微生物的分离鉴定与计数含解析

微生物的分离鉴定与计数

・、微生物的分离与鉴定

IS知识分析总结归纳素养对接

1.分离微生物的原理与措施

(1)原理：自然环境中的微生物是混杂在一起的，因此分离获得纯培养物应首先采用的

方法是将单个的微生物与其他微生物分离，再给该微生物提供合适的营养和条件，使其生长

成为可见的群体。

(2)常用措施:

①接种过程中尽量使微生物分散开来，如平板划线法、稀释涂布平板法。

②运用选择培养基的作用特点，在培养基中添加某种特定的物质，抑制不需要的微生物

的生长，促进所需微生物的生长。

2.选择培养基四种常见制备方法或熨例

；依据某些微生物对某些物质的抗

原”］性.在培养基中加入某些物质.以

f「抑制”不需要的微生物.••促进”所

［需要的微生物生长

黔等鲁|培养基中加入高浓度食盐时可抑

法

打/E物网一制多种细菌的生长.但不影响金

厂:黄色葡萄球菌的生长.从而可将

i举例I该菌分离出来

在培养基中加入青霉索时可抑制

二细菌、放线菌的生长,从而分离得

到醉母菌和霉菌

培养基中缺乏氮源时，可分离I'I生

广固氮微生物.非自生固氮微生物因

A改交培格基।

法缺乏氮源而无法生存

代券成分.

二

培养基中若缺乏有机碳源则一养微

.生物无法生存.而自养微生物可利用

空气中的C()2制造行机物而生存

当石油是唯一碳源时,可抵制不

方利川培祢居的

法能利用石油的微生物的生长,使

.,特定化学成分”

三能够利用石油的微生物生存，从而

分离

分离出能消除石油污染的微生物

缶:5盐环境中可分离耐盐菌.J!：他菌

方通过某些「作盐浓吱局时易失水而不能生存:

法

四•,特殊环境”在高温环境中可分离得到耐高温的

分离喂牛物I卜

微生物.其他微生物在高温环境中

因酶失活而无法生存

【典例1]（2019•全国卷II）物质W是一种含氮有机物，会污染土壤。W在培养基中

达到一定量时培养基表现为不透明。某研究小组欲从土壤中筛选出能降解■.的细菌（目标菌）。

回答下列问题。

（1）要从土壤中分离目标菌，所用选择培养基中的氮源应该是。

（2）在从土壤中分离目标菌的过程中，发现培养基上甲、乙两种细菌都能生长并形成菌

落（如图所示）。如果要得到目标菌，应该选择菌落进一步纯化，选择的依据是

（3）土壤中的某些微生物可以利用空气中的氮气作为氮源。若要设计实验进一步确定甲、

乙菌能否利用空气中的氮气作为氮源，请简要写出实验思路、预期结果和结论，即

（4）该小组将人工合成的一段DNA转入大肠杆菌，使大肠杆菌产生能降解W的酶（酶E）。

为了比较酶E与天然酶降解W能力的差异，该小组拟进行如下实验，请完善相关内容。

①在含有一定浓度W的固体培养基上，A处滴加含有酷E的缓冲液，B处滴加含有相同

浓度天然酶的缓冲液，C处滴加,三处滴加量相同。

②一段时间后，测量透明圈的直径。若C处没有出现透明圈，说明

若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明—

解析：（I）该研究小组的目标菌是能够降解物质W的细菌，而物质W是一种含氮有机物,

故可作筛选培养基中的氮源。（2）研究小组的目标菌，是能够降解物质W的细菌，培养基中乙

菌落的周围出现透明圈，说明乙菌落能够降解物质W,故乙菌落为该小组的目标细菌。（3）目

标菌能够利用空气中的氮气作为氮源，故选用的筛选培养基不添加氮源，能够在无氮源的培

养基上生存的细菌便是目的细菌，故实验操作为：将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，

若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源。(4)①C处作为空白对照，要排

除作为溶剂的缓冲液对实验可能造成的影响，故需要在C处滴加缓冲液，且保持滴加量相同:

②培养基中的透明圈表示物质W被降解的情况，若C处不出现透明圈，则说明缓冲液不能降

解物质肌若A、B处形成的透明圈直径大小相近，说明物质W被降解的程度相近，即前E与

天然酶降解物质W的能力相近。

答案：(DW

(2)乙乙菌落周围出现透明圈，说明乙菌能降解卡

(3)将甲、乙菌分别接种在无氮源培养基上，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气

中的氮气作为氮源

(4)①缓冲液②缓冲液不能降解W酹E与天然怅降解W的能力相近

I—归纳点拨强化要点名师解惑

选择培养基的设计方法

(1)营养缺陷型选择培养基：通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷型微生物不能正

常生长。

(2)添加抑菌物质的选择培养基：在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学

物质对非目的微生物产生的抑制作用选择目的菌。

(3)特殊培养条件的选择培养基：改变微生物的培养条件(如高温、特殊pH等)。

I一挑战提升迁移应用能力提升

(2020•周口质检)烧伤病人容易感染绿脓杆菌，引远化脓性感染。比阿培南、美罗培南、

头狗菌素和碳青霉烯类抗生素都是非常经典的抗绿脓杆菌的药物。临床使用时，有时需要做

细菌耐药实验。实验时，从病人身上获取少量样本，按下列一定的实验步骤操作，以确定病

人体内的绿脓杆菌对不同抗生素的敏感性。

(1)获取绿脓杆菌单菌落。

①配制培养基。主要步骤是计算一称量一溶化一一分装一倒平板。

②图2所示接种方法为法，这种方法的主要目的是使接种物_______o图

1的操作中，第一次划线前灼烧接种环的目的是防止杂菌污染，第二次及之后的几次划线前灼

烧接种环的目的是

在图2所示操作前，需要随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间，这样做的目

的是

(2)检测绿脓杆菌对不同抗生素的敏感度。

绿脓杆菌对不同抗生素的敏感度的对比、对照实验结果如图3所示：在恒温箱培养3天

后，培养基上有绿脓杆菌滋生，且除浸有无菌水的圆纸片外，其他浸有美罗培南、比阿培南、

头抱菌素或碳青霉烯类抗生素的圆纸片周围都出现了抑菌环。

图।图2

卜美岁培南

卜比阿培南

上碳方用爆类

阳脓杆菌

卜头抱菌素

卜无曲水

图3

如果你是医生，建议患者最好选用________抗生素，判断的理由是

(3)菌种保藏

将分离纯化后的菌株接种到____________上，在适宜条件下培养。当菌落长成后，将试

管置于4c冰箱中保藏待用。

(4)常采用法统计活菌数目，直接从静置的培养液中取样计数的做法是错

误的，正确的操作是______________________

答案：(1)①调pH和灭菌②平板划线逐步稀释］以便获得单个菌落)杀死上次划线

后接种环上残留的菌种(使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端)检

测培养基平板灭菌是否合格

(2)美罗培南抑菌圈最大，说明对绿脓杆菌的杀伤效果最好

(3)固体斜面培养基

(4)稀释涂布平板法将培养液摇匀后取样计数

二、微生物的计数

IS知识分析总结归纳素养对接

1.间接计数法(活菌计数法)一一稀释涂布平板法

(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液

中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少个活菌。

(2)操作：①设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释,

选择三个稀释度的菌液，分别取0.1mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液

涂布于整个平板表面，放在适宜的温度下培养，计算菌落数。为使结果接近真实值，可将同

一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上，经涂布、培养，计算出菌落平均数。

②为了保证结果准确，一般选择菌落数为30〜300个的平板进行计数，若设置的重复组

中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。

③计算公式：每克样品中的细菌数=(。。＞＜以其中。代表某一稀释度下平板上生长的

平均菌落数，，代表涂布平板时所用的稀释液的体积GnL),M代表稀释倍数。

2.显微镜直接计数法

(1)原理：利用特定细菌计数板或血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生

物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定面积(Imn?)

和高(0.1mm)的计数室，在1mm?的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步

划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成的。

(2)操作：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再将稀释的样品滴在计数板上，稍等

片刻，待细菌全部沉降到计数室底部再在显微镜下统计4〜5个中格中的细菌数，并求出每个

小格所含细菌的平均数，再按公式求出每电升样品中所含的细菌数。

(3)计算公式：每亳升原液所含细菌数=每小格平均细菌数X400X10000X稀释倍

数。

3.滤膜法

以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例，将已知体积的水过滤后，将滤膜放于伊红美蓝培

养基上培养，在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色，可根据培养基上黑色菌落的数目，

计算出水样中大肠杆菌的数最。

【典例2](2020•清远期末)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流

水样中的细菌含量，并进行了细菌分离和培养等工作。回答下列问题：

(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。为了检测培养基平板灭菌是否合

格，可在涂布接种前，______________________

然后，将1mL水样稀释1000倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1mL稀释液；经

适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37,据此可得出每升水样中的活菌数为

(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过____________灭菌,

为了将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落，在第二次及以后的划线时，一定要

示意图A和B中，表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。通常,

对获得的纯菌种可以依据

对细菌进行初步的鉴定和分类。

(3)该小组将得到的南株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分

进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：

振荡培养能提高培养液中的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高

的利用率。

解析：(1)为了确定培养基的灭菌是否合格，可以随机取若干灭菌后的空白平板培养一

段时间，观察培养基上是否有菌落生成。由题意知1mL水样中的菌落数是(39+38+

37)4-34-0.1X1000=3.8X105,每升水样中的活菌数为3.8X10叹1(1=3.8X10)(2)接种

环用灼烧法进行灭菌。在第二次及以后划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做

的目的是：通过划线次数的增加，将聚集的菌体逐渐稀释分散，使每次划线时菌体的数目逐

渐减少，以便获得由单个细胞繁殖而来的单个菌落。图A是用平板划线法接种培养后得到的

结果，图B表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。可以依据菌落的形状、大小

等特征对细菌进行初步的鉴定和分类。(3)振荡培养可以增加液体培养基的氧气含量，促进好

氧型微生物的生长；同时还能使菌体与培养液充分接触，提高营养物质的利用率。

答案：(1)随机取若干灭菌后的空白平板先行培养一段时间3.8X10"

(2)灼烧从上一次划线的末端开始划线B菌落的形状、大小等菌落特征

(3)溶解氧营养物质

IS归纳点拨强化要点名师解惑

用稀释涂布平板法计数微生物时，要求选择菌落数在30〜300的平板进行计数。解题时

易出现以下误解：

(1)只得到1个菌落数在30〜300的平板是错误的。错误的原因是不符合实验的重复原

则，易受到偶发因素的影响。

(2)得到3个或3个以上菌落数在30〜300的平板，也不一定正确，这可能有两种情况:

①不同平板间差异较大，如得到3个平板，菌落数分别为230、34、240,虽然菌落数均

在“30〜300”之间,这也是不正确的，因为“34”与“230”“240”差异太大,应重新实验

找出原因。

②不同平板之间差异不大，是符合要求的，用其平均值作为估算的最终结果。

I后挑战提升迁移应用能力提升

(2020•安顺模拟)牛奶是微生物培养的良好培养基，牛奶在饮用前都要经过巴氏消毒，

以杀死有害微生物，为检测消毒前后牛奶中细菌含量变化情况，做如图1所示操作。用无菌

吸管从锥形瓶中吸取1mL生牛奶稀释液至盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀，如此再重

复2次。请回答下列有关问题：

1mLImL1mL0.1mL

90inL无菌水+9mL9mL9mL

10ml,生牛奶无菌水无菌水无赭水

(1)巴氏消毒的方法是

使用这种方法对生鲜牛奶进行消毒的好处是

(2)取最终的牛奶稀释液0.1mL滴在培养基上进行涂布，应选择的涂布工具是图2中的

XI//

AR(：I)

(3)图1中所示方法为稀释涂布平板法,理想情况下,

培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。若用该方法培养设置了3个培养皿，