DB15T 2855-2023 马铃薯腐烂茎线虫的qPCR检测技术规程

152023-01-28发布本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定蒙古自治区农牧业技术推广中心、鄂托克前旗农牧I马铃薯腐烂茎线虫的qPCR检测技术规程本文件规定了利用qPCR检测技术对马铃薯腐烂茎线虫检测的试剂、仪器、样品处理、DNA提取、结本文件适用于土壤和马铃薯植物样品中腐烂茎线虫的qPCGB/T6682分析实验室用水规格和NY/T1121.1土壤检测第1部分：土壤样品的采集、处理和储存3.1腐烂茎线虫ditylenchusdest腐烂茎线虫属于线虫门（Nematoda）、侧尾腺纲（Secernrntea）、垫刃目（Tylenchida）萎蔫、块茎干腐等症状，导致减产和品质降低。参3.2依据荧光信号的强度对扩增产物进行实时监测4.1.1除特别规定外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。14.1.3CTAB缓冲液：2%CTAB，1.4MNaCl，0.1MTris-HCl，0.02MEDTA，pH=8.0。E缓冲mMTris-HCl，1mMEDTA，pH=8.0。4.1.4TE缓冲液：10mMTris-HCl，），4.2仪器20℃),超低温冰箱（-80℃),制冰机，水浴锅，涡旋振荡仪，磁力搅拌器，高压灭菌锅，定量荧），），4.3材料），），），土壤样品采集方法采用NY/T1121.1。湿环境。此外，土壤样品也可于干燥箱中(≤40℃)进行24h烘干。取6.2.2中经前处理的土壤样品，按照四分法进行取样，将土样平铺于塑料薄膜或纸张上，呈四方每份土样取3个重复，每个重复取10g土样于50mL离心管中，加入20mL土壤提取缓冲液，涡旋震2混匀一次，水浴完毕后12000rpm离心10min，将上清移至新的2mL离心管中，加入1mL氯仿，震荡混匀，12000rpm离心10min，将上清移至新的2mL离心管中，加入1mLTris饱和酚，震荡混匀，12000MGB。反应体系中各试剂的量在保持浓度不变的前提下可随总体积进行调整，也可使用商业化qPCR试剂3MgCl2DNA模板倍稀释液或50倍稀释液为模板，进行qPCR检测，每个样品设置三个技术最小检测浓度为每个反应体系5个靶标片段拷贝，在反应体系正常工作的前提下，根据Ct值进行结——待测样品DNA原液或任一浓度稀释液检测结果Ct＜35，判定该样品中检出腐烂茎线虫；——待测样品DNA原液及所有稀释液检测结果均为Ct≥40，判定该样品中未检出腐烂茎线虫；——待测样品DNA原液及稀释液检测所得最小Ct值范围为35≤Ct＜40时，应重新进行检测，结4后续研究和生产需要。保存期满后，马铃薯腐烂茎线虫5），A.2生物学特性该线虫可在5℃~34℃下发育繁殖，最适温度为20℃~27℃。在27℃~28℃下完成生活史需要18d，20℃~24℃时需要20d～26d，在6℃~10℃时需要68d高温在35℃以上即停止活动，即恢复活动，浸在水中半个月，茎线虫并不完全死亡。在15℃~20℃,相对湿度90%～100%条件下危害最重，相对湿度低于40%线虫不能存活。该线虫不形成抗性休眠体，不耐干燥，以卵