基于Wntβ-catenin信号通路探讨天麻素的抗抑郁作用机制

基于Wnt/β-catenin信号通路探讨天麻素的抗抑郁作用机制摘要目的：研究天麻素调控Wnt/β-catenin信号通路改善CMS诱导的小鼠抑郁样行为的作用机制。方法：（1）选择50只C57BL/6J雄性小鼠，按照糖水偏好率随机分为Ctrl组、CMS组、CMS+GAS组、CMS+IWP-2组、CMS+ICG001组，CMS组小鼠给予7周的慢性温和应激；CMS+GAS组小鼠在第4周到第7周用50mg/kg的天麻素干预；CMS+IWP-2组小鼠在天麻素干预的同时，给予Wnt阻断剂IWP-2处理；CMS+ICG001组小鼠在天麻素干预的同时，给予β-catenin阻断剂ICG001处理；探讨天麻素的抗抑郁作用是否受Wnt/β-catenin信号通路影响。（2）通过糖水偏好实验、旷场实验和悬尾实验来检测各组小鼠是否具有抑郁样行为。（3）对小鼠脑组织的冷冻切片处理，采用免疫组织荧光技术对其进行染色，其中利用BrdU对增殖细胞进行标记，而DCX则用于标记新生的神经元，定量分析这两种细胞在海马齿状回区域的分布和数量。比较Ctrl组、CMS组、CMS+GAS组、CMS+IWP-2组和CMS+ICG001组小鼠海马神经发生水平上的差异；利用Iba1对小胶质细胞进行标记，通过对海马齿状回区域中小胶质细胞的活化程度进行量化，来研究各组小鼠海马神经炎症之间的差异。（4）通过酶联免疫吸附法对各组小鼠海马中的多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺等神经递质及IL-6、TNF-α等炎症因子进行测定。结果：（1）糖水实验和悬尾实验数据显示，天麻素可以改善CMS小鼠的快感缺失、不动潜伏期和一动不动总时间，阻断Wnt/β-catenin信号通路后天麻素改善的效果受到抑制，提示天麻素可以通过Wnt/β-catenin信号通路改善小鼠的抑郁状态。（2）旷场实验结果显示，天麻素能有效缓解CMS小鼠焦虑样行为，阻断Wnt/β-catenin信号通路后缓解焦虑样行为的效果被抑制，提示天麻素通过Wnt/β-catenin信号通路可以改善抑郁小鼠的焦虑样行为（3）免疫组织荧光染色结果显示，天麻素能提高抑郁小鼠海马中增殖细胞的数量（BrdU+）与新生神经元数量（DCX+），阻断Wnt/β-catenin信号通路后其作用效果受到抑制。揭示了天麻素能够通过Wnt/β-catenin信号通路有效提升抑郁小鼠海马的神经发生潜能。（4）免疫组织荧光染色结果显示，麻素能降低抑郁小鼠海马中的小胶质细胞活化水平，阻断Wnt/β-catenin信号通路后小胶质细胞活化水平增加。提示天麻素能够通过Wnt/β-catenin信号通路降低抑郁小鼠的神经炎症。（5）酶联免疫吸附实验结果显示，天麻素能增加抑郁小鼠海马中的神经递质水平（多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺）、降低炎症因子水平（IL-6、TNF-α）；阻断Wnt/β-catenin信号通路后小鼠海马中的神经递质水平降低、炎症因子增加。提示天麻素能够通过Wnt/β-catenin信号通路提高抑郁小鼠的神经递质和降低神经炎症。结论：天麻素通过Wnt/β-catenin信号通路促进CMS小鼠海马神经细胞的增殖并刺激其向神经元分化，提高成年海马的神经发生能力；并减少海马中的小胶质细胞活化与炎症因子表达，降低海马神经炎症水平；同时增加CMS小鼠海马神经递质水平，进而改善应激小鼠抑郁样行为。关键词：抑郁症、天麻素、神经发生、神经递质、Wnt/β-catenin信号通路ExploringtheantidepressantmechanismofgastrodinbasedonWnt/β-cateninsignalingpathwayAbstractObjective:TostudythemechanismofgastrodinregulatingWnt/β-cateninsignalingpathwaytoimprovedepression-likebehaviorinducedbyCMSinmice.Methods:(1)FiftymaleC57BL/6JmicewererandomlydividedintoCtrlgroup,CMSgroup,CMS+GASgroup,CMS+IWP-2groupandCMS+ICG001groupaccordingtothesugarwaterpreferencerate.MiceinCMSgroupweresubjectedtochronicmildstressfor7weeks;MiceinCMS+GASgroupweretreatedwith50mg/kggastrodinfromweek4toweek7;MiceinCMS+IWP-2groupweretreatedwithWntblockerIWP-2whilegastrodinwasused.MiceinCMS+ICG001groupweretreatedwithβ-cateninblockerICG001whilegastrodinintervention.ToinvestigatewhethertheantidepressanteffectofgastrodinisaffectedbyWnt/β-cateninsignalingpathway.(2)Theexperimentofsugarwaterpreference,openfieldtestandtailhangingtestwereusedtodetectwhethereachgroupofmicehaddepression-likebehavior.(3)Thefrozensectionsofmousebraintissueweretreatedandstainedbyimmunohistofluorescencetechnology.BrdUwasusedtolabelproliferatingcells,whileDCXwasusedtolabelnewbornneurons,andthedistributionandquantityofthesetwotypesofcellsinthedentategyrusregionofthehippocampuswerequantitativelyanalyzed.ThedifferencesofhippocampalneurogenesisinCtrlgroup,CMSgroup,CMS+GASgroup,CMS+IWP-2groupandCMS+ICG001groupwerecompared.Iba1wasusedtolabelmicrogliaandquantifytheactivationdegreeofmicrogliainthedentategyrusregionofthehippocampustostudythedifferencesinhippocampalneuroinflammationamonggroupsofmice.(4)Neurotransmitterssuchasdopamine,norepinephrineandserotoninandinflammatoryfactorssuchasIL-6andTNF-αinthehippocampusofmiceineachgroupweremeasuredbyenzyme-linkedimmunosorbentassay.Results:(1)Thedataofsugarwaterexperimentandtailsuspensionexperimentshowedthatgastrodincouldimprovetheanhedonia,immobilelatencyandtotalimmobiletimeofCMSmice,andtheimprovementeffectofgastrodinwasinhibitedafterblockingtheWnt/β-cateninsignalingpathway,suggestingthatgastrodincouldimprovethedepressivestateofmicethroughtheWnt/β-cateninsignalingpathway.(2)Openfieldexperimentresultsshowedthatgastrodeencouldeffectivelyalleviateanxiety-likebehaviorinCMSmice,andtheeffectofalleviatinganxiety-likebehaviorwasinhibitedafterblockingWnt/β-cateninsignalingpathway,suggestingthatgastrodeencouldimproveanxiety-likebehaviorindepressedmicethroughWnt/β-cateninsignalingpathway.(3)Immunofluorescencestainingresultsshowedthat,Gastrodincanincreasethenumberofproliferativecells(BrdU+)andthenumberofnewbornneurons(DCX+)inthehippocampusofdepressedmice,anditseffectisinhibitedafterblockingtheWnt/β-cateninsignalingpathway.ItwasrevealedthatgastrodincaneffectivelyenhancetheneurogeneticpotentialofhippocampusofdepressedmicethroughWnt/β-cateninsignalingpathway.(3)TheopenfieldtestresultsshowedthatthecentralmovementtimeofmiceinCMSgroupwassignificantlyreducedcomparedwiththatinCtrlgroup(P<0.05).ComparedwithCMSgroup,thecentralmovementtimeofmiceaftergastrodininterventionwassignificantlyincreased(P<0.05).ComparedwithCMS+GASgroup,thecentralmovementtimeofIWP-2andICG001interventionmicewassignificantlyreduced(P<0.05).Theresultsshowedthatgastroelincouldeffectivelyalleviateanxiety-likebehaviorinCMSmice,andtheeffectofinhibitinganxiety-likebehaviorwasinhibitedafterblockingWnt/β-cateninsignalingpathway.(4)Theresultsofimmunofluorescencestainingshowedthatmatincouldreducetheactivationlevelofmicrogliainthehippocampusofdepressedmice,andincreasedtheactivationlevelofmicrogliaafterblockingtheWnt/β-cateninsignalingpathway.ItissuggestedthatgastrodincanreduceneuroinflammationindepressedmicethroughWnt/β-cateninsignalingpathway.(5)ELISAresultsshowedthatgastrodincouldincreasethelevelsofneurotransmitters(dopamine,norepinephrine,serotonin)anddecreasethelevelsofinflammatoryfactors(IL-6,TNF-α)inthehippocampusofdepressedmice;AfterblockingtheWnt/β-cateninsignalingpathway,thelevelsofneurotransmittersinthehippocampusofmicedecreasedandinflammatoryfactorsincreased.ItissuggestedthatgastrodincanenhanceneurotransmitteranddecreaseneuroinflammationindepressedmicethroughWnt/β-cateninsignalingpathway.Conclusion:GastrodininpromotestheproliferationanddifferentiationofCMShippocampalneuronsthroughWnt/β-cateninsignalingpathway,andimprovestheneurogeneticabilityofadulthippocampus.Theactivationofmicrogliaandtheexpressionofinflammatoryfactorsinhippocampusweredecreased,andthelevelofhippocampalneuroinflammationwasdecreased.Atthesametime,thehippocampusneurotransmitterlevelofCMSmicewasincreased,andthedepression-likebehaviorofstressedmicewasimproved.Keywords:Depression,Gastrodin,Neurogenesis,Neurotransmitters,Wnt/β-cateninsignalingpathway

前言抑郁症（Majordepressivedisorder，MDD）是目前较常见的精神疾病之一，表现为持续的抑郁状态，伴有意志消沉、睡眠障碍、兴趣丧失等，该病具有患病和复发率高等特点，除了能导致心理、社会以及生理等功能障碍之外，还存在着比较高的自杀倾向的风险，会加重患者的家庭甚至是整个社会的负担REF_Ref28773\w\h[1]。世界卫生组织预测，到2030年抑郁症将会成为全球疾病负担中的第一位REF_Ref28975\w\h[2]。《2022年中国抑郁症蓝皮书》指出，抑郁症患者占比达到3.4%，全球约有9500万人受此困扰。每年有近28万人选择自杀，其中抑郁相关自杀的比例高达40%。抑郁症发病的机制较为复杂，其在临床上表现出异质性。抑郁症的发病过程比较复杂，普遍认为其病因与遗传、社会心理学、生物化学等因素有关。现代医学普遍认为，遗传、神经递质系统、脑源性神经营养因子、神经内分泌系统活性亢进、炎症和代谢组学异常，引起抑郁症的发生REF_Ref29044\w\h[3,REF_Ref29057\w\h4]。当前的抑郁治疗药物包括单胺氧化酶抑制剂(MAOI)、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)以及三环类抗抑郁药(TCA)，它们通过调控大脑内的神经传递物质平衡以实现抗抑郁疗效。天麻（GastrodiaelataBl.）是一种植物，它属于兰科天麻属，可用于治疗抽搐、癫痫等神经系统性疾病。天麻素是天麻中的主要有效成分，用天麻素制作的天麻素注射液已经在临床上用于治疗脑血管病，其作用机制与神经保护作用有关REF_Ref29289\w\h[5]。天麻素对神经细胞修复、脑缺血损伤等具有改善作用，其作用的机制主要是抗炎、上调神经营养蛋白和调节神经递质等REF_Ref29361\w\h[6-REF_Ref29367\w\h7]。据研究表明，天麻素可通过Wnt/β-catenin信号通路抑制活化的小胶质细胞增殖与炎症反应REF_Ref29488\w\h[8]。Wnt/β-catenin信号通路是一种比较重要的整合性通路，参与多种细胞生命活动的调控，神经发育、细胞增殖和分化以及神经递质的合成和释放等REF_Ref29782\w\h[9]。该通路的异常活化与多种神经精神疾病的发生和发展密切相关REF_Ref29824\w\h[10]。本研究设计旨在利用慢性轻度不可预知应激（ChronicMildStress,CMS）方法创建一种小鼠抑郁症的实验模型。通过抑制Wnt/β-catenin信号通路来探究天麻素干预对小鼠海马神经发生水平、神经炎症水平、神经递质与炎症因子水平的影响，为进一步深入开发和利用天麻及其有效成分奠定基础。论文综述：抑郁症病理及天麻素的抗抑郁作用研究进展1抑郁症研究进展1.1抑郁症抑郁症（Majordepressivedisorder,MDD）是以明显的、持续的情绪低落以及认知功能障碍的情感类精神障碍性疾病REF_Ref30913\r\h[11]，其是一种以持续的心境低落和行为上出现异常的身心疾病，严重的抑郁症患者会出现抑郁性木僵，或会有明显的焦虑，还可能会出现妄想和幻觉等症状REF_Ref22938\r\h[12]。抑郁症发作会对人神经系统、免疫系统等产生负面效应，其具有复发率高、治愈率低等特点，该病使患者的健康受到伤害而且还给家庭和社会带来不小的负担，当前抑郁症已经成为了一个比较严重的社会和医疗问题REF_Ref27214\r\h[13]。1.2抑郁症产生的原因抑郁症的发病因素复杂，多数研究认为是由生物、社会心理、遗传等因素所致REF_Ref11892\r\h[14-REF_Ref11905\r\h16]。在遗传层面：据家系研究显示，患有抑郁症个体的家庭相较于普通家庭更具风险性，并且血缘关系与患病概率正相关。据研究表明，抑郁症相关基因是通过环境与基因之间相互作用而产生的REF_Ref12130\r\h[17]。在生物学因素上：关于抑郁症机制研究与治疗的因素，其涉及脑部生物学因素，即脑部生物学的变化，以及神经生化的变化，涵盖神经递质，如单胺类神经递质、氨基酸类及神经肽类等。在社会心理因素上：现代社会是复杂多样的，人们大都有着很大的生活压力和挫折，压抑情绪积累过多会导致心理上发生变化从而导致抑郁症发生。1.3抑郁症的发病机制1.3.1单胺类神经递质假说抑郁症是涉及多种脑区的神经环路及神经递质的疾病，其发病可能是与大脑中的神经递质系统功能紊乱有关，其中单胺类神经递质假说是抑郁症发生最为广泛的说法REF_Ref14501\r\h[18,REF_Ref14507\r\h19]。单胺假说由是于大脑中缺乏单胺类神经递质(Mono-amineneurotran-smitter)。单胺类神经递质一类由大脑和肾上腺素分泌的，包括儿茶酚胺类如去甲肾上腺素（Noradrenalin,NE）、多巴胺（Dopamine,DA）等和吲哚胺类如5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）等。抑郁症患者脑内NE的含量显著低于正常水平REF_Ref14932\r\h[20]，因此，抑郁症的发生与去甲肾上腺素（NE）水平下降有关。5-羟色胺能系统与各脑区的突触相互联系并相互影响，当机体受到外界刺激时，能使机体中枢神经系统中的5-羟色胺（5-HT）及其代谢产物的含量发生改变，从而触发一系列的情绪和生理反应，最终可能导致抑郁症的发生。REF_Ref15111\r\h[21]。抑郁症患脑内DA及其代谢产物水平明显偏低，导致患者神经可塑性受到损害，进而引发认知功能障碍，快感缺失等抑郁症状REF_Ref15183\r\h[22]。1.3.2炎症因子假说炎症反应是人体自身的一种保护机制，当人体受到外界损伤性刺激时，会出现防御反应。慢性应激会激活体内炎症反应，导致肿瘤坏死因子（Tumornecrosisfactor，TNF）、白细胞介素（Interleukin,IL）等促炎因子水平升高，影响神经元和神经细胞的结构及功能，从而出现结构功能的障碍REF_Ref15503\r\h[23]。有研究表明患有精神疾病的患者脑内的小胶质细胞有明显的激活REF_Ref15618\r\h[24]。小胶质细胞在脑内广泛分布，其在静息状态下呈分枝状，会监视着脑中的内环境并维持其稳态；激活状态的小胶质细胞的分支减少。，胞体膨胀，激活后炎性因子的释放增加，发挥了神经免疫作用。抑郁症患者与正常人相比，其体内的促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6（IL-6）等表达水平升高REF_Ref16819\r\h[25]。1.3.3神经细胞可塑性假说神经可塑性假说解释了海马体积是如何通过海马神经元的形态变化而减小的，如树突长度的缩短、棘的数量和密度的减少REF_Ref17123\r\h[26]。重度抑郁症患者的海马和前额叶皮层与正常人相比明显萎缩REF_Ref18785\r\h[27]。据尸检研究和脑影像学的资料表明，抑郁症患者的边缘部分脑区功能受到损伤和结构发生改变。脑源性神经营养因子（BDNF）是一种神经营养因子，在抑郁症的发病中发挥着至关重要的作用REF_Ref19089\r\h[28]。BDNF通过调控神经递质的释放、神经元的生长和重塑等，对神经元起到保护作用。若BDNF功能异常，则易导致抑郁症的发生REF_Ref19631\r\h[29]。1.3.4HPA轴功能亢进假说HPA轴由下丘脑、垂体和肾上腺组成的复杂系统，三者间存在直接作用和反馈相互作用。神经内分泌研究表明，HPA轴活动与抑郁症密切相关REF_Ref19709\r\h[30]。由于负反馈机制的紊乱而导致了\o"LearnmoreaboutcortisolfromScienceDirect'sAI-generatedTopicPages"大脑中皮质醇激素的积累，5-HT等多种神经递质的调控受到影响，由此而引起了抑郁症的发生。关键的是，下丘脑垂体轴负责调整身体的应对压力的能力，身体会利用刺激产生的葡萄糖化合物去启动其反馈作用以停止这种响应过程。部分患有抑郁病的人表现出高浓度的皮质酮含量及过高的HPA活性与该回馈体系的不正常运作有关联REF_Ref22939\r\h[31]。所以为了缓解这些情况已经研发出了许多种类的药用来对抗忧郁疾病如：阻断甾族化的制剂，抵消糖皮质激素的作用的产品，还有那些能阻止催乳激素释出的产品等REF_Ref23008\r\h[32]。1.4抑郁症的治疗现状1.4.1心理治疗心理治疗旨在协助患者深化对自身抑郁情绪的认知与理解，习得有效的应对策略，并改变负面的思维模式。认知行为疗法（CBT）是一种广泛应用的心理治疗方法，它可以帮助患者识别和纠正负面的思维习惯，从而塑造积极的生活态度REF_Ref7472\r\h[33]。目前有研究表明，抑郁症状的减少与自尊心的改善之间存在密切关系。各种心理治疗手段或能有效改善成年抑郁症患者自尊心低落问题。人际心理治疗有助于缓解产后抑郁症患者的抑郁症状，但适宜的干预时间在4-8周之间，也提高了对患者家属的满意度，干预时间越长，对家属的满意度越高REF_Ref7544\r\h[34]。通过连续的心理治疗，患者可以逐渐学会应对抑郁情绪，增强内心的力量，从而走出抑郁症的困境。1.4.2物理治疗当前，抑郁症治疗的物理方法包括电休克治疗法（ECT）、重复经颅磁刺激（rTMS）和经颅电刺激（TES）等。其中，ECT被认为是一种有效的抑郁症治疗方案，其优势在于起效快，然而也存在一些潜在的风险，例如可能造成患者的短期内记忆丧失或者方向感缺失，甚至引起发向前及后向遗忘等症状。相较于ECT，rTMS的安全风险更低，副作用更小REF_Ref7616\r\h[35]。rTMS的主要并发症状仍然包含局部不适、轻微头痛和治疗后的疲劳，不过这些不良反应通常较为轻微。总体而言，rTMS治疗抑郁症是普遍有效的、安全的。1.4.3药物治疗抗抑郁药物属于精神类药物。其只能使有抑郁症状的患者症状消除，并不能提高健康人群的情绪。抗抑郁药物主要包括传统抗抑郁药物和新型抗抑郁药物。其中，传统抗抑郁药物包括三环类抗抑郁药、四环类抗抑郁药以及选择性五羟色胺再摄取抑制剂等。而新型抗抑郁药物则涵盖了多种药物类型。传统的抗抑郁药物除了单胺氧化酶抑制剂外其余都为只是作为二线药物，五羟色胺再摄取抑制剂、其他递质机制的新型抗抑郁药物以及三环类抗抑郁药均可作为一线抗抑郁药物。2天麻的化学成分及抗抑郁作用研究进展2.1天麻天麻（GastrodiaelataBl.）是一种兰科草本植物，其药用价值在《神农本草经》中已有记载，拥有悠久药用历史。天麻主要作用于肝经，具有惊痫抽搐、肢体麻木、风湿麻痹等功效。现代的药理学研究证明天麻可以预防老年痴呆和抗衰老等作用REF_Ref9683\r\h[36,REF_Ref9686\r\h37]。天麻主要分布在云南、贵州、四川等地，其具有药食同源等特点。2.1.1天麻的化学成分目前，已从天麻中分离出酚类、多糖类、甾醇和有机酸等200多种天然化合物。其中，酚类是天麻的主要活性成分，主要包括天麻素、香草醛、天麻苷元等。例如其多种糖类有甘露糖、木糖、天麻多糖以及阿拉伯糖，其中最为常见的是天麻多糖。甾体及有机酸类主要为枸橼酸、β-豆甾醇、棕榈酸以及柠檬酸等类。其中柠檬酸对肝脏组织有一定的保护作用，对神经系统也有一定的作用REF_Ref12076\r\h[38]。2.2天麻抗抑郁作用研究进展目前关于天麻抗抑郁作用的具体机制尚明确，但也有一些研究认为，天麻可能通过多种途径发挥抗抑郁作用。其中包括（1）调节神经递质：天麻中的活性成分可能会影响多巴胺、5-羟色胺等神经递质的水平，从而改善抑郁症状；（2）抗氧化作用：天麻中的抗氧化成分可能对抑郁症起到一定的保护作用；（3）抗炎作用：研究表明，炎症反应与抑郁症的发生存在紧密关联，而天麻可能通过抑制炎症反应发挥减轻抑郁症状的作用REF_Ref12413\r\h[39]。3天麻素的抗抑郁作用研究进展3.1天麻素的抗抑郁作用天麻素在药理学上有抗抑郁、抗癫痛、镇定和助眠的功效，而且无害，能迅速被胃肠道吸收，在肾脏积聚较多，并主要通过尿液排泄REF_Ref14261\r\h[40]。天麻素在天然抗抑郁药物开发中具有广阔的前景。天麻的主要有效成分之一是天麻素，药代动力学研究显示，服用后1小时，天麻素可在肠道快速吸收，平均的绝对生物利用率可高达33%。此外，天麻素除了在脏腑中有分布外，它还可透过血脑屏障，直接作用于大脑REF_Ref14405\r\h[41]。实验研究发现，天麻素对多种抑郁症动物模型（如创伤后应激障碍、慢性不可预测应激、LPS诱导的神经炎症模型等）均有较好的抗抑郁效果REF_Ref17638\r\h[42]。3.2天麻素抗抑郁作用机制的研究进展3.2.1天麻素对神经递质的影响对偏头痛的研究揭示了天麻素能够降低血液中的5-HT含量，并通过阻止由5-HT引发的血管收缩来防止次级颅外血管扩大，从而提升脑组织的5-HT表现，进而减轻病患的痛苦REF_Ref17781\r\h[43]。天麻素能使大脑皮质的活跃和抑制状态保持平衡，而这种稳定性的调节则与其内在的去甲肾上腺素减弱相关联；同时，天麻素还能阻断去甲肾上腺素神经末端重新吸收去甲肾上腺素。天麻素能抑制帕金森病模型小鼠脑组织中多巴胺能神经元的凋亡REF_Ref17873\r\h[44]。

3.2.2天麻素对氧化应激的影响氧化应激（OxidativeStress，OS）是是生物体的防御反应之一，当其受到有毒因素的影响后，高活性的分子如活性氧会大量生成，这可能使身体的氧化状态超出正常范围并破坏了氧化物消除的能力，从而引发氧化和抗氧化体系的不平衡。研究者们普遍相信，这种现象对抑郁症的发生有着关键的作用：由于神经系统的氧化应激水平上升，可能会引起脂肪酸过度氧化，并且增加了细胞中的基因和蛋白质等的损害，这对神经元的功能造成负面影响，进而导致神经元退化、死亡或神经元灵活度的变化。天麻素可通过清除自由基和增加抗氧化酶活性等多种途径抑制氧化应激过程REF_Ref17974\r\h[45,REF_Ref17977\r\h46]。研究揭示，天麻素具有调整氧/还原平衡的功能，可以降低细胞内的过氧化物含量，进而缓解由氧化压力引发的细胞伤害REF_Ref18157\r\h[47]。3.2.3天麻素对神经炎症的影响研究发现，随着年龄的增长，大脑会处于一种较低级的免疫系统环境中。在这个过程中，身体中的微型防御者——即星形胶质细胞也会经历老化并且不断增加数量，这导致了大量促进发炎物质生成，比如致瘤性的TNF-α及淋巴球刺激蛋白等，这些化学物能引发对人体有害的中枢神经系统的慢性感染与损伤现象REF_Ref18232\r\h[48,REF_Ref18239\r\h49]。而其中的一种主要的天麻提取物的有效成份就是“天麻素”它被证实可以抵抗自由基引起的过量压力损害同时也可以对抗各种形式的疾病包括一些常见的病症例如肺炎等等REF_Ref18585\r\h[50]。此外还有实验显示其有能力减缓由LPS（Lipopolysaccharide）所触发的巨噬细胞的一氧化氮合成酶iNOS的活性和COX-2的活动度以减少那些可能造成伤害的有害分子释放出来进而减轻身体的负担。另外一项重要的观察结果是：这种药剂还具备阻断某些涉及到疾病的基因转录的能力特别是NF-κB这个关键路径上的调控作用使得该药物更具治疗潜力此外，天麻素还可以调节神经递质的释放，对神经元的兴奋性有调节作用，从而减轻神经炎症引起的疼痛和痉挛等症状REF_Ref18715\r\h[51]。3.2.4天麻素对神经发生的影响对于西医学来说，已经深入探究了天麻素的主要药物成分的天麻素的功效与特性。其中包括保持海马体中的星形胶质细胞活力、抗炎反应路径的调节、增强海马体的神经生成能力并维护神经干细胞的功能REF_Ref18820\r\h[52]。天麻素可以通过抑制细胞凋亡、减轻兴奋性氨基酸的毒性作用以及促进神经细胞再生等途径，发挥其神经保护作用。另外，天麻素还可以通过抑制过度神经元兴奋、减少炎症反应以及改善脑缺血再灌注损伤等机制来缓解神经系统损伤，证实天麻素对神经发生（Neurogenesis）具有促进作用REF_Ref18875\r\h[53]。3.2.5天麻素对HPA轴的影响天麻素可以促进下丘脑合成和释放促肾上腺皮质激素释放激素（Corticotropinreleasinghormone，CRH），从而增加HPA轴的活性；该过程可促进垂体合成与释放促肾上腺皮质激素（ACTH），而ACTH作为HPA轴关键激素，有助于刺激肾上腺皮质合成与释放皮质醇，因此，天麻素极有可能通过干预垂体中ACTH的释放，来调控HPA轴的活性来调节肾上腺皮质激素的合成与释放。具体机制可能与天麻素对催化酶的调节作用有关，影响维持皮质醇合成和释放的关键酶活性REF_Ref19062\r\h[54]。3.2.6天麻素对Wnt/β-catenin信号通路的调节作用Wnt/β-catenin信号通路是一种关键的细胞信号转导机制，广泛参与多种生物学过程的调控，涵盖细胞增殖、分化、存活以及细胞极性等多个方面REF_Ref19248\r\h[55]。Wnt蛋白与细胞表面受体结合后，会触发信号通路，导致β-catenin蛋白在细胞质中积累并进入细胞核，与转录因子结合，从而促进特定基因的转录REF_Ref19352\r\h[56]。据研究表明，天麻素通过激活Wnt/β-catenin信号通路，抑制认知障碍模型大鼠小胶质细胞的激活，发挥抗增殖、抗炎症等作用。此外，天麻素还能够提高Wnt3a、β-catenin和糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的表达水平，从而发挥神经保护作用，改善大鼠认知能力和记忆能力REF_Ref23144\r\h[57REF_Ref23147\r\h,58]。4总结与展望抑郁症是普遍的精神健康问题之一，其主要特征包括持续性的情绪压抑感并伴有意志力减弱、思考缓慢、语言表达能力下降及失眠等症状。抑郁症产生原因主要是由于遗传生物社会心理共同作用的结果，发病机制主要为缺乏单胺类神经递质、产生炎症反应等。HPA轴过度活跃等。现在，治疗抑郁症的方法主要有：心理治疗、物理治疗和药物治疗。天麻素具有抗癫痛，镇定和助眠等功效，对于抑郁症有改善作用。其改善善抑郁症的作用机制为：提高抑郁患者的神经递质（5-HT、DA、NE）、抑制氧化应激过程、减少神经炎症的产生等。Wnt/β-catenin信号通路可以影响细胞增殖、分化和细胞极性等重要功能。有些研究显示，天麻素可以通过这个通路抑制肿瘤细胞的增殖和转移，同时促进神经干细胞的增殖和分化。目前对于天麻素通过Wnt/β-catenin信号通路的一些作用研究相对有限，但是天麻素作为一种天然药物，具有潜在的抗抑郁作用，其通过调节Wnt/β-catenin信号通路可能成为未来抑郁症治疗的一个新的研究方向。

实验研究：基于Wnt/β-catenin信号通路探讨天麻素的抗抑郁作用机制1.材料1.1实验动物选取8周龄C57BL/6J雄性小鼠，购买自长沙天勤生物技术有限公司。在实验开始前适应性喂养小鼠一周，期间提供22-26℃的温度和60-70％的湿度条件，在实验阶段提供小鼠正常的饲料和饮用水。本实验流程及操作均以获得贵州中医药大学伦理委员会批审与授权（No.20220137）。1.2实验仪器与设备表1仪器仪器型号品牌倒置荧光显微镜IX73日本Olympus公司恒温水浴锅HH-2国华电器脱色摇床TS-2江苏其林贝尔公司冷冻切片机CM1950德国Lecia公司电子分析天平EL104梅特勒-托利公司1.3实验试剂表2实验所需试剂试剂品牌DAPI染色液碧云天驴血清武汉博士德生物科技有限公司抗荧光衰减封片剂武汉博士德生物科技有限公司4%多聚甲醛固定液武汉博士德生物科技有限公司无菌PBS缓冲液武汉博士德生物科技有限公司浓盐酸溶液陶素生化0.5%TritonX-100Solarbio大鼠抗BrdU抗体Abcam兔抗DCX抗体CellSignalingTechnology兔抗NeuN抗体CellSignalingTechnology

续表：实验所需试剂试剂品牌兔抗Iba1抗体AbcamDonkeyAnti-RabbitIgG-Cy3AbsinDonkeyAnti-RabbitIgGH&LAbcamDonkeyAnti-RatIgGH&LAbcamNE小鼠Elisa试剂盒南京建成生物工程研究所有限公司5-HT小鼠Elisa试剂盒南京建成生物工程研究所有限公司DA小鼠Elisa试剂盒南京建成生物工程研究所有限公司IL-6小鼠Elisa试剂盒武汉博士德生物工程有限公司TNF-α小鼠Elisa试剂盒武汉博士德生物工程有限公司ICG001MCEIWP-2MCE2方法2.1慢性温和不可预测模型的建立选择50只C57BL/6J雄性小鼠，将其置于新的环境中1周后进行试验，并将其按照体重随机分为Ctrl组、CMS组、CMS+GAS组、CMS+ICG001组、CMS+IWP-2组，每组各10只。慢性温和不可预知刺激模（Chronicmildstress，CMS）是用于模拟人类在日常生活中受到的不可预知压力的模型，常应用于抑郁模型的构建。为了建立CMS小鼠模型，在小鼠进入实验室时适应性喂养1周，并将每只小鼠单独饲养在笼子中。造模方式包括24小时昼夜颠倒、12小时彩灯频闪、气味刺激、10分钟夹尾、2小时束缚、30分钟摇鼠笼、24小时倾斜鼠笼、24小时潮湿垫料、24小时空笼子以及12小时食物剥夺、6小时水剥夺，从以上造模方式中随机选择2-3种方式进行刺激，避免小鼠提前适应应激，在3天内的同一时间不重复同一种刺激，持续应激4周。2.2行为学检测2.2.1糖水偏好测试糖水偏好测试实验（SPT）是一种利用小鼠对甜味的爱好所设立的实验方法。在小鼠禁水静食一段时间后，同时两瓶同样外形和差不多体积的纯水和1%蔗糖水，本实验主要是以小鼠的糖水偏好度来检测其是否出现快感缺失。在开始造模之前，需要先测试小鼠对1%糖水的偏好。为此给小鼠提供1瓶1%的蔗糖水和1瓶清水，让小鼠适应含糖饮水。在试验前分别喂养小鼠糖水和清水，让小鼠适应24小时。适应性喂养结束后，会让小鼠在12小时内不进食和饮水，然后再给每只小鼠1瓶1%的糖水和1瓶清水。这次，我们会把糖水瓶和清水瓶的位置和适应性喂养时相反，并保证2个瓶子的外观和材质相同。此外，放置前需要称定水瓶的质量。2小时后观察并记录小鼠对清水和蔗糖水的摄入量。根据糖水偏好率的计算公式计算出小鼠的糖水偏好率（糖水偏好率=糖水消耗量/(糖水消耗量+清水消耗量)×100%）2.2.2悬尾实验悬尾实验（TailSuspensionTest，TST）的具体操作步骤为：首先将小鼠的尾巴固定在悬挂架上，让其倒置过来使小鼠的鼻尖距离地面25厘米高处悬挂，并开始计时6分钟，在这6分钟内，会用摄像机记录下小鼠处于环境中产生的绝望不动时间，分析悬尾后第2-6min的累计不动的时间(判定标准为动物放弃主动挣扎，处于完全不动的状态)，并排除小鼠攀爬尾巴的实验数据。2.2.3旷场实验旷场实验(OpenFieldTest，OFT)，将小鼠放置于空旷的大箱子中自由活动3min适应环境。将活动后的实验小鼠背向实验者迅速放置到旷场中心，同时录制小鼠进入旷场后的行动轨迹，旷场实验全程记。时间为5min。在此时间所用于旷场实验的计算机能够记录下小鼠的中央运动距离、单位时间内小鼠在1中央区域的停留时间、站立次数、沿边运动距离等参数。待小鼠检测时间结束后将该鼠取回放到对应笼子中，在换下一只小鼠进行实验前，应用卫生纸将旷场内清洁干净，后用酒精喷洒旷场以除去残留的气味。2.2.4免疫组织荧光染色在免疫荧光实验开始前，使用冰冻切片机将小鼠完整的脑组织切割成25μm的薄片，当切割的小鼠脑片开始出现海马冠状面时就开始收集脑片，并将其放入含有PBS的12孔板中（每孔大约收集15片）。接下来采用漂染法进行免疫荧光染色。挑取完整的小鼠海马冠状脑片：（1）脑片置于1mol/LHCL中37℃孵育30min，PBS漂洗3次。（2）硼酸盐缓冲液浸泡2轮，每轮振摇10min，PBS清洗3次。（3）TritonX-100通透清洗，PBS清洗3次。（4）PBS配置的驴血清封闭脑片，孵育一抗，4℃孵育过夜。（5）脑片摇床震摇复温，PBS清洗3次。（6）加入二抗避光孵育，PBS清洗3次。（7）最后DAPI着色细胞核。摇床振摇8min，用PBS清洗3次，每次振摇5min。（8）以上步骤染色完成，开始在避光环境下进行铺片，最后用荧光显微镜观察切片，记录不同荧光下的图像。2.2.5酶联免疫吸附测定酶联免疫吸附法（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA）是基于抗原抗体反应，将准备好的蛋白按照Elisa试剂盒进行测定。NE、DA、5-HT根据竞争法实验步骤，根据实验说明书配制标准品，在450nm吸光度下测量各孔的吸光度，根据浓度、吸光度曲线算出标准曲线回归方程，根据回归方程计算出NE、DA、5-HT浓度；IL-6和TNF-α采用夹心法实验步骤，根据试剂盒说明说完成。2.2.6数据统计与分析数据采用Excel2010进行整理，SPSS17.0进行统计分析，GraphPadPrism8.0作图，平均数±标准误（x±sem）表示。多组之间的比较采用单因素方差分析（one-wayANOVAcombinedwithTukey）和双因素方差分析（Two-wayANOVAcombinedwithTukey），P<0.05表示统计学有显著差异。3实验结果3.1阻断Wnt/β-catenin信号通路后天麻素对CMS小鼠行为的影响3.1.1阻断Wnt/β-catenin信号通路后天麻素对CMS小鼠糖水偏好的影响本实验主要评估各组小鼠在第0周、第4周和第7周时的糖水偏好率。如图1C所示，在第0周时各组小鼠的糖水偏好率均无明显差异（P＞0.05）；第4周，与Ctrl组相比，CMS组糖水偏好率显著降低（P＜0.05），与CMS组相比，CMS+GAS组、CMA+IWP-2组和CMS+ICG001组无显著差异（P＞0.05），结果提示实验的慢性温和不可预见性模型建立成功；第7周，与Ctrl组相比，CMS组的糖水偏好率明显降低（P<0.05）；与CMS组相比，CMS＋GAS组的糖水偏好率明显升高（P<0.05）；与CMS＋GAS组相比，CMS+ICG001组和CMS+IWP-2组的糖水偏好率明显降低（P<0.05）。从第七周的糖水偏好率统计图结果可以看出天麻素可以改善抑郁小鼠的快感缺失。阻断Wnt/β-catenin信号通路后天麻素改善的快感缺失受到抑制。如图1中的E、F所示，与Ctrl组相比，CMS组小鼠不动潜伏期降低、一动不动时间增加（P<0.05）；GAS干预后，潜伏期增加、一动不动时间降低（P<0.05）；CMS+GAS组经IWP-2和ICG001干预后，潜伏期降低、一动不动时间增加（P<0.05）。表明天麻素可以改善抑郁小鼠的行为绝望，阻断Wnt/β-catenin信号通路后改善状态受抑。以上结果提示天麻素可通过Wnt/β-catenin信号通路改善小鼠抑郁样行为。图1阻断Wnt/β-catenin信号通路后天麻素对小鼠抑郁样行为的影响注：图A，糖水偏好实验的示意图；B，糖水偏好率实验统的计图，C悬尾实验示意图；D悬尾不动潜伏期统计图；F悬尾一动不动总时间统计图。数据显示为Mean±SEM（n=10），与Ctrl组比较，*表示：P＜0.05，***表示P＜0.001；与CMS组相比，##表示：P＜0.01；与CMS+GAS组相比，&表示：P＜0.05。3.1.2阻断Wnt/β-catenin信号通路后天麻素对CMS小鼠焦虑样行为的影响图2B所示，旷场实验中各组的运动距离均无显著差异（P＞0.05），所以CMS和药物干预不影响小鼠正常的运动功能。如图2C所示，与Ctrl组相比，CMS组的中心运动时间减少（P＜0.05）；与CMS组相比，CMS+GAS组的中心运动时间增多（P＜0.05）；与CMS+GAS组相比，CMS+IWP-2组和CMS+ICG001组的中心运动时间减少（P＜0.05）；结果提示给与GAS有效增加小鼠的中心探索时间，阻断Wnt/β-catenin信号通路后小鼠的中心探索时间减少，说明GAS有效缓解焦虑样行为，阻断Wnt/β-catenin信号通路后缓解焦虑样行为的效果被抑制。图2阻断Wnt/β-catenin信号通路后天麻素对小鼠焦虑样行为的影响注：图A为小鼠旷场轨迹运动热图，图B为小鼠旷场实验中的运动距离统计图，图C为小鼠在旷场实验中6分钟内在边缘区域和中心区域停留时间的统计图。数据显示为Mean±SEM（n=10），与ctrl组比较，**表示：P＜0.01；与CMS组相比，#表示：P＜0.05；与CMS+GAS组相比，&&表示：P＜0.01，&&&表示：P＜0.001。CBA3.2阻断Wnt/β-catenin信号通路后天麻素对CMS小鼠神经发生水平的影响CBA3.2.1阻断Wnt/β-catenin信号通路后天麻素对CMS小鼠神经干细胞增殖作用如图3B所示，与Ctrl组相比，CMS组的BrdU+标记细胞数量显著降低（P＜0.05）；与CMS组相比，CMS＋GAS组小鼠海马中的BrdU+标记细胞数量显著增多（P＜0.05）；与CMS＋GAS组相比，CMS+ICG001和CMS+IWP-2组小鼠海马中的BrdU+标记细胞数量显著减少（P＜0.05）；以上结果提示，A天麻素可以通过Wnt/β-catenin信号通路增加抑郁小鼠海马区的细胞数量。A图3阻断Wnt/β-catenin信号通路后天麻素对BrdU+的影响注：如图左表示增殖神经元（Brdu）染色图，右下角表示Brdu统计图；数据显示为Mean±SEM（n=10），与ctrl组比较，*表示：P＜0.05；与CMS组相比，#表示：P＜0.05；与CMS+GAS组相比，&表示：P＜0.05。3.2.2阻断Wnt/β-catenin信号通路后天麻素对CMS小鼠新生神经元的影响DCX标记未成熟神经元。如图4B所示，与Ctrl组相比，CMS组小鼠海马区DCX+的细胞数量显著降低（P＜0.05）；与CMS组相比，CMS＋GAS组小鼠海马区的DCX+细胞的数量显著增加（P＜0.05）；与CMS＋GAS组相比，CMS＋IWP-2组和CMS＋ICG001组小鼠海马区DCX+的细胞数量显著降低（P＜0.05）（图4B）；以上结果显示，给予天麻素的抑郁小鼠海马区未成熟神经元数量显著增多，阻断Wnt/β-catenin信号通路后小鼠海马区未成熟神经元数量显著减少，这提示我们天麻素可以通过Wnt/β-catenin信号通路增加抑郁小鼠海马区的未成熟神经元数量。图4阻断Wnt/β-catenin信号通路后天麻素对DCX+的影响注：如图，左表示未成熟神经元（DCX）染色图，右下角为DCX+的统计图。数据显示为Mean±SEM（n=10），与ctrl组比较，**表示：P＜0.01；与CMS组相比，#表示：P＜0.05；与CMS+GAS组相比，&表示：P＜0.05，&&表示：P＜0.01。3.3阻断Wnt/β-catenin信号通路后天麻素对CMS小鼠小胶质细胞活化水平的影响图5A表示小胶质细胞染色图，B为Iba1+细胞面积统计图，C为Iba1+细胞分支数统计图。与Ctrl组相比，CMS组Iba1+细胞面积显著增大（P＜0.05）；与CMS组相比，CMS+GAS组Iba1+细胞面积显著减小（P＜0.05）；与CMS+