山杏种质资源精准鉴定技术规范

1山杏种质资源精准鉴定技术规范本标准规定了山杏（Prunussibirica）种质资源精准鉴定的术语和定义、技术要求、鉴定方法和档案管理等技术内容。本标准适用于辽宁省山杏种质资源的精准鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改订单）适用于本文件。LY/T2192-2013林木种质资源共性描述规范LY/T2745-2016仁用杏品种鉴定技术规程SSR分子标记法NY/T2594植物品种鉴定DNA分子标记法总则3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1山杏野生的蔷薇科杏属植物，在辽宁地区主要指西伯利亚杏（Prunussibirica），落叶乔木或灌木。3.2种质生物体亲代传递给子代的遗传物质，决定了生物体的遗传性状和遗传特征，是生物遗传信息的载体。3.3种质资源具有实际或潜在利用价值的植物遗传材料，包括山杏的野生种、栽培种、变种及人工创造的各种遗传材料。3.4SSR标记由几个核苷酸（一般为1~6个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。3.5SSR指纹图谱利用SSR核心引物，对不同山杏种质资源进行PCR扩增，根据DNA水平差异，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳技术具有特异性差异片段的成像图，结合引物字母标记法对不同山杏种质资源进行特异性标记。4植物学性状鉴定内容树体特征：主要包括树龄、树高、干径、冠幅、主枝基角、树形、分枝习性、枝干特征及枝干颜色。枝条特性：主要包括小枝长度、粗度、颜色、被毛、节间长度及果枝类型。2叶片形态：主要包括叶片长度、宽度，叶形指数，叶柄长度、粗度、腺体数量，叶片颜色、形状，叶基、叶尖、叶缘形状，叶面光滑度，叶表及叶背被毛情况。花器官特征：主要包括花瓣颜色、数量、褶皱，花冠径，花萼颜色，雌蕊数量及发育程度，花丝与花药颜色，完全花比例。果实性状：主要包括果实形状、果顶形状、果皮颜色、果肉颜色、果肉质地、果肉厚度、果肉干燥及开裂程度、核粘离性、果实口感、果三径及单果重。核特征：主要包括杏核形状、核背基，核基部是否聚合、是否对称，核翼纹、核缝翅、核面光滑度、核三径、单核重、出核率及产核量。仁性状：主要包括仁数、杏仁口感、仁三径、单仁重、出仁率及饱满度。5分子鉴定内容分子鉴定采用SSR分子标记鉴定，构建指纹图谱、分子身份证。6鉴定方法6.1植物学性状鉴定选择至少3株正常生长的盛果期植株进行观察和采集样本。每个性状应在同一地点至少进行3年的重复有效鉴定。植物学性状鉴定方法见附录A。6.2分子鉴定6.2.1DNA检测采用CTAB法或商业化试剂盒提取山杏基因组DNA，要求OD260/280为1.8-2.0，浓度≥50ng/μL，琼脂糖凝胶电泳检测无降解。通过聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段，对其DNA进行检测和分析。6.2.2指纹图谱构建方法1：利用Excel2017构建0/1矩阵模型，利用DataFormater2.7实现数据格式之间的转换。利用GenAlEx6.5软件计算每个SSR标记的鉴定概率（PI）和组合后鉴定概率（PIsibs），根据PI和PIsibs筛选核心引物用于构建指纹图谱，并利用草料二维码生成器（https://cli.im/）生成指纹图谱二维码。方法2：利用ImageLab4.0读取凝胶影像条带，获取原始基因型结果。利用DataTrans2.0将其转换为基因型数据及“0”和“1”的矩阵。通过POP-GENE32和CERVUS软件计算遗传参数，并运用NTSYS2.10和MEGA5.1进行UPGMA聚类分析。利用NTSYS2.10和GenAlEx6.502计算种质间的遗传距离和地理距离，并开展Mantel检验。利用ClusterProject构建种质指纹图谱。6.2.3分子身份证构建方法1：将每对引物扩增出的基因型（带型按分子量大小用自然数1～9进行赋值，对于9以上的基因型则用字母A—Z表示，未扩增出等位变异片段的赋值为“0”，每个带型占1位，构建字符串形式的分子身份证编码，将分子身份证编码导入条形码生成器（/）构建条形码身份证，将品种来源、生长特性以及字符串编码等信息导入二维码生成器（https://cli.im/），生成可供扫描的二维码身份证。3方法2：采用特定数字编码（01、02、03......10、11、12等）并按分子量从小到大的排序对电泳片段带型依次编号，将核心标记的编号进行组合生成资源的字符串分子身份证。整合字符串和资源的基本信息（序号、统一编号、字符串、品种名称、品种来源等），导入草料二维码生成器（https://cli.im/）完成二维码DNA分子身份证的构建。7鉴定方法建立山杏种质资源档案，对调查、鉴定过程中收集的调查记录、样本信息和鉴定报告等进行整理和归档，包括文字资料、图片、影像资料等，实行信息化管理，定期更新并备份，确保山杏种质资源档案的可追溯性和安全性。4（资料性附录）山杏植物学性状鉴定方法A.1植物学性状鉴定方法表A.1植物学性状鉴定方法植物学性状鉴定方法树龄实生苗以实际年份为树龄，嫁接苗、扦插苗以嫁接、扦插年份起计算树龄。树高指树木从地面上根茎到树梢之间的距离或高度，单位为（m），精确到0.1m。干径主干距地面5cm处的粗度，单位为厘米（cm），精确到0.1cm。冠幅东西、南北冠幅长度的平均数，单位为（m），精确到0.1m。主枝基角各主枝与树干垂直方向上夹角的平均值。树形观察自然状态下整株的树形，分为自然开心形、主干形、自然圆头形、灌丛形、倒卵形和宽倒卵形。分枝习性春梢停止生长后夏梢抽发前，测量3个基部主枝中心轴线于主干的夹角，依据夹角的平均值确定分枝习性，分为直立、半开张和开张。枝干特征观察自然状态下枝条形状，分为直立生长、枝条下垂、枝条弯曲和密生枝刺。枝干颜色观察自然状态下枝干颜色，分为灰褐色、灰黑色和红褐色。小枝长度随机测量20个一年生枝的长度，结果以平均值表示。单位为厘米（cm），精确到小枝粗度随机测量20个一年生枝基部的直径，结果以平均值表示。单位为毫米（mm精确到0.1mm。小枝颜色于树体生长期观察自顶芽抽生的一年生枝，确定小枝颜色，分为绿色、灰褐色、黄褐色和红褐色。小枝被毛于树体生长期观察自顶芽抽生的一年生枝，确定小枝被毛，分为疏毛和无毛。节间长度于树体生长期测定一年生枝中部位置两个叶片的距离，单位为毫米（mm），精确果枝类型在果实成熟时期，从成龄树上随机观察20个生长正常的果枝，确定果枝类型，分为长果枝（30cm以上）、中果枝（15-30cm）、短果枝（5-15cm）和花束状果枝（0-5cm）。叶片长度选取树冠外围新梢中部的成熟叶片，测定从叶基部切线至叶尖基部的长度，单位为厘米（cm），精确到0.1cm。叶片宽度选取树冠外围新梢中部的成熟叶片，测定叶片最宽处的长度，单位为厘米（cm精确到0.1cm。叶形指数计算叶片长度/叶片宽度的比值，确定叶形指数。5叶柄长度选取树冠外围新梢中部的成熟叶片，测定叶柄的长度，单位为厘米（cm精确到叶柄粗度选取树冠外围新梢中部的成熟叶片，测定叶柄的粗度，单位为毫米（mm），精确叶柄腺体数量观察叶柄上的腺体数量，分为1个、2个、3个和无。叶片颜色选取树冠外围新梢中部的成熟叶片，观察叶片的颜色，分为浅绿色、绿色、深绿色和紫红色。叶片形状选取树冠外围新梢中部的成熟叶片，观察叶片的形状，分为卵圆形、三角状卵圆形、近圆形、椭圆形、心形和宽卵圆形。叶基形状选取树冠外围新梢中部的成熟叶片，观察叶基的形状，分为楔形、圆形、截形和心叶尖形状选取树冠外围新梢中部的成熟叶片，观察叶尖的形状，分为渐尖、长渐尖、尾尖、凸尖和长尾尖。叶缘形状选取树冠外围新梢中部的成熟叶片，观察叶缘的形状，分为粗钝锯齿（锯齿钝，锯叶面光滑度选取树冠外围新梢中部的成熟叶片，触摸叶面，确定叶面的光滑度，分为光滑和粗糙。叶表被毛选取树冠外围新梢中部的成熟叶片，观察叶表被毛，分为有毛和无毛。叶背被毛选取树冠外围新梢中部的成熟叶片，观察叶背被毛，分为有毛和无毛。花瓣颜色观察盛花期多数花瓣的颜色，分为白色、粉白色、粉色和粉红色。花瓣数量观测单株多数花朵的花瓣数量。花瓣褶皱观察花瓣褶皱情况，分为有褶皱和无褶皱。花冠径在盛花期，从成龄树上随机测定20个生长正常花朵的花冠径，分为大花（花冠径大于3cm以上）、中等花（花冠径1.5cm~3.0cm）和小花（花冠径小于1.5cm）。花萼颜色观察盛花期的花萼颜色，分为紫红色、红褐色和绿色。雌蕊数量观察盛开花朵的雌蕊数量，分为1个、2个和多个。雌蕊发育程度观察雌蕊的发育程度，分为低于雄蕊长、等于雄蕊长、高于雄蕊长和显著高于雄蕊。花丝颜色在盛花期，观察花丝的颜色，分为白色、红色和其他。花药颜色在盛花期，观察花药颜色，分为黄色、粉色、红褐色和其他。完全花比例在盛花期，统计完全花占总花数的百分比，以%表示。果实整齐度观测成熟果实的整齐程度，包括颜色、大小和形状等，分为整齐、一般和不整齐。果实对称性成熟期果实缝合线两侧的片肉是否对称，分为不对称和对称。果实形状在果实成熟期，于植株东、南、西、北4个方向的小枝上各选取10~20个果，观察果实的腹观面形状，分为扁圆形、扁卵圆形、扁宽圆形、扁长圆形。果顶形状在果实成熟期，于植株东、南、西、北4个方向的小枝上各选取10~20个果，观察果实顶部的形状，分为凹入、平、圆凸、尖圆。果皮颜色在果实成熟期，于植株东、南、西、北4个方向的小枝上各选取10~20个果，观察果皮的颜色，分为黄色（杏黄色）、桔红色、青红色、红色斑点果皮、淡黄色、红黄色和黄红色。果肉颜色在果实成熟期，于植株东、南、西、北4个方向的小枝上各选取10~20个果，观察果肉所呈现的颜色，分为白色、淡黄色、黄色、橙色和黄绿色。6果肉质地在果实成熟期，于植株东、南、西、北4个方向的小枝上各选取10~20个果，观察果实果肉的口感质地，分为沙面、软溶质、硬溶质和脆。果肉厚度在果实成熟期，于植株东、南、西、北4个方向的小枝上各选取10~20个果，测定果肉的厚度，单位mm，精确到0.1mm。果肉干燥程度在果实成熟期，于植株东、南、西、北4个方向的小枝上各选取10~20个果，观察果肉的干燥程度，分为干燥、多汁和少汁。果肉开裂程度在果实成熟期，于植株东、南、西、北4个方向的小枝上各选取10~20个果，观察果肉开裂程度，分为开裂、半开裂和不裂。核粘离性在果实成熟期，于植株东、南、西、北4个方向的小枝上各选取10~20个果，观察核粘离性，分为离核、半离核和粘核。果实口感在果实成熟期，于植株东、南、西、北4个方向的小枝上各选取10~20个果，品尝果实的口感，分为酸、甜、涩、李味、酸甜和酸涩。果三径在果实成熟期，于植株东、南、西、北4个方向的小枝上各选取10~20个果，测定果实的长度、宽度、厚度，单位为（mm），精确到0.1mm。单果重在果实成熟期，于植株东、南、西、北4个方向的小枝上各选取10~20个果，测定单个果实的重量，单位为（g），精确到0.1g。杏核形状观察杏核的形状，分为扁圆形、扁卵圆形、扁宽圆形、扁长圆形和圆鼓形。核背基观察核背基，分为平和突出。核基部是否聚合观察核基部是否聚合，分为聚合和不聚合。核基部是否对称观察核基部是否对称，分为对称和不对称。核翼纹观察核翼纹，分为内凹、平和外凸。核缝翅观察核缝翅，分为锐、钝和展翅。核面光滑度观察核面光滑度，分为平滑（拇指与食指平行捏住杏核，捻动之，易捻动）、较平滑（拇指与食指平行捏住杏核，捻动之，捻动有顿挫感）和粗糙（拇指与食指平行捏住杏核，捻动之，不易捻动/捻不动）。