的土壤样品（LT1和LT2），他们中生长的四季豆根长差别不显著，随着发病率的增加，根长在显著的下降。地下部分生物量结果也表明，不发病与发病土壤中根的生物量具有显著的差异，随着发病率增加，生物量在逐渐下降，平均生物量从不发病的0.96g/株下降到0.44g/株（表1-2）。说明土壤的健康程度与植物的根系生长呈明显相关。3、四季豆根部健康状况表1-3不同处理中四季豆根部形态及等级划分处理叶绿素（mg/g）根部症状描述植物根系等级土壤健康等级LT13.53a胚轴以及根部呈现白色，而且手感自然粗糙，毛细根良好，表现健康。11LT23.12b下胚轴以及根部组织有浅色的、8-10%的病变覆盖率。22LT32.24c下胚轴病变覆盖率接近45-50%，根部组织未腐，中度破坏。33LT42.25c极度损害，呈褐色，在下胚轴和根部有50%～70%的病根。44植物的叶绿素含量和植物的光合速率呈正相关，本试验中不同处理的叶绿素含量也有明显区别，其中含量最高的是不发病的LT1处理，为3.53mg/kg。最低的是发病率较高的LT3和LT4（表1-3）。通过对根部形态的观察发现，植物根部的生长状态和土壤的来源显著关联，不发病或者发病率较低的红壤样本，其中根的长势较好，毛细根发白，主根侧根分明，根系发达，说明比较健康，有助于养分的吸收和正常功能的发挥。而发病率较高的土壤样本中，根呈现出病状，严重的变成褐色，须根变少。对照分级标准，我们将四季豆的根进行了分级，并根据根的等级，给出了相应的土壤健康等级（表1-3）。根据结果可知，四季豆根的等级可以很好的对应土壤样品的来源，即土壤样品发病率低，四季豆根系生长健康，随着土壤样品发病率的增加，四季豆根系生长健康等级呈下降趋势。说明可以通过根系的健康状况来评价其生长的土壤在维持植物生长功能方面的健康程度。图1-2不同发病率土壤四季豆的生长情况

试验2：不同栽培年限设施蔬菜土壤健康程度的生物测试研究（一）土壤样品来源土样来源于沈阳农业大学设施蔬菜生产试验基地（41°49′2″N；123°33′55″E），土壤类型为棕壤。按照蔬菜耕作年限设计试验处理。分别采了新种土壤、耕作1年、耕作2年及耕作3年的0-20cm的试验地新鲜土样。根据土壤中蔬菜的种植年限设为四个处理，处理一，新种地块（ST1）；处理二，耕作1年（ST2）；处理三，耕作2年（ST3）；处理四，耕作3年（ST4）。（二）试验方法同试验1。（三）结果1、土样基本理化性质土样来源沈阳农业大学设施蔬菜试验基地，分别取该基地不同连作年限（0、1、2、3年）0~20cm的新鲜土样，低温带回实验室进行温室试验。由表1-4可知，与未连作土壤相比，连作土壤中全氮、全磷养分的含量显著性降低；土壤中全钾的含量受连作的影响不大，未连作的土壤中钾含量与连作处理相比较低。表1-4不同连作年限土壤养分含量处理连作年限全氮（%）全磷（%）全钾（%）ST100.223a0.278a1.433bST210.162b0.088c1.535abST320.167b0.102b1.570aST430.158b0.078d1.513ab注：同一列不同字母表示差异达到显著水平(Duncan’s多重比较，P=0.05)。2、不同连作年限设施菜地植株的生长情况温室试验按照试验设计进行，每个土样做10个重复，及时浇水、保持空气流通。四季豆在PVC管中生长四周后收获，然后对不同处理四季豆的株高、茎粗、根长、地上部及地下部生物量、叶绿素含量进行测定（表1-5）。表1-5不同连作年限菜地土壤中四季豆生长情况处理株高（cm）茎粗（mm）根长（mm）生物量（g/株）地上部分地下部分ST133.5a4.84a52.5a2.39a0.73aST226.9b4.70a35.1b2.48a0.62bST319.2c3.75a26.7c1.86a0.16cST418.3c4.08a11.4d0.51b0.14c注：同一列不同字母表示差异达到显著水平(Duncan’s多重比较，P=0.05)。从四季豆地上部分长势来看，随着连作年限的增加，株高、茎粗和地上部分的生物量呈规律性下降，说明连作年限会影响到植株的生长（图3）。从地下指标来看，四季豆的根长随着连作年限的增加在变短，新种土壤的根长为52.5mm，连作1-3年的根长分别是35.1mm、26.7mm和11.4mm。地下部分生物量也相应地呈规律性降低，从新种的0.73g/株到0.14g/株（表1-5）。说明土壤的连续耕作会导致四季豆长势变弱。3、四季豆根部健康状况本试验同样检测了植物的叶片叶绿素含量，结果表明连作年限会影响四季豆叶片的叶绿素含量，连作三年处理的四季豆叶绿素含量显著低于其它处理（表1-6；图1-3）。通过对根部形态的观察发现，植物根部的生长状态和土壤连作年限显著关联，新种的和已经种植1年的土壤根长势旺胜，生物量较大，毛细根发白，主根侧根分明，根系发达，有助于从土壤养分的吸收以及与微生物的互作。种植1年的设施土壤，四季豆根呈现出零星病状对照分级标准，LT1和LT2均为1级，说明比较健康；连作2年和3年的土壤，根系活力下降。我们将四季豆的根进行了分级，并根据根的等级，给出了相应的土壤健康等级（表1-6）。一般来讲，土壤的连作会影响土壤健康程度，根据结果可知，四季豆根的等级可以很好的对应样品的来源，即土壤连作年限少的四季豆根系生长健康，随着连作年限的增加，四季豆根系生长健康等级呈下降趋势。本试验也同样证明能够通过根系的健康状况来评价土壤在维持植物生长功能方面的健康程度。表1-6不同连作年限四季豆根部形态及等级划分处理叶绿素（mg/g）根部症状描述植物分级土壤健康分级LT12.33a胚轴以及根部呈现白色而且手感自然粗糙，毛细根良好，表现健康11LT21.60b下胚轴以及根部组织成白色、有较多的毛细根，根形态正常，3-5%的病变情况；11LT31.46bc根部颜色发黄，病变接近40%，根部组织未腐，中度破坏；33LT41.34c根呈黄褐色，在下胚轴和根部约有70%病根；须根季显著减少44图1-3不同连作年限设施菜地土壤植株的生长情况试验3：混合设施菜地土壤健康程度的生物测试研究（一）土壤样品来源土壤采自南京横溪镇蔬菜大棚（31°43′10″N；118°46′38″E）0-20cm土样，采了两种样品，分别为大棚蔬菜土壤和大棚外未种植过蔬菜的土壤样品，其中大棚内土壤已连续种植茄果类蔬菜5年。为了防止田间自然情况对试验结果的影响，本试验设计了人为定量混合土样。设置5个不同的处理。具体方法为，处理一，全部为蔬菜大棚外未种植蔬菜的新鲜土壤（NT1）；处理二，将大棚外土壤和蔬菜大棚内土壤按照3:2的体积比混合（NT2）；处理三，将大棚外土壤和蔬菜大棚内土壤按照2:3的体积比混合的（NT3）；处理四，将大棚外土壤和蔬菜大棚内土壤按照1:4的体积比混合（NT4）；处理五，全部为大棚内蔬菜种植土壤样品（NT5）。（二）试验方法同试验1。（三）结果1、不同混合土壤中四季豆的生长情况为了避免田间直接采样由于人为定性观察带来的样本误差。本试验从南京蔬菜科学研究所试验基地，分别采了连作番茄试验大棚（连作病土）及未种的新鲜土样，低温带回实验室进行温室试验。然后按照固定的比例将二者进行混合。处理一（NT1）：全部为蔬菜大棚旁边未种植蔬菜的新鲜土壤；处理二（NT2）：将新鲜的未种植过的土壤和大棚土壤按照3:2的体积比混合；处理三（NT3）：将新鲜的未种植过的土壤和大棚土壤按照2:3的体积比混合的；处理四（NT4）：将新鲜的未种植过的土壤和大棚土壤按照1:4的体积比混合；处理五（NT5）：全部为大棚土壤样品。温室试验按照试验设计进行，每个土样做10个重复，及时浇水、保持空气流通。四季豆在PVC管中生长四周后收获，然后对不同处理四季豆的株高、茎粗、根长、地上部及地下部生物量、叶绿素含量进行测定（表1-7）。表1-7不同混合土样土壤中四季豆生长情况处理病土百分率（%）株高（cm）茎粗（mm）根长（mm）生物量（g/株）地上部分地下部分NT1048.19a5.07a41.47a1.86a0.61aNT24042.33a5.56a36.95a1.86a0.61aNT36036.12ab4.92a33.98a1.70ab0.43bNT48036.03ab4.62a30.26a1.71ab0.39bNT510023.08b4.85a21.91a0.97b0.33c注：同一列不同字母表示差异达到显著水平(Duncan’s多重比较，P=0.05)。从四季豆的长势可见，四季豆地上部分的长势和土壤的组成具有显著的相关性（表1-7）。从NT1到NT5，随着大棚连作病土比例的增加，四季豆地上部分的株高、茎粗和生物量都有规律下降。而且下降幅度很大，例如株高，NT1为48.09cm，而NT5的株高小于NT1的一半，仅为23.08cm。在四季豆的地下部分，其根长和地下生物量也极大的受到了病土比例的影响，二者随着病土比例的增加而递减（表1-7；图1-4）。表1-8不同混合土样四季豆根部形态及等级划分处理叶绿素（mg/g）根部症状描述植物分级土壤健康分级NT11.86a胚轴以及根部呈现白色而且手感自然粗糙，毛细根良好，表现健康11NT21.83a下胚轴以及根部组织有浅色的变色、8-10%的病变覆盖率；22NT31.75a下胚轴病变覆盖率接近45-50%，根部组织未腐，中度破坏；33NT41.70a下胚轴病变接近50%，根部组织未腐，根的颜色变深，中度破坏，须根减少；33NT51.27b极度损害，呈褐色，在下胚轴和根部有50%～70%的病根；442、四季豆根部健康状况不同处理中叶绿色的含量具有很大差异，随着病土比例的增加，叶绿素含量在下降，说明土壤的健康程度影响了四季豆叶片的生长（表1-8）。对照评级标准，通过对根部形态的观察发现，植物根部的生长状态和土壤病土所占的比例显著相关，未掺病土的处理根长势旺盛，根系发达，毛细根发白。病土占的比例较多的样本，根系明显变小，而且颜色逐渐变黄，须根减少，病变增加，根系活力下降。我们将四季豆的根进行了分级，并根据根的等级，给出了相应的土壤健康等级（表1-8；图1-4）。图1-4不同处理根部扫描照片本研究三个试验的结果均能有效说明可以根据温室试验中四季豆根的生长情况来反推土壤的健康程度，尤其是土壤在维持植物健康生长功能方面的作用大小。所以可以通过四季豆的根系生长情况表征土壤的健康程度。

第二章土壤健康的线虫群落测试法的建立与验证试验1:不同放牧强度的草地土壤健康程度的生物测试研究一、试验设计（一）土壤来源及试验设计本标准的目的是对不同土壤健康程度进行评价，为了验证标准中提出的指标体系，选择四个不同退化程度的土壤进行样品采集，分析测定土壤线虫群落，验证本标准中提出的评价体系能否对应不同退化程度土壤。二、验证过程（一）土壤样品来源土壤采自中国科学院内蒙古草原生态系统定位站（116°42′E,43°38′N）的划区轮牧试验平台，选择放养的绵羊均为15月龄，35kg的母羊。放牧时间从每年的六月中旬持续到九月下旬。本实验选择该设计中的四个放牧强度0、3、6、9羊/hm2来代表对照、轻度、适度和重度放牧(不同退化程度)。采样时间为8月（雨季），采样深度为0-15cm。采用5点取样法（直径为2.5cm的土钻），将每块样地四均分，在每个均分区内随机取5钻混匀，代表4次重复，将采集的土壤样品装入塑料袋带回实验室后放置于4℃冰箱。（二）土壤指标的测定（1）土壤含水量：采用烘干法（105℃烘干8h）（鲁如坤，2000）。（2）全氮：采用凯氏定氮法（鲁如坤，2000）。准确称取1g左右过100目筛的风干土，加入1.2-1.3g的硫酸钾-硫酸铜催化剂（20:1），加1mL水润湿土壤，加入5mL浓硫酸，盖上漏斗后150℃消煮1h，270℃消煮1h，380℃消煮3.5h，消煮后的溶液用全自动凯氏定氮仪测定全氮含量。（（3）土壤线虫群落测定：称取50g或100g鲜土倒入量杯中，加水至1L搅匀，静置1min，将上层悬浊液倒入网筛组，边倒边振荡分样筛，防止水分充满下层的400目筛而从筛中溢出；再向杯中加水至1L搅匀，静置1min，倒入网筛中。如此重复3次，将400目分样筛取下，用喷头把400目网筛中的线虫悬液中的泥浆冲洗干净，倒入烧杯中。将漏斗固定在架子上，下端接10cm长的胶管，胶管口上装一个止水弹簧夹。将烧杯中土壤线虫悬液倒入。由于趋水性和本身的重量，线虫离开土壤，在水中游动，最后沉降到漏斗末端的橡皮管中。约12h之后，打开胶管下部的弹簧夹，用试管接取液体样约5ml，静置1h，吸取上部多余水分；将试管放到水浴锅60℃热水中3min，杀死线虫；与福尔马林按1：1的比例，混合倒入标本瓶，做好记号，密封保存备用。（三）结果1、土壤基本理化性质土壤含水量可以直接或间接的影响地上植物生长、微生物的活动以及其他土壤性质与肥力状况等。不同退化程度的土壤含水量变化显著，表现为轻度退化土壤平均含水量最高。轻度退化可以促进再生植物的补偿生长，使得地表覆盖物增加，减少地表水分蒸发；同时增加地表凋落物与土壤的混合程度，使得凋落物所含水分部分进入土壤，增加土壤的含水量。随着退化程度的增加，土壤含水量逐渐降低（表2-1），原因在于牲畜啃食与践踏强度增大，土壤表层容重与硬度都相应增大，导致总孔隙度减小，土壤渗透力和蓄水能力减弱，因而土壤含水量相应减小。土壤中的全氮是植物生长所需最重要的养分之一，放牧家畜通过采食、践踏、排泄等行为直接或间接地影响土壤中氮的含量。在不同放牧强度之间，全氮也发生显著变化，放牧处理的全氮含量高于不放牧处理，且全氮含量随着放牧强度的增加而减少，轻度放牧处理的全氮含量最高。表2-1不同退化程度土壤养分含量的变化不同退化程度含水量（%）全氮（mgg-1）微生物生物量（mgkg-1）对照17.22a2.07b699.43ab轻度24.63ab3.01a879.97a适度12.81b2.07b560.34b重度12.96b2.13b514.35b注：同一列不同字母表示差异达到显著水平(Duncan’s多重比较，P<0.05)。大型食草类脊椎动物的践踏作用会通过尿液和粪便增加有机质的混合和活性元素的输入，这种现象会刺激新的根际生物量，使得根际分泌更多的活性碳组分，这些增加的活性碳组分为微生物的生长提供了资源。不同放牧强度对土壤微生物生物量产生了显著影响，表现为轻度退化土壤微生物生物量显著高于中度和重度退化处理。2、不同退化程度土壤线虫群落的变化在土壤线虫营养类群中，除小部分的植物寄生线虫对植物具有一定的侵染和危害外，其它绝大多数自由生活线虫通过参与土壤有机质的分解和养分循环，对植物生长及生态系统过程产生直接或间接的有益影响。不同退化程度显著改变了土壤线虫总数，最高值出现在轻度退化处理中，表明高强度的退化对土壤线虫产生了明显扰动，降低土壤健康程度。捕食/杂食线虫主要以原生动物、线虫、线虫的卵等为食，对环境变化敏感，在受扰动的环境中其密度和多样性均会降低。捕食/杂食线虫在食物网中处于较高的营养级，能通过捕食食微线虫，调节食微线虫种群密度并间接影响土壤微生物的生长与活性；它们也可以捕食植食性线虫，降低植食者对植物的危害。放牧强度显著影响了土壤中捕食/杂食线虫数量，随着放牧强度的增加，捕食/杂食线虫总数显著降低（表2-2）。表2-2不同退化程度对土壤线虫的影响退化程度线虫总数捕食/杂食线虫总数食真菌线虫总数土壤健康程度（条/100g干土）（条/100g干土）（条/100g干土）对照636.59b188.34a73.18a1级轻度1239.60a230.85a105.56a1级适度370.93c57.43b33.12b2级重度223.06d27.00c34.11b3级注：同一列不同字母表示差异达到显著水平(Duncan’s多重比较，P<0.05)。综合所有指标，判断不同退化程度土壤健康等级。结果表明，线虫群落指标体系能够有效区分不同退化程度下土壤的健康状况。

试验2:不同施肥措施的农田土壤健康程度的生物测试研究一、试验设计（一）土壤来源及试验设计本试验的目的是对长期施肥农田土壤健康程度进行评价。为了验证标准中提出的指标体系，基于长期施肥试验平台，选择平台中的三种施肥处理进行土壤样品采集，测定土壤线虫群落和土壤碳、氮含量等理化指标，验证本标准提出的评价体系能否评价不同施肥处理农田土壤健康程度，进而为农田土壤健康管理提供参考。二、验证过程（一）土壤样品来源土壤采自沈阳农业大学玉米田肥料长期定位试验地（41°49′N,123°34′E）。该地区属大陆性季风气候，年降雨量705mm，平均气温7.0–7.9°C。该试验地建于1987年，长期进行玉米连作，采取常规耕作方式，收获后玉米秸秆全部移出土体。土壤类型为棕壤，试验前耕层土壤的基本性质为：总有机碳9.05gkg-1,全氮1.00gkg-1,pH(H2O)6.39,砂粒16.7%，粉粒58.4%，粘粒24.9%。选取的施肥处理包括：不施肥对照（CK），单施有机肥（M，135kgNhm-2），单施氮肥（N，135kgNhm-2）。每个处理重复4次，采用随机区组排列，小区面积为67m2，设有保护行。有机肥为猪粪（含15%C、1.0%N、1.0%P2O5、0.4%K2O），一次性基施。氮肥为尿素，分基肥和追肥两次施用。采样时间为玉米成熟期，采用五点法采取0–20cm耕层土壤样品，将采集的土壤样品装入塑料袋带回实验室后放置于4℃冰箱。（二）土壤指标的测定（1）土壤总有机碳（TOC）：风干土壤样品研磨后过100目筛，称取100mg样品于锡囊内，使用元素分析仪（ElementarVarioELⅢ）测定。（2）土壤可溶性有机碳（DOC）：用蒸馏水以水土比2：1(质量比)进行浸提，即25℃恒温震荡30min(200rmin-1)，离心10min(6000rmin-1)，再用0.45μm滤膜抽滤，其滤液直接TOC仪（Analytikjena,MultiN/C3000）测定。（3）土壤硝态氮（NO3--N）和铵态氮（NH4+-N）：称取10g新鲜土样，加入2.0molL-1KCl溶液100ml，振荡1h后过滤，滤液使用AA3流动分析仪测定。（4）土壤pH：2.5:1水土比，pH计测定。(5)线虫群落分析测试同2.1（三）结果1.基本理化性质农田土壤中的有机碳包括植物、动物及微生物的残体、排泄物、分泌物及其部分分解产物、土壤腐殖质。土壤有机碳是反应土壤肥力水平，衡量土壤质量的重要指标。土壤有机质可以调节土壤水气矛盾，增加土壤养分含量，促进土壤团粒结构形成，因此土壤有机碳含量越高，土壤农耕质量越高，越利于农作物的生长及农作的进行。一直以来，有机碳含量已经被国内许多科学家作为一种衡量农田土壤质量变化的指标所广泛应用。水溶性有机碳主要指利用纯水提取出来的土壤有机碳，水溶性有机碳是土壤形成的控制性因素之一，它在土壤化学和生物学性质中起到重要的作用。水溶性有机碳的淋失是土壤有机质损失的重要途径，所以土壤水溶性有机碳的研究对于观测土壤肥力水平及土壤质量变化，及耕作措施变更对土壤产生的影响都有重要意义。氮素是作物生长所必需的营养元素，土壤氮素的丰缺及供给状况直接影响作物的生长发育。土壤氮素在土壤肥力中起着相当重要的作用，土壤中各种存在形态的氮素与作物生长有着密切的关系。分析土壤中各种形态氮的含量是评价土壤肥力的主要根据。土壤中的有机氮必须不断地通过土微生物的矿化作用转化有效氮形态，从而被植物吸收利用。而土壤中可以直接被植物吸收的无机氮主要成分是铵态氮（NH4+-N）和硝态氮（NO3--N）。土壤酸碱度是土壤重要的基本性质之一，是土壤形成过程和熟化培肥过程的一个指标。土壤酸碱度对土壤中养分存在的形态和有效性，对土壤的理化性质、微生物活动以及植物生长发育都有很大的影响。由于大多数作物必需的营养元素的有效性与土壤pH值有关，可以根据土壤的pH值评估土壤中养分的有效状况。许多研究表明，有机肥作为土壤有机碳的重要来源之一，其施用可直接增加土壤有机碳及其组分含量，而施化肥对土壤有机碳的影响结果则报道不一。本研究发现，与对照相比，玉米田有机肥处理显著增加了土壤总有机碳（TOC）和水溶性有机碳（DOC）含量（表2-3），这与前人的大多数研究结果相一致；而施用氮肥处理显著降低了土壤TOC和DOC含量，其原因可能在于氮肥的施用在一定时间内刺激了土壤微生物活动，从而增加了土壤有机碳的输出。本研究中，氮肥处理显著降低了土壤pH值，这主要是由于氮的硝化作用产生氢离子的缘故；作为不同形式的氮素来源，有机肥以及氮肥的施用均较对照显著增加了土壤无机氮含量（NH4+-N和NO3--N）。表2-3不同施肥处理对土壤理化性质的影响施肥处理TOC（gkg-1）DOC（mgkg-1）NH4+-N（mgkg-1）NO3--N（mgkg-1）pH对照8.87±0.19b99.89±1.59b0.19±0.01b0.38±0.02b6.38±0.01a施氮肥6.43±0.18c79.01±0.86a0.23±0.01a1.31±0.01a4.82±0.01b施有机肥9.96±0.02a115.32±2.07a0.18±0.03b0.41±0.01b6.25±0.02a注：同一列不同字母表示差异达到显著水平(Duncan’s多重比较，P=0.05)。2、不同施肥处理土壤线虫群落的变化线虫是土壤食物网的重要组成部分，其数量丰富，可以作为评价农业管理措施和环境变化对土壤质量健康影响的关键指标。土壤线虫食性多样，各自发挥着不同的生态功能，其对农业管理措施和环境变化的响应也往往有所差别。在本研究的玉米田条件下，长期不同施肥处理对土壤线虫具有显著影响（表2-4）。总的来看，土壤线虫总数趋于增加，这可能与施肥处理增加了土壤养分含量有关。与不施肥对照相比，长期施用有机肥显著增加了土壤线虫总数。本研究结果反映了有机肥对土壤环境和食物资源改善的重要作用。有机肥较不施肥对照增加了食细菌线虫数量。其中，食细菌线虫的增多可能归因于有机肥施用条件下土壤细菌活动的增强。本研究中，长期施用有机肥对食真菌和捕食杂食类线虫密度的总体影响不明显。表2-4不同施肥处理对土壤线虫的影响施肥处理线虫总数捕食杂食线虫食真菌线虫食细菌线虫食真菌线虫/食细菌线虫（条/100g干土）对照500b38ab159a126b1.26a氮肥560ab23b96a257a0.37b有机肥580a57a156a132b1.18a注：同一列不同字母表示差异达到显著水平(Duncan’s多重比较，P=0.05)。综合所有指标，判断不同施肥处理土壤健康程度。结果表明，施用有机肥维持了和土壤健康程度或有轻度退化，施用氮肥后土壤发生了中度退化。该指标体系能够有效区分不同施肥措施下土壤的健康程度。

第三章土壤健康蚯蚓数量相关生物测试方法的建立与验证一、试验设计（一）土壤来源及试验设计为了制定出广泛适用于不同土壤的评价体系，本标准土壤的选取不考虑其物理、化学和生物学特征，只是根据土壤的健康状况进行分组。检测试验包含了三种利用方式的土壤，以验证本标准所涉及评价体系的可行性与实用性。（二）土壤样品来源的特点土壤样品来源于江苏省的三种利用方式，即农田、果园和森林的土壤。其中森林包括人工林和自然林。三种土地利用方式的年限均为20年以上。农田为人为干扰最强烈的土地利用方式，果园次之，以森林的干扰为最低。因此土壤的健康程度为农田<果园<森林，通过调查这三种土地利用方式中蚯蚓的数量，建立蚯蚓与土壤健康程度的关系。采样的方式为网格法，每隔100km设置一个网格采样点，土壤采集的范围涵盖江苏省13个地级市。采集土壤样品的同时进行蚯蚓数量的调查和统计，同时将采集的蚯蚓带回实验室结合形态学和分子生物学进行鉴定。二、调查结果通过调查发现，江苏省的蚯蚓数量平均数为28条/m2，最多的可达300条/m2以上。通过形态学鉴定，这些蚯蚓来自45个物种，平均每个样点有1个物种，最多的样点物种数量是5。由于蚯蚓数量和多样性存在较高的相关性（r=0.6;P<0.001），考虑多样性的测度依赖形态学鉴定，因此仅采用蚯蚓数量作为土壤健康划分的测量指标。其优点如下：1）野外直接计数即可，操作简便、快速；2）对蚯蚓无伤害，计数完可直接放回土壤，保证蚯蚓的存活；3）无需专业知识背景，容易在人群中推广。通过蚯蚓数量的比较发现（图3-1），在三种土地利用方式下，蚯蚓的数量均显示类似的分布情况，即出现了三个波峰，分别在小于10、20-30之间、40-50条/m2时。因此建议选择10，30，50作为四个等级划分的依据。此外，农田、果园和森林的蚯蚓数量平均为27、31和41条/每平方米（图3-2）。表明蚯蚓的数量随着人为干扰的降低而增加，即随着土壤健康程度的增加而增加。图3-1每平方米蚯蚓数量在三种土地利用方式下的分布图3-2三种土地利用方式下蚯蚓的数量三、国内外的比较在欧洲进行的一项荟萃分析发现荷兰、德国、法国、爱尔兰、苏格兰、斯洛文尼亚、西班牙和丹麦蚯蚓的平均数量分别达到了252、114、61、164、37、16、73和136条/平米（Rutgersetal.,2016），表明蚯蚓数量的分布受多种气候和土壤环境因素的影响。与江苏省蚯蚓的平均数量相比，除了斯洛文尼亚，欧洲蚯蚓的数量总体上高于江苏省蚯蚓的数量，可能的原因是欧洲的蚯蚓和江苏省的蚯蚓物种组成不一样，欧洲的蚯蚓以报道较多的正蚓科为主，而江苏的蚯蚓以数量较少的巨蚓科为主。此外，欧洲的土地利用方式以草地为主，有机质含量相对较高，为蚯蚓的生存提供了丰富的食物来源。尽管蚯蚓数量的分布呈现地域性的特点，近期关于全球蚯蚓分布的报道表明，在全球尺度上蚯蚓的数量在5~150条/平米之间（Helenetal.,2019）。该报道的数据还表明中国北方的蚯蚓数量明显大于中国南方蚯蚓的数量，与欧洲蚯蚓的数量大于江苏的蚯蚓的数量相似，可能的原因是土壤有机质含量的分布，因此可以再次说明蚯蚓的数量可以反应土壤的质量以及健康的状况。

国家标准：水质急性毒性的测定发光细菌法水质急性毒性的测定发光细菌法GB/T15441-1995Waterquality—Determinationoftheacutetoxicity—Luminescentbacteriatest1主题内容与适用范围1.1主题内容本标准规定了测定水环境急性毒性的发光细菌法。1.2适用范围本标准适用于工业废水、纳污水体及实验室条件下可溶性化学物质的水质急性毒性监测。2方法提要基于发光细菌相对发光度与水样毒性组分总浓度呈显著负相关（P≤0.05），因而可通过生物发光光度计测定水样的相对发光度，以此表示其急性毒性水平。水质急性毒性水平按8所述条件选用相当的参比毒物氯化汞浓度（以mg/L为单位）来表征，或选用EC50值（半数有效浓度——以样品液百分浓度为单位）来表征。3试剂和材料本标准所用试剂除另有说明外，均应为符合国家标准的分析纯试剂、蒸馏水或同等纯度的水。3.1氯化汞HgCl2。3.2氯化钠NaCl，化学纯。3.3明亮发光杆菌T3小种（PhotobacteriumphosphoreumT3spp.）冻干粉，安瓿瓶包装，每瓶0.5g，在2~5℃冰箱内有效保存期为6个月。新制备的发光细菌休眠细胞（冻干粉）密度不低于每克800万个细胞；当按6.2.4步骤将冻干粉复苏2min后即发光（可在暗室内检验，肉眼应见微光），稀释成工作液后每毫升菌液不低于1.6万个细胞（5ml测试管）或2万个细胞（2ml测试管）（均为稀释平板法测定）。在毒性测试仪上测出的初始发光量应在600~1900mV之间，低于600mV允许将倍率调至“X2”档，高于1900mV允许将倍率调至“X0.5”档。仍达不到标准者，更换冻干粉。3.4氯化钠溶液，3g/100ml。氯化钠3g于玻璃容器内，用量筒加蒸馏水100ml。3.5氯化钠溶液，2g/100ml。氯化钠2g，加蒸馏水100ml，于试剂瓶内，2~5℃保存。3.6参比毒物氯化汞标准溶液。.0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14，0.16，0.18，0.20，0.22，0.24mg/L。3.7氯化汞母液，p=2000mg/L。万分之一分析天平精称密封保存良好的无结晶水氯化汞0.1000g入50ml容量瓶，用3g/100ml氯化钠溶液稀释至刻度，置2~5℃冰箱备用，保存期6个月。3.8氯化汞工作液，p=2mg/L。用移液管吸氯化汞2000mg/L母液10ml入1000ml容量瓶，用3g/100ml氯化钠溶液定容。再用移液管吸取氯化汞20mg/L液25ml入250ml容量瓶，用3g/100ml氯化钠溶液定容，将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶，然后，用3g/100ml氯化钠溶液将氯化汞2mg/L溶液按表1稀释成系列浓度（一律采用50ml容量瓶）。这些氯化汞稀释液保存期不超过24h，超过者务必重配。加氯化汞（2mg/L）数，ml0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.0稀释定容后氯化汞浓度，mg/L0.020.040.060.080.1060.180.200.220.24表1氯化汞工作溶液稀释配制系列（在50ml容量瓶中）4仪器4.1生物发光光度计。配置2或5ml测试管。当氯化汞标准溶液浓度为0.10mg/L时，发光细菌的相对发光度为50%，其误差不超过±10%。4.22ml或5ml测试样品管（具标准磨口塞，为制造比色管的玻璃料制作，由专业玻璃仪器厂制造），分别适用于相应型号的生物发光光度计。4.3微量注射器：10µl。4.4注射器：1ml。4.5定量加液瓶：5ml。4.6吸管：2、10、25ml。4.7试剂瓶：100ml。4.8量筒：100、500ml。4.9棕色容量瓶：50、250、1000ml。4.10半微量滴定管（配磨口试液瓶，全套仪器均为棕色）：10ml。5样品5.1样品的采集和保存a.采样瓶使用带有聚四氟乙烯衬垫的玻璃瓶，务必清洁、干燥。采集水样时，瓶内应充满水样不留空气。采样后，用塑胶带将瓶口密封。b.毒性测定应在采样后6h内进行。否则应在2~5℃下保存样品，但不得超过24h。报告中应写明水样采集时间和测定时间。c.对于含固体悬浮物的样品须离心或过滤去除，以免干扰测定。5.2样品液的稀释5.2.1样