微生物基因组无痕敲除技术介绍

微生物基因组无痕敲除技术介绍

有痕敲除&无痕敲除

基因敲除是一种常见的生物工程技术，可用于微生物基因组改造。有痕敲除的含义是

每次敲除基因后都会在基因组中引入一个筛选标记。一方面，当进行连续敲除时，多种抗

性标记在同一株菌体中堆叠，使得后面抗体标记的选捧越来越困难。另一方面,抗体基因

的插入可能会影响上下游基因的表达。因此,无痕(markerless/scarless)敲除越来越受

到追捧,成为人们研究的重点。

无痕敲除技术

1同源重组

同源重组技术包括RecA和Red重组系统，Red系统具有明显的优势，包括同源臂较

短，重组率较高等，被广泛用于大肠杆菌的基因组编辑。然后Red系统存在外源片段残留

的情况，比如残留一个FRT重组酶作用位点。研究人员通过持续的研究，对该系统进行了

持续的优化和改进，并开发出了无痕敲除技术，方便进行连续多个基因的敲除操作。下面

我们将对这些优化策略进行解读。

1.1环状质粒型同源重组载体

环状质粒载体是实现大肠杆菌基因敲除的经典策略，依靠的是RecA重组系究

RecA系统主要包括RecA、RecBCD、RuvA、RuvB、RuvC等。RecA具有与重组相关

的活性,RecBCD可降解线性DNA片段，通过Chi序列识别靶位点，形成单链区域，然

后再RecFOR、RecQ、RuvABC.SSB等蛋白共同作用下由RecA进行同源重组。应用

此类载体进行的基因敲除可分为2种类型,一种是通过同源单交换的插入型敲除，另一种

是通过同源双交换的置换型敲除，后者可实现目标基因无痕敲除，但是第二步同源交换的

效率较低。

1.2线性双链DNA型同源重组载体

该载体依据Red重组系统。线性载体直接利用PCR的方法获得带有与靶基因同源的

DNA片段和抗性基因，在Red重组系统的辅助下实现大肠杆菌的无痕敲除。相比于质粒

型载体，该方法可以避免目标基因突变体（如基因点突变、基因缺失突变、基因插入突变）

克隆和质粒载体的构建简化了流程。但是该方法有一个缺点即线性DNA容易被RecBCD

酶降解。但这个问题可以被克服，Red重组系统设计时就已经包含了能抑制RecBCD对线

性DNA降解的Gam蛋白。该载体同样适用于RecA重组系统。

PCR：构建上博引物abu

PCR：合成线性用藻重组施体

Ara靖导表达RedIffiM

电转化线性栽体

发生同毒■蛆

Cm抗性I1选

PCR■定

CTc»#,衰达l-Scal

*口引发DSB修黛机制

苜落PCR■定

图1.应用线性双链DNA型同源重组载体的无痕敲除技术原理图（Feh所等2008）

下图是葛高顺等人改进的大肠杆菌无痕敲除策略，第一步是采用两次PCR扩增出与

目的基因两端同源并包含核酸内切酣I-Scel序列的氯霉素抗性片段。然后诱导质粒

PKD46表达Red同源重组系统，并进行同源交换敲除目的基因，笫二步进行无痕化处

理。

nanKETA

Red

(pKD46)

PUC57Z

684mer

684m<rdsDNAs

Bed+I-Scel叱3二Rev

(pWRG99)

图2.质粒型无痕化基因敲除策略（葛高顺等20141

2Cre/loxp系统

Cre重组酶于1982年在P1噬菌体中被发现,全长1029bp,能介导2个loxp位点

间的基因删除或者倒立。loxp是一段回文序列，长约34bp，包含2个13bp的反向重复

序列和1个8bp的不对称间隔区，是Cre酶的特异性识别位点。近年来，Cre/loxp位点

特异性重组系统被用于无痕敲除。Herrmann等（2012）对该系统进行了改进，使得敲除

率可达100%。作者先将2个loxp位点通过单交换的方法整合到敲除基因两侧,依靠Cre

重组酶作用实现靶基因敲除。

ExcisionofihcwholeclusterwithCrc

irecombinase

SYloxpXY

图3.改进后的Cre/loxp系统用于无痕敲除原理示意图(Herrmann等2012\

3CRISPR/Cas9系统

CRIPSR/Cas9技术是由RNA指导Cas9蛋白进行的定向基因组编辑技术，具有结构

简单、安全性高、切点精准、价格低廉、可逆性、可同时编辑多个基因等优点，广泛应用于

不同微生物中。这里主要讲一下CRIPSR无痕编辑。通过将Red同源重组和CRISPR技术

结合，可以实现CRIPSR无痕编辑，利用了Red重组前的高效重组的优点和CRISPR系统

识别并切割特异位点的优点。Reisch等(2015)发明了no-SCAR方法，能一步实现多个

位点的无痕编辑(包括缺失、点突变、小片段插入等\该方法需要构建2个质粒，包括受

PTET启动子控制表达的cas9和tetR组成表达的质粒pCas9cr4和由受PTET启动子控制表

达的和受阿拉伯犍诱导启动子控制的人系统的质粒

sgRNAParaB-RedpKDsg-xxx0Ronda

等(2016)基于MAGE(MultiplexAutomatedGenomeEngineering)技术,仓!J造了

一种更为高效的CRMAGE(CRISPR/Cds9and入RedrecombineeringbasedMAGE

technology）,该方法对3个靶标的重组率高达96.5%-99.7%。

C

TransformwithDay1

pCas9cr4

Transformwith,

Day2

pKDsg-xxx0O

ExpressX-Redand

transformwithDay3

ssDNAordsDNAoo

ScreenbyPCR

CurepKDsg-xxxooDay4

a：37°C

TransformwithDayS

nextpKDsg-xxxoorDay1

Day6

ooorDay2

图4.no-SCAR系统用于大肠杆菌的基因组编辑（Reisch&Prather20151

Cdldeath

WT二二

图5.CRMAGE系统的两个质粒结构（Ronda等20161

参考文献:

1.FeherT,KarcagiI,GyorfyZ,etal.ScarlessengineeringoftheEscherichiacoli

genome[M]//MicrobialGeneEssentiality:ProtocolsandBioinformatics.Humana

Press,2008:251-259.

2.葛高顺，张立超，赵昕，等.大肠杆菌基因组基因无痕敲除的优化方法[几中国生物

工程杂志,2014,34(06):68-74.

3.HerrmannS,SieglT,LuzhetskaM,etal.Site-specific