IL-24蛋白的生物活性检测

第一章绪论癌症的传统治疗方法不区分恶性细胞和正常细胞,这是一个需要解决的难题。因此,同时利用特定的抗肿瘤分子与对正常组织最小的副作用是一个可取的方法.白细胞介素-24(Interleukin24)细胞因子最初被认为是黑色素瘤分化相关基因7(Melanomadifferentiationassociatedgene-7)，它被人们发现它在不影响正常细胞的情况下仍然具有特定的抗癌活性ADDINNE.Ref.{5F7B8E3B-C7E6-49F3-822A-1F3CD6FF92AC}[1]。这一发现促使科学家们研究了新发现的靶点对肿瘤细胞杀伤的影响,甚至在临床试验中也对其进行了评估ADDINNE.Ref.{63CDB6F1-5476-4CFD-9BD2-70D4595DFE55}[2]。在其异位表达之后,MDA-7/IL-24可以限制不同类型的肿瘤。它主要通过诱导细胞凋亡，抗血管生成机制，停止侵袭，癌症干细胞消除，放射敏化和化学敏化等途径发挥抗肿瘤作用。除了这些直接作用外,MDA-7/IL-24还通过改变组织的细胞因子来刺激抗肿瘤免疫反应,增强免疫细胞的补充能力,并打破免疫耐受,这些原因使得其被更广泛的认识。MDA-7/IL-24在临床前模型中的特异性抗肿瘤活性及临床试验的成功,使科学家们在不同的方式下提高了其疗效。MDA-7/IL-24作为一种杀手细胞因子,我们在基因治疗中应用时,我们通过针对恶性组织来增强分泌的MDA-7/IL-24的作用是合理的。本文综述了靶向肽在细胞因子基因治疗中的详细应用,其中MDA-7/IL-24是重点。1.1白细胞介素家族和IL-241.1.1白细胞介素家族白细胞介素(ILs)最初被认为是由白血球(白细胞)表达。根据结构特征,ILs可分为四大类。然而,他们的氨基酸序列相似度相当小(通常仅有15–25%的同一性)。人类基因组编码50多种白细胞介素和相关蛋白质.白细胞介素10(IL-10)是一种抑制合成多种细胞因子的蛋白质,包括IFN-γ，IL-2，IL-3，TNF和由激活的巨噬细胞和辅助T细胞产生的GM-CSF。在结构上,IL-10是一种由大约160个氨基酸组成的蛋白质,其中含有四个包括在二硫化键中的保守半胱氨酸。IL-10与人类蛋白质MDA-7很相似，但程度较轻。MDA-7是一种在人类细胞中具有抗增殖特性的蛋白质。MDA-7只包含IL-10的四种半胱氨酸中的两种。1.1.2IL-24白细胞介素24(IL-24)是一种蛋白质,由人类中的IL24基因编码。白细胞介素24(IL-24)属于IL-10细胞因子家族,由九个相关分子组成:IL-10，IL-19，IL-20，IL-22，IL-24，IL-26，IL-28A，IL-28B和IL-29L。这些细胞因子被分为三个具有不同生物功能的亚系:以IL-10本身为代表的IL-10亚系;IL-20亚系(IL-19，IL-20，IL-22，IL-24和IL-26);和III型干扰素(IFNs)，IL-28A，IL-28B和IL-29S。然而,尽管大多数IL-10家族成员具有免疫抑制作用,但MDA-7/IL-24被认为是一种免疫调节分子,其行为更有可能是一种刺激免疫分子。IL-24由免疫和非免疫细胞释放.ADDINNE.Ref.{6F8BE084-5FCE-4D77-AD86-08E86039CF19}[3]它是由外周血单个核细胞(PBMC)产生的,主要是由单核细胞,T和B细胞产生。分泌IL-24的非免疫细胞包括培养的黑色素细胞，真皮角质形成细胞和IL-1刺激的人结肠上皮肌成纤维细胞(SEMFs)。IL-24在正常组织中的内源性表达是高度组织特异性的,因为IL-24仅在免疫系统相关组织(如脾脏，胸腺和外周血白细胞)和特定类型的细胞中表达。此外,IL-24具有广泛的特异性抗肿瘤活动,因为它可以抑制各种肿瘤在体内和体外的生长(如肺癌，乳腺癌，宫颈癌),对正常细胞的毒性极小。就其功能而言,IL-24具有多种主要活动:在超生理水平上表达时,它可导致癌症特异性细胞死亡;它具有自身免疫作用;在创面愈合过程中抑制角质形成细胞增殖;它对心血管疾病和细菌感染有保护作用。1.2IL-24基因结构及表达1.2.1IL-24基因的结构MDA-7/IL-24位于人类1q32–33染色体上,是一种分泌的细胞因子ADDINNE.Ref.{CF9016FA-2555-49E1-BF2F-7A4ED980AD37}[4]。MDA-7/IL-24包含7个外显子和6个内含子。MDA-7/IL-24的cDNA为1718对碱基对,含一个促进分泌的片段，此主要阅读框架编码一个206个氨基酸的蛋白质ADDINNE.Ref.{8A7951F6-C4E0-4F4A-8CDC-B4463943384A}[5]。作为一种分泌的细胞因子,MDA-7/IL24具有49-氨基酸N-末端疏水信号肽,并且允许蛋白质分泌。人的IL-24基因和啮齿类动物的IL-24基因不仅在cDNA和蛋白质序列水平上,而且在白细胞因子-10家族及其外源组织的基因片段群中,都是高度同源的ADDINNE.Ref.{A00BB25C-F3FF-4DA2-A873-F3DAE9F0F5C4}[6]。人类IL-24基因已被定位到1号染色体,在一个195-kb细胞因子簇中,包含四个基因,包括白细胞介素-10，IL-19，IL-20和IL-24的线性顺序。大鼠IL-24基因位于13q13染色体上,与人类IL-10细胞因子家族具有相同的基因簇排列.人类和啮齿类动物Il-24基因的比较显示,它们具有非常相似的外显子大小和组织,但人类IL-24基因的外显子2编码信号肽。啮齿类动物IL-24基因中外显子3-5的大小和外显子6的编码区域与人IL-24基因中的外显子4-6和外显子7的编码区域相同,后者根据蛋白质对齐编码相应的氨基酸ADDINNE.Ref.{8D339999-D635-490F-B85E-63D86385800D}[6]。Sauane和Fisher实验室的同事利用Prosite数据库分析了MDA-7/IL-24的肽序列,并在氨基酸85，99和126处确定了三个假定的N-糖基化位点。此外,还从氨基酸101–121中确定了IL-10的特征结构域;在氨基酸88，133和161中发现了三个蛋白激酶C一致磷酸化位点;利用该数据库,在氨基酸101，111和161中发现了三个酪蛋白激酶II共有磷酸化位点。MDA-7/IL-24的预测三级结构是由四个强螺旋区组成的紧凑型球状分子,由不可预测的结构循环穿插。MDA-7/IL-24还可以通过分子间二硫化键形成N-连锁糖基化二聚体,这些二聚体在功能上是活跃的。1.2.2IL-24基因的表达IL-24是由免疫细胞产生的,如骨髓细胞和淋巴细胞。根据体外实验,随着来源于患者和动物研究的细胞系和原代细胞培养的建立，根据体外实验,上皮细胞在细胞因子刺激的反应中分泌IL-24。骨髓细胞还通过激活Toll样受体(TLRs)来产生IL-24,以应对微生物产物,如脂多糖(LPS)。在单核细胞中,IL-24的表达是由LPS，concanavalinA或细胞因子诱导的。为了防止不受控制的T细胞反应,已经证明IL-24直接作用于T细胞,以抑制第一轮CD8细胞扩张,以避免不受控制的T细胞反应ADDINNE.Ref.{CF1A1D8E-3FFE-471A-8492-B98E1EBA4090}[7]。此外,B淋巴细胞诱导IL-24在抗IgM和CD40-L联合刺激后的表达。在对免疫细胞分泌的细胞因子的反应中,非淋巴细胞也可以诱导IL-24。在黑素细胞转化为转移性黑色素瘤的过程中,黑色素细胞产生IL-24的生理水平逐渐下降。IL-1β刺激也增加了IL-24在角质形成细胞和人结肠性组织组织中的表达。尽管MDA-7/IL-24被广泛认为是一种抗肿瘤分子,并已被证明可以抑制造血肿瘤的增殖ADDINNE.Ref.{D7863C45-32EE-487E-9898-87D697DAC9A0}[4],但对其在Burkitt淋巴瘤中的临床作用了解甚少。同时在结肠癌，乳腺癌，黑色素瘤和急性骨髓性白血病等各种癌中也发现了MDA-7/IL-24的衰减表达。MDA-7/IL-24的衰减表达被认为与许多肿瘤生物学特征有关,如生长，转移，复发和化疗耐药等。Jamhiri和他的同事发现LX-2细胞的活化状态能引起MDA-7/IL-24及其受体表达的显著变化。MDA-7/IL-24及其同源受体在正常LX-2细胞系中的表达强调了它们对胚胎发育过程可能产生的影响。此外,瘦素还能增加MDA-7/IL-24的表达,其受体暗示了MDA-7/IL-24应作为一种新的fibrosis治疗靶点进行研究。在纤维变性过程中,在MDA-7/IL-24作用下发现不明确的未知机制,也可能有助于了解该疾病的病理,并为新的治疗药物开辟一条道路。1.3IL-24抗肿瘤作用IL-24是一种免疫调节细胞因子,也能显示广泛的癌细胞特异性抑制效应。IL-24的肿瘤抑制活性包括抑制血管生成，对化疗的敏化和诱导癌症特异性细胞凋亡。由于IL-24对恶性细胞的凋亡作用普遍存在,对正常细胞缺乏影响,且没有明显的副作用,IL-24是癌症治疗的重要候选药物。早期的人类研究表明,通过IL-20受体依赖,JAK/STAT依赖和MAPK依赖途径，一个非复制腺病毒载体表达的白细胞介素-24(Ad.IL-24)诱导细胞选择性地凋亡，这是令人鼓舞的研究结果。我们已经证明IL-24能够通过细胞内和细胞外的信号机制诱导细胞凋亡。此外,我们已经证明,由Ad.IL-24和IL-24蛋白(由Ad.IL-24感染细胞产生)通过诱导内质网应激反应和神经酰胺的产生,具有广泛的癌症特异性凋亡活性。此外,我们已经确定,在Ad.IL-24感染或IL-24感染或IL-24治疗后,神经酰胺的产生和内质网应激反应的诱导是专门发生在癌症中,而不是发生在正常细胞中。此外,通过内质网应激反应介导的途径以及ROS的产生,诱导内源性IL-24和随后诱导肿瘤特异性杀伤的有力表达。具体而言,IL-24蛋白在不激活其启动子的情况下诱导其自身mRNA的稳定。我们还证明了Ad.IL-24诱导产生p38MAPK。与这些报告一致的是,Otkjaer和他的同事表明,p38MAPK通过稳定其mRNA的非编码区来调节IL-24的表达。近年来,人们一致认为内质网应激反应是IL-24诱导细胞凋亡的初始途径。由Ad.IL-24感染细胞产生的分泌性IL-24促进抗血管生成，免疫刺激，辐射增敏和"旁观者效应"等抗肿瘤活动。IL-24刺激免疫系统产生辅助细胞因子,如TNF-α，IFN-c和IL-1,它们能引起抗肿瘤免疫反应。由Ad.IL-24感染细胞产生的分泌性IL-24蛋白通过抑制内皮细胞分化和通过抑制肿瘤细胞内的SRC活性来阻断VEGF和TGF-α的活性,从而发挥抗血管生成活性。我们已经证明,IL-24蛋白产生更多的白细胞介素-24分子,诱导更多的ER应力,并最终导致难以维持的平衡失调,最终导致癌细胞凋亡。具体而言,外源性IL-24蛋白仅通过与Ad.IL-24感染相同的机制诱导癌细胞的生长抑制和凋亡。这些发现对我们把IL-24作为肿瘤抑制蛋白以及免疫调节细胞因子的理解具有重要意义1.4MDA-7/IL-24的受体与信号通路1.4.1MDA-7/IL-24的受体黑色素瘤分化相关基因-7(MDA-7/IL-24)是一种独特的肿瘤抑制基因,可诱导肿瘤细胞选择性凋亡。部分IL-24与IL-22R1/IL-20R2，IL-20R1/IL-20R2或sigma-1受体(Sigma-1)的异二化受体复合物结合,从而增强细胞凋亡。然而,这种机制并没有得到很好的理解,很可能涉及不同的途径。大量的研究,包括在患者的细胞和体外和动物实验中的表达分析,表明IL-24的功能包括抗菌反应,组织重塑,伤口愈合,和抗肿瘤的效果,需要不同的异质受体。IL-24信号通过与IL-20受体β亚基(IL-20RB)传递。IL-20RB可以形成功能异质受体,其受体为IL-20受体α-亚基(IL-20RA),或IL-22受体(IL-22RA1)的α1亚基。图1显示了IL-24及其IL-20受体的三维结构。白细胞介素-24与IL-20受体复合体结合诱导的信号主要是通过JAK通路和随后激活STAT1和3信号通路。此外,IL-24激活细胞外信号调节激酶，JNK和p38MAPK途径ADDINNE.Ref.{43188685-F743-401C-AC22-3AB0D338CCD0}[8]。IL-20RA和IL-22RA1受体的表达仅限于某些组织,它们大多不存在于造血谱系中。IL-22RA1在皮肤，胰腺，肝脏，肾脏和肠道中高度表达。IL-20RA和IL-20RB存在于皮肤，肺，卵巢，睾丸和胎盘中,但它们在肠道和肝脏中的表达较低。除了这些功能受体外,Sigma1受体(Sig1R)在癌细胞中也被过度表达。IL-24与Sig1R结合,这种初始结合是Il-24癌症特异性凋亡的关键,正如我们所展示的那样ADDINNE.Ref.{D46261C8-8C04-4ABF-A4A0-83FE899B75D5}[9]。有趣的是,Sig1R是一种独特的蛋白质,可以调节与炎症和癌症特异性凋亡相关的许多生物机制。1.4.2MDA-7/IL-24的信号通路在生理浓度下,作为可溶性蛋白质的MDA-7/IL-24在附着在特定表面受体上时,会进行其活动。与其他IL-20亚科成员类似,IL-24可以通过两种异源二聚体受体(IL-22R1/IL-20R2和IL-20R1/IL-20R2)触发信号,从而激活Janus激酶(JAK)/信号传感器和转录-受体(STAT)路径。表达分析显示,与IL-20R2相反,其他同源受体很少出现在免疫细胞上,因此,它们不受IL-24调节的影响。然而,在激活Th1的环境中,分泌的IFN-γ可以增强常驻角质形成细胞中的IL-22R1表达,使它们对IL-24反应更敏感,并开始形成自身的免疫力。MDA-7/IL-24除了与其异源二聚体（IL-22R1/IL-20R2和IL-20R1/IL-20R2）结合，还能通过调节各种细胞信号通路发挥抗肿瘤作用及调节免疫功能：内质网应激途径，神经酰胺介导途径，丝氨酸苏氨酸激酶（serine／threoninekinase，AKT）依赖途径及半胱天冬酶（caspase）介导途径等。研究证明IL-24与膜受体结合后与癌基因蛋白产物作用，改变细胞中促细胞凋亡蛋白和抗细胞凋亡蛋白的比例，再通过激活前体半胱氨酸蛋白酶最终激活DNA酶，引起染色体的分解而导致肿瘤细胞死亡ADDINNE.Ref.{BB1ACA92-1D2C-46EF-90D1-F1E73A8F5BE2}[10]。1.5IL-24抗肿瘤机制1.5.1抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡程序性细胞死亡或凋亡在癌症药物敏感性中起着关键的治疗作用。癌症的特征之一是细胞凋亡。它涉及到一系列在癌症中被破坏的信号事件，如癌细胞绕过诱导凋亡的信号通路,逃避细胞死亡机制ADDINNE.Ref.{A1B7A735-6884-4F17-92CC-65D5B7A3A82D}[11]。许多以癌症治疗为重点的研究涉及诱导细胞凋亡的治疗能力,特别是在癌细胞。了解癌细胞避开一般凋亡途径的机制对于开发新的抗癌疗法至关重要。MDA-7/lL-24调节ER应激和线粒体凋亡途径。MDA-7/IL-24的过度表达已被证明能诱导不同癌细胞的凋亡,而不会对正常细胞产生任何有害影响。这种癌细胞特异性死亡既依赖于时间,也依赖于剂量。由于MDA-7/IL-24的过度表达,p38MAPK或丝裂蛋白激酶途径发生改变。SB203580是p38MAPK通路的抑制剂,它抑制了Ad-MDA-7诱导的细胞凋亡。这导致生长抑制和DNA损伤，并导致细胞周期抑制和细胞死亡。由MDA-7/IL-24引起的AIF介导的细胞凋亡最近已被证明在神经母细胞瘤中存在独特的现象。Pradhan小组最近的一项研究表明,MDA-7/IL-24调节了microRNAs的一个亚单位ADDINNE.Ref.{8C262235-80B7-454D-83DF-A3B37DAFA7FA}[12]。一个microRNA,miR-221,在与经MDA-7/IL-24治疗后被下调。而miR-221的靶向促凋亡基因PUMA能够阻断细胞凋亡ADDINNE.Ref.{28CA7AA2-814D-4F58-B185-029D67FFFE5B}[12]。MDA-7/IL-24向下调节miR-221,进而促进PUMA诱导细胞死亡ADDINNE.Ref.{833ED8E6-7C3C-4629-B3B0-20BEBB5DFCCB}[12]。MDA-7/IL-24降低了抗凋亡蛋白Mcl-1，Bcl-xL和Mcl-1的表达,同时诱导了Bid，Bim，Bax和Bak等原凋亡蛋白。在此过程中,MDA-7/IL-24增加了Bax/bcl-2的比率。先前的研究还证明了PERK在MDA-7/IL-24介导的细胞死亡中的作用。1.5.2抑制肿瘤细胞侵袭转移MDA-7/IL-24已被证明可以阻止癌细胞的迁移。另外,MDA-7/IL-24的过度表达导致一系列不同癌细胞的体外入侵减少。肺癌细胞在MDA-7/IL-24过度表达后,通过调节一些信号级联,显示出对迁移和侵袭的抑制作用ADDINNE.Ref.{5A7A165D-4B94-45DF-A3C7-27C10BBE50D8}[13]。局灶粘着斑激酶(FAK)和基质金属蛋白酶(MMPs)在细胞的侵袭和转移中起着至关重要的作用。MDA-7/IL-24降低了FAK和MMP-2/MMP-9蛋白的调节作用,间接抑制癌细胞的转移和侵袭。MDA-7/IL-24已被证明在肺癌细胞,宫颈癌的细胞和肝癌细胞促进有效抑制活性。MDA-7/IL-24调节一些与转移有关的分子,即cyclinB1,TGF-β,Survinin,Twist,ICAM-1,andCD44。此外,E-cadherin，NF-κB和PERK由MDA-7/IL-24调节。MDA-7/IL-24介导的侵袭和转移抑制是受体依赖性和接触性受体无关的ADDINNE.Ref.{8DD85359-4040-4341-8675-36E55681932D}[2]。IL-24抑制基质金属蛋白酶(MMP)-2,-9和粘着斑激酶(FAK)蛋白表达的产生,这些都是转移进展的重要介质。除了这些抑制活动外,IL-24还有利于E-Cadherin的表达。E-Cadherin代表了一种膜受体家族,这些受体介导与钙相关的细胞间同嗜性粘着。此外,IL-24对细胞迁移和侵袭的抑制作用是通过抑制PI3K-AKT-mTOR和Wnt信号通路介导的。IL-24还可以通过抑制CXCRN/CXCL12途径来抑制Akt/mTOR通路ADDINNE.Ref.{4D3151F7-AC78-404F-B4C0-FD24B7F12852}[13]。总体而言,这些研究表明IL-24是一种防止癌细胞转移的重要分子1.5.3抑制肿瘤血管生成癌症和转移扩散取决于充足的营养物质供应和细胞的氧气输送。此外,清除代谢废物还需要新的血液和淋巴血管。新血管的形成过程被称为血管生成,这代表了癌症的另一个特征。血管生成受许多激活物和抑制剂分子的调节。血管生成抑制剂虽然在作为单一药物时没有预期的那么有效,但在各种癌症的治疗中,血管生成抑制剂显示出了希望。Ramesh等人首次证明,通过减少CD31阳性内皮细胞的数量,IL-24在肺部移植瘤介导抗血管生成活性，这是一个肿瘤中的血管减少的标志性象征ADDINNE.Ref.{2CBD91EF-3ADC-4994-9BD6-CAAA59569C04}[14]。同样,研究表明,在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人肺微血管内皮细胞(HMVEC-L)中添加纯化的人IL-24蛋白对内皮细胞分化(ECD)有抑制作用,而不是内皮细胞增殖。体外研究清楚地表明,IL-24通过IL-22R依赖性和Akt/mTOR依赖性途径对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的内皮细胞分化产生抑制作用。人脐血管内皮细胞MDA-7/IL-24的过度表达抑制内皮细胞分化ADDINNE.Ref.{87485D2F-1274-4FDA-946C-013477F6B943}[15]。同样,用MDA-7/IL-24治疗肿瘤异种移植物,可降低血管生成标志物的表达。诱导血管血管生成的血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子也受到MDA-7/IL-24蛋白的抑制。PI3K/Akt通路是另一个已知的调节血管生成的信号级联途径,同时MDA-7/IL-24向下调节磷酸化Akt,因此可以反向调节血管生成。除了减少CD31阳性内皮细胞的数量外,抑制内皮细胞分化IL-24还可以通过抑制血管内皮生长因子(VEGF)，IL-8，成纤维细胞生长等生长因子来调节血管生成肿瘤细胞产生的因子(FGF)和转化生长因子(TGF)ADDINNE.Ref.{D0AAFCA7-3D1A-43EF-AB0D-E4B3B40890D1}[14]。这些发现表明,IL-24蛋白直接具有抗血管生成活性。1.5.4“旁观者”效应与基因治疗方法的几十种优势相比,一些缺陷还有待解决。在真正的基因治疗环境中,Ad-IL-24载体转化为肿瘤块的一部分,让重要部分保持完整。这一缺陷可能是解释病毒载体进行的一些基因治疗试验注定要失败的原因之一。然而,将表达载体传递到癌细胞会导致大部分MDA-7/IL-24的释放,进而使旁观者对非转染的邻近肿瘤细胞产生影响。这些发现突出了分泌的MDA-7/IL-24在载体转导后进入邻近肿瘤细胞表面的重要性ADDINNE.Ref.{2211D328-CEDC-4485-8719-2F2B4FD3215B}[16]。在胰腺癌的实验中,首先提到了MDA-7/IL-24的"抗肿瘤旁观者效应"从被转移的癌细胞中分泌的MDA-7/IL-24分子在肿瘤组织中传播,并引发邻近非被转移癌细胞的细胞死亡。然而,要达到在邻近肿瘤部位的有效浓度,提高细胞外活动,以及一些修改的特异性,原生的MDA-7/IL-24是必要的ADDINNE.Ref.{75F559D3-B9DB-435E-BBD8-D6A4DF9E25BF}[10]。当表达MDA-7/IL-24的重组载体访问细胞核时,它们提供了不同的转录记录,这些转录记录随后通过ER/Golgi通道被翻译和分泌。分泌的MDA-7/IL-24通过"自分泌"和"旁分泌"效应分别介导转染细胞或邻近细胞的凋亡。值得注意的是,分泌的MDA-7/IL-24诱导其自身mRNA转录的稳定性,并在不影响启动子或转录的情况下增强表达。换句话说,内源性MDA-7/IL-24表达可以在以分泌的形式附着到受体之后,并通过转录后的调节来增强。此外,一些翻译后的修改,如糖基化导致结构溶解性,以及有效的生物活性。在旁观者效应中,MDA-7/IL-24蛋白诱导癌细胞凋亡的方式与内源表达蛋白相似,如前面各节所述。在这个过程中,分子附着在邻近的细胞中增加了神经酰胺水平，ROS产生和ER应力,类似于内源性表达的压力。在类似的模式中,p38MAPK激活，caspase-3水平上调，Fas/Fasl死亡信号的触发和线粒体功能障碍也从传输MDA-7/IL-24分子的旁观者效应开始。旁观者效应是MDA-7/IL-24细胞因子的适当性质,使其优于其他导致肿瘤死亡的分子。因此,为了提高其在基因治疗设置中的临床应用,修改以提高旁观者效应是必不可少的。作为一种分泌的蛋白质,一种将MDA-7/IL-24集中在附近或遥远的肿瘤部位而不破坏正常功能的方法似乎是合乎逻辑的ADDINNE.Ref.{8F7F7E03-3AA5-40B3-AF67-2599640C931A}[17]。研究发现CPPs或THPs对MDA-7/IL-24可溶性细胞因子有更好的肿瘤靶向效果,把CPPs/THPs和MDA-7/IL-24联系起来可改善其肿瘤细胞杀伤性和特异性1.5.5细胞自噬机制自噬是位于细胞质中的细胞器降解的过程。由于其不同的环境相关作用,此过程是复杂的。有时它是保护性的,帮助癌细胞在不利的条件下生存,但有时它也可能对癌细胞有毒ADDINNE.Ref.{31398B90-CB6F-413B-8429-71DEB6284AFD}[18]。能够控制自噬的小分子在某些情况下可能提供治疗效果。MDA-7/IL-24诱导自噬,由PERK和Beclin-1介导。MDA-7/IL-24调节microRNAs的一个亚单位,包括致癌microRNA,miR-221ADDINNE.Ref.{59A2EF34-0D10-4779-9BA3-1CD8F3C4D0C2}[12]。Beclin-1被确定为miR-221的新转录靶点。MDA-7/IL-24向下调节miR-221,miR-221反过来诱导beclin-1,从而导致自噬作用ADDINNE.Ref.{AE6F9553-7283-4304-A4D8-AE464C12FBA5}[12]。我们还观察到LC3的裂解,这是自噬的标志。在肾癌和卵巢癌中,CD95是由MDA-7/IL-24介导的诱导自体性白细胞介素的重要调控分子。一般来说,自噬过程可以由MDA-7/IL-24的内源或外源表达触发,但其后果取决于未知机制的细胞类型。自噬是一种循环利用细胞分子的过程,已知会对肿瘤产生抑制作用或保护作用,这取决于肿瘤的类型和发育阶段,而这些影响和发展阶段分别是早期或后期。自噬对MDA-7/IL-24肿瘤抑制作用的帮助是有争议的。通常我们认为MDA-7/IL-24直接参与自噬过程的不同步骤只是一种辅助作作用。研究表明,在肾癌和卵巢癌以及白血病中,由于引发的自噬，MDA-7/IL-24引起明显的细胞毒性,但前列腺癌并非如此。实际上,阻断主要自噬介质的活动,如beclin和ATG,明显地减弱了其在不同肿瘤中的细胞毒性,表明自噬的协同作用。在卵巢和肾肿瘤细胞中,可溶性MDA-7/IL-24通过不同的方式触发自噬,例如CD95信号通路。在这项研究中,Fisher博士的研究小组证明,重组的MDA-7/IL-24蛋白诱导LC3通过CD95依赖途径的空泡化。他们还表明,击倒ATG5减少了由MDA-7/IL-24的死亡诱导。最近,他们还显示,MDA-7/IL-24通过miR-221/beclin-1反馈回路调节体内乳腺细胞自噬。在他们的小鼠移植瘤模型模型中,内源性和重组的MDA-7/IL-24抑制了miR-221的表达水平,进而增强了beclin蛋白的表达,作为其转录靶点ADDINNE.Ref.{C43873CB-D993-45D5-89BF-7C3FBB9D1F38}[12]。相反,对于前列腺癌和白血病细胞,在MDA-7/IL-24治疗后,检测到不同的自噬行为。在这些细胞中,通过不同的手段抑制自噬可以增强MDA-7/IL-24细胞毒性。研究表明,Ad.Mda-7可能通过不确定的机制促进生物从自噬向细胞凋亡的转变。因此,在白血病模型中,自噬过程可以保护细胞免受MDA-7/IL-24介导的死亡,就像在人口腔鳞癌中一样,其抑制加速了凋亡过程ADDINNE.Ref.{C50B52BD-79DE-4F17-847F-3068575D2FB6}[19]。总之,MDA-7/IL-24基因表达或重组蛋白治疗在不同的癌细胞上是否会以类似的方式增强或逆转自噬还有待确定。1.6总结IL-24是一种多发性细胞因子,对免疫细胞，上皮细胞和癌细胞等多种细胞群都有影响。IL-24具有广泛的活性,包括抗菌反应，组织重塑，伤口愈合和抗肿瘤作用。IL-24的影响似乎相当复杂,因为它的作用可能因免疫反应的细胞来源，目标和阶段而有所不同。总的来说,我们可以认为IL-24作为一种免疫调节细胞因子和抗肿瘤分子具有广泛的活性,包括肿瘤特异性诱导细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成。IL-24的作用依赖于与分子伴侣的结合,包括Bip/GRP78，Sig1RADDINNE.Ref.{DB457774-94B2-49A3-9AAA-9557E6D8037B}[9]，IL-20受体和dsRNA依赖性蛋白激酶(PKR)。目前，我们仍不清楚IL-24的抗肿瘤作用是否反映了其其他生物功能。我们需要对IL-24和相关途径的分子特性进行更详细的分析,以充分了解这种细胞因子。本课题旨在深入研究IL-24细胞因子对癌症的抑制作用。我们拟构建含有IL-24基因的克隆载体及表达载体，在确认构建成功后我们将表达并纯化该蛋白，最后对其生物活性进行检测。通过本课题，我们为进一步研究IL-24的抗癌作用打下基础，并对其产生一定的促进作用。第二章实验材料和方法2.1材料2.1.1生物材料（1）引物：由金斯瑞生物科技公司进行合成，并由本实验室-20℃保存。（2）PUCm-T载体：由上海生工公司购入，本实验室保存。（3）pcDNA3.1质粒：由TaKaRa公司购入，本实验室保存。（4）DH5α大肠杆菌感受态：由本实验室保存。（5）NIH3T3细胞：由本实验室保存。（6）B16细胞：由本实验室保存。2.1.2主要试剂表2-1主要实验试剂名称生产厂商溴化乙锭北京鼎国琼脂糖美国Tris-Base德国Tris-Cl德国葡萄糖美国10×PCRBuffer大连宝生生物工程公司dNTPMixture大连宝生生物工程公司盐酸北京化工厂氢氧化钠北京化工厂无水乙醇北京化工厂氯仿北京化工厂苯酚北京化工厂氨苄霉素华北制药DNAMarkerTaKaRa蛋白MarkerTaKaRa十二烷基硫酸钠(SDS)美国TAE上海生工异丙醇天津化学试剂DL2,000DNAMarkerTaKaRa蛋白质MarkerTaKaRaDEPC美国Taq酶大连宝生生物工程公司噻唑蓝（MTT）北京化工厂PEI转染试剂北京化工厂AMV酶GEN-VIEWOligod（T）北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司EcoRⅠTaKaRaHindⅢTaKaRaAfⅡTaKaRaXbaⅠTaKaRaXhoⅠTaKaRaStuⅠTaKaRaDMEM培养基GibcoT4DNA连接酶TaKaRa2.1.2主要仪器表2-2实验主要仪器仪器名称型号生产厂家高压蒸汽灭菌锅MLS-3750SANYOEletricCo.Ltd.电子天平AL104上海梅特勒托利多电泳仪DYY-6D北京六一台式高速离心机TG16B湖南凯达PCR仪T960杭州晶格恒温摇床HY-6中国上海电热恒温鼓风干燥箱101-1AB天津泰斯特通风橱鼎扬实验设备有限公司紫外可见分光光度仪UV-5100上海光谱仪器有限公司无菌超净工作台TH-B402无锡一净净化设备厂移液枪Eppendorf2.1.3试剂配制LB培养基：表2-3LB培养基的配置组分100mL体系胰化蛋白胨（Tryptone）1g酵母提取物（YestExtract）0.5gNaCl1g无菌水加至100mL用NaOH调节pH至7.0，高压灭菌20min后，冷却至室温，4℃避光保存。LB固体培养:表2-4LB固体培养基的配置组分100mL体系胰化蛋白胨1g酵母提取物0.5gNaCl1gAmpicillin0.1mL无菌水加至100mL用NaOH调节pH至7.0，高温高压灭菌后,放置室温环境冷却至60℃，加入0.1mL抗生素（Ampicillin）（100mg/mL）后均匀混合，铺置平板。置于4℃闭光保存。抗生素：表2-5抗生素的配置组分50mL体系Ampicillin5g无菌水加至50mL用滤器过滤细菌后，将抗生素小份封装，于-20℃保存。TAE缓冲液：表2-6TAE缓冲液的配置组分100mL体系Tris0.448gNa2EDTA·2H2O0.0744g冰醋酸5.71mL无菌水加至100mL室温保存。2.2实验方法2.2.1引物设计（1）通过NCBI网站查找鼠IFN-γ的CDS基因序列；（2）利用软件PrimerPremier5及NCBI网站进行引物设计及筛选；（3）由金斯瑞生物科技公司进行合成，并由本实验室-20℃保存2.2.2提取总RNA1.1000rpm离心5min，收集NIH3T3悬浮细胞。用PBS洗涤细胞后，再次1000rpm离心5min。2.向样品中加入1mLTrizol溶液，吹打混匀，将裂解后样品或匀浆液室温放置5-10min，使细胞充分裂解，得核蛋白与核酸完全分离。3.向样品中加入0.2mL氯仿，然后剧烈振荡15s，室温放置3min。4°C，12000转离心10min。4.将上层水相转移至干净的离心管中，加入离心管中等体积的异丙醇，待混匀后，室温静置20min。4℃，12000rpm离心10min,弃去上清液。5.向离心管中加入1mLDEPC处理过的75%乙醇用于洗涤沉淀，4°C，12000rpm离心3min,弃去上清液后进行室温干燥5min。6.向晾干后的样品中加入30RNase-freeddH2O,用于充分溶解RNA，取1µL样品稀释1000倍，用紫外可见分光光度仪测吸光值，剩余样品用于后续实验研究。2.2.3基因扩增2.2.3.1反转录反应反应体系如下：表2-7反转录反应体系反应组分40µL反应体系总mRNA(ddH2O)24µL5×RT-Buffer8µLdNTP（10mM）4µLOligodT(10mM)2µLAMV(30U/µL)2µL反应条件：42°C60min，95°C5min，4°C5min2.2.3.2PCR扩增PCR反应体系如下表：表2-8PCR体系反应组分50μl反应体系Taq酶(5U/μl)1µL10×PCRBuffer(Mg2+，plus)5µLdNTPMixture(各2.5mM)4µL模板DNA（反转录产物）1µL上游引物F2µL下游引物R2µLddH2O35µL反应步骤：1.预变性：94°C，5min。2.变性：94°C，30s。3.退火：55°C，30s。4.延伸：72°C，30s。5.循环数:步骤2-4循环30次。6.最终延伸:72℃，10min。7.保存：4℃，100min。2.2.4克隆载体的构建与鉴定2.2.4.1目的基因的回收1.将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，利用紫外凝胶成像系统切下目的DNA条带。2.使用天根公司生产的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA目的片段。3.取500μL平衡液BL加至吸附柱CA2中，12000rpm离心1min，舍弃无用液体，把吸附柱再次置于收集管内。4.把含有目的DNA的凝胶条带于干净的离心管中称重。5.将同倍体积的PN液移入含有凝胶块的离心管，于50℃的水浴中放置，不断摇动直至凝胶融化。6.将步骤5所得液体移至CA2柱中，20℃，放置2min，12000rpm离心60s，舍弃无用液体，把吸附柱再次置于收集管内。7.量取600μL漂洗液PW加至吸附柱CA2中，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。8.重复操作步骤7。9.CA2柱再次置于收集管内，12000rpm离心2min。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干。10.将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，悬空滴加ddH2O于吸附膜中间位置，室温放置2min。12000rpm离心2min收集DNA溶液，于-20℃保存。2.2.4.2连接T载体1.将回收的目的基因片段和pUCm-T载体相连，反应体系如下：表2-9克隆载体连接体系反应组分20µL反应体系插入的目的片段3µLpUCm-T载体1µL10×LigationBuffer2µLT4DNA连接酶1µL无菌水补足至20µL2.16℃连接1h,-20°C保存待后续使用。2.2.4.3转化感受态细胞1.取出保存于-80°C冰箱的EcoliDH5α感受态细胞，然后将其置于冰浴中解冻。2.向细胞中加入连接反应产物，轻轻混匀并掌式离心，将其迅速在冰浴中静止30min。3.其放置于42℃水浴中计时90s，然后立即将其转移到冰上，静置2min。4.从已灭菌的LB培养液取出900μL转移至离心管，37℃，200rpm摇床培养50min。5.把离心管内容物混合，取100μL菌液转移到已加有Ampicillin的LB琼脂培养基上，用已灭菌的涂布棒将菌液细胞涂开。在室温下静置，直至菌液吸收完全，37℃，倒置平板培养12-16h。6.在超净工作台中挑取单个菌落于3mL含氨苄的LB液体培养基中，在37℃，200rpm摇床过夜培养。2.2.4.4菌液PCR取1µL2.2.4.3中的菌液进行菌液PCR,然后将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。表2-10PCR体系反应组分50μl反应体系Taq酶(5U/μl)1µL10×PCRBuffer(Mg2+，plus)5µLdNTPMixture(各2.5mM)4µL菌液1µL上游引物F2µL下游引物R2µLddH2O35µL反应步骤：1.预变性：94℃，10min。2.变性：94℃，30s。3.退火：55℃，30s。4.延伸：72℃，30s。5.循环数:步骤2-4循环30次。6.最终延伸:72℃，10min。7.保存：4℃，100min。2.2.4.5克隆载体的质粒提取1.将剩余菌液应用天根公司生产的无内毒素质粒小提试剂盒提取质粒。2.取500μLBL液加到CP3柱中，12000rpm离心1min，舍弃废液。3.取3mL培养12-16h的菌液，移到离心管中，12000rpm离心1min，尽量吸除上清。4.移入250μLP1溶液到含有菌体沉淀的离心管内，将菌体沉淀悬浮在P1溶液中。5.移入250μLP2溶液到离心管内，缓和的颠倒混匀，从而让菌体得以充分的裂解。6.取P3溶液350μL于离心管内，缓慢的混匀。12000rpm离心10min。7.将6步中收集的上层清液转移到CP3柱中12000rpm离心30-60s，舍弃无用液体，把CP3柱再次放回收集管内。8.取PW漂洗液600μL于CP3中，12000rpm离心1min，舍弃无用液体，把CP3柱再次放回收集管内。重复此步骤。9.将CP3吸附柱再次放到收集管内，12000rpm离心120s。10.取1个洁净的EP管将CP3吸附柱置于其中，取60μLddH2O缓慢滴加于吸附膜的中，室温放置120s，12000rpm离心120s。使用封口膜密封，置于-20℃保存。2.2.4.6克隆载体的酶切鉴定取4μL2.2.4.5中的目的基因质粒，以AfⅡ和XbaⅠ为酶切位点进行双酶切反应，然后将切得产物在1%凝胶进行电泳鉴定。表2-11pcDNA3.1(+)-IL-24双酶切鉴定反应组分20μL反应体系StuⅠ1µLHindⅢ1µLpcDNA3.1(+)10µL10×MBuffer2µL无菌水补足至20µL2.2.5重组真核表达载体的构建与鉴定2.2.5.1双酶切反应1.将2.2.4.5中含有EcoRⅠ和XhoⅠ位点的重组质粒pUCm-T-IL-24和质粒pcDNA3.1(+)分别用EcoRⅠ和XhoⅠ酶进行双酶切。表2-12pUCm-T-IL-24双酶切体系反应组分20μL反应体系EcoRⅠ1µLXhoⅠ1µLpcDNA3.1(+)10µL10×HBuffer2µL无菌水补足至20µL表2-13pcDNA3.1(+)双酶切体系反应组分20μL反应体系EcoRⅠ1µLXhoⅠ1µLpcDNA3.1(+)10µL10×HBuffer2µL无菌水补足至20µL2.将目的DNA片段进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后在紫外凝胶成像系统下切得目的DNA条带。3.使用天根公司生产的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA目的片段。4.取500μL平衡液BL加至吸附柱CA2中，12000rpm离心1min，舍弃无用液体，把吸附柱再次置于收集管内。5.把含有目的DNA的凝胶条带于干净的离心管中称重。6.将同倍体积的PN液移入含有凝胶块的离心管，于50℃的水浴中放置，不断摇动直至凝胶融化。7.将6步骤所得液体移至CA2柱中，20℃放置2min，12000rpm离心60s，舍弃无用液体，把吸附柱再次置于收集管内。8.量取600μL漂洗液PW加至吸附柱CA2中，12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。重复此步骤。9.CA2柱再次置于收集管内，12000rpm离心2min。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干。10.将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，悬空滴加ddH2O于吸附膜中间位置，室温放置2min。12000rpm离心2min收集DNA溶液，于-20℃保存。2.2.5.2连接表达载体1.将回收的目的基因片段和pcDNA3.1(+)载体相连，反应体系如下：表2-14表达载体连接体系反应组分20µL反应体系插入的目的基因片段3µLpcDNA3.1(+)载体1µL10×LigationBuffer2µLT4DNA连接酶1µL无菌水补足至20µL2.16℃连接1h,-20℃保存待后续使用。2.2.5.3转化感受态细胞1.取出保存于-80℃冰箱的EcoliDH5α感受态细胞，然后将其置于冰浴中解冻。2.向细胞中加入连接反应产物pcDNA3.1(+)-IL-24，轻轻混匀并掌式离心，将其迅速在冰浴中静置30min。3.其放置于42℃水浴90s，然后立即将其转移到冰上，静置2min。4.从已灭菌的LB培养液取出900μL转移至离心管，37℃，200rpm摇床培养50min。5.把离心管内容物混合，取100μL菌液转移到已加有Ampicillin的LB琼脂培养基上，用已灭菌的涂布棒将菌液细胞涂开。室温静置，直至菌液吸收完全，37℃倒置平板培养12-16h。6.在超净工作台中挑取单个菌落于3mL含氨苄的LB液体培养基中，在37℃，200rpm摇床过夜培养。7.与500μL40％甘油混合菌液，留取的菌种于-70℃冰箱保存。2.2.5.4质粒小量提取1.将剩余菌液应用天根公司生产的无内毒素质粒小提试剂盒提取质粒pcDNA3.1(+)-IL-24。2.取500μLBL液加到CP3柱中，12000rpm离心1min，舍弃废液。3.取3mL培养12-16h的菌液，移到离心管中，12000rpm离心1min，尽量吸除上清。4.移入250μLP1溶液到含有菌体沉淀的离心管内，将菌液在涡旋悬浮。5.移入250μLP2溶液到离心管内，缓和的颠倒混匀，从而让菌体得以充分的裂解。8.取P3溶液350μL于离心管内，缓慢的混匀。12000rpm离心10min。9.将6步中收集的上层清液转移到CP3柱中，12000rpm离心30-60s，舍弃无用液体，把CP3柱再次放回收集管内。10.取PW漂洗液600μL于CP3中，12000rpm离心1min，舍弃无用液体，把CP3柱再次放回收集管内。重复此步骤。11.将CP3吸附柱再次放到收集管内，12000rpm离心120s。12.取1个洁净的EP管将CP3吸附柱置于其中，取60μLddH2O缓慢滴加于吸附膜的中，室温静置120s，12000rpm离心120s。使用封口膜密封，-20℃保存。2.2.5.5表达载体酶切鉴定取4μL2.2.5.4中的目的基因质粒，以StuⅠ和HindⅢ为酶切位点进行双酶切反应，然后将切得产物在1%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。pcDNA3.1(+)-IL-24的双酶切体系为：表2-15pcDNA3.1(+)-IL-24双酶切体系反应组分20μL反应体系StuⅠ1µLHindⅢ1µLpcDNA3.1(+)10µL10×MBuffer2µL无菌水补足至20µL2.2.6IL-24蛋白的诱导表达2.2.6.1质粒的大量提取1.将构建质粒正确的200μL菌种接种于200mLLB培养液中，37℃200rpm恒温摇床培养过夜。2.将培养后的菌液4℃，4000rpm离心15min，弃去上清，敞开离心瓶口并倒置离心瓶使上清全部流尽。3.将细菌沉淀物重悬于10mL溶液Ⅰ中，溶液Ⅰ配置如下：表2-16溶液Ⅰ组分体系葡萄糖50mmol/LTris•Cl(pH8.0)25mmol/LEDTA(pH8.0)10mmol/L4.加入1mL新配置的溶菌酶。5.加入20mL新配置的溶液Ⅱ，溶液Ⅱ的配置如下：表2-17溶液Ⅱ组分体系NaOH50mmol/LSDS25mmol/L6.加入15mL经冰水预冷的溶液Ⅲ，溶液Ⅲ的配置如下：表2-18溶液Ⅲ组分体系5mmol/L乙甲酸60mL冰乙酸11.5mL冰乙酸28.5mL封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀，在冰上放置10min，形成白色絮状沉淀。7.于4℃，4000rpm离心15min,然后把上清液过滤至250mL离心瓶中，加0.6倍的异丙醇，充分混匀，室温，静置10min。8.室温，5000rpm离心15min，小心倒掉上清，于室温用70%乙醇洗涤沉淀和瓶壁，用3mLTE(pH8.0)溶解核酸沉淀。9.将核酸溶液转入离心管中，再加用冰预冷的5mol/LLiCl溶液，充分混匀，4℃，10000rpm离心10min。将上清液转移到另一离心管中，加等量的异丙醇进行充分混匀，室温，10000rpm离心10min。10.去掉上清，于室温用70%乙醇洗涤沉淀及管壁，除去残留乙醇后敞开管口并倒置在纸巾上，使痕量乙醇蒸发。11.用含有RNA酶的TE（pH8.0）溶解沉淀，并转移到另一微量离心管中，于室温静置30min。加500µL含13%聚乙二醇的1.6mol/LNaCl，充分混合后于4℃，12000rpm离心5min。12.吸出上清，用400µLTE（pH8.0）溶解质粒DNA沉淀，然后用酚，酚：氯仿，氯仿各抽提一次。将水相转到另一离心管中，加100µL10mol/L乙酸铵，充分混匀。加两倍体积乙醇，于室温放置10min，于4℃，12000rpm离心5min。13.吸出上清，加200µL处于4℃的70%乙醇。稍加震荡，4℃，12000离心2min。吸出上清，敞开管口，将管倒置于纸巾上，直至痕量乙醇蒸发。14.用500µLTE(pH8.0)溶解沉淀，并用TE（pH8.0）进行1：100稀释，通过测量OD260来计算DNA的浓度，然后将DNA储存于-20℃。2.2.6.2B16细胞的复苏培养及冻存2.2.6.2.1B16细胞复苏及传代1.将移液管，T-25培养瓶和50mL离心管置于超净工作台中，并紫外线杀菌30min。从液氮中取出冻存的B16细胞，用镊子夹取冻存管并与培养基一同置于37°C水浴，持续摇晃冻存管使细胞迅速融化成液态。2.待冻存管剩余一小块冰时与培养液一同取出，并置于超净工作台。酒精消毒后，用灭菌过的吸管将培养基吸取至离心管中，然后将冻存液移至同一离心管中。使冻存液与培养基的比例为1：10，并稍稍悬浮混匀。3.将离心管以1000rpm离心5min,除去上清液。向离心管中加入10%FBS的DMEM培养基，并使用吸管缓慢的反复吹打制成悬液。以1×105/mL密度接种于培养瓶内，在37℃，5％CO2及饱和湿度培养箱培养。4.48h后，对B16用新鲜的DMEM培养基给细胞换液。2.2.6.2.2B16细胞的传代培养1.当复苏的B16细胞长到瓶底总面积的75%时，开始进行传代培养。37℃水浴预热培养基。2.在超净台中，弃掉T-25细胞培养瓶中的培养基，加入2mLFBS清洗，再加入1ml0.25%胰酶-EDTA消化细胞。3..在显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，即可加入5mL培养基终止消化4.用移液器轻轻吹打瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散。将细胞转移至离心管中，1000rpm离心5min。5.弃上清,加入15-20mL的培养基重悬细胞后分装到T-25细胞培养瓶中（确保细胞贴壁后融合度在25-50%之间），细胞密度在1×104cells/cm2(2.5×105cells/T-25瓶），混匀细胞悬液，确保细胞均匀分布。6.将培养瓶置于37℃，5%CO2的无菌培养箱中培养。每两天用新鲜，预热的培养基进行换液。2.2.6.2.3细胞冻存1.当传代培养的B16细胞融合度达到70%-80%时进行冻存。2.准备冻存细胞时，提前ld更换培养液，0.25％胰酶消化1min，然后制成均匀分散的细胞悬液。3.将上一步悬液移入到无菌的50mL离心管内，然后1000r/min离心5min，吸除上层清液，按培养基：小牛血清：二甲基亚砜=6：3：l的配比将其制成冻存液，用其完全分散沉淀的细胞，使细胞密度为1×106/mL～1×107/mL。4.吸取细胞冻存悬液1mL移入到灭菌的冻存管，封口膜封好，将细胞的名称传代的次数以及冻存具体时间进行标明；放入冻存盒，然后移入-70℃超低温冰箱中过夜，后转移至液氮罐中保存。2.2.6.3转染实验1.转染前1d内，将B16细胞用含10％FBS的DMEM培养基制成密度为4×106/ml的悬液进行细胞的铺板，以便在转染时，贴壁细胞的密度大约在80%左右。2.转染前将含有目的基因质粒载体,PEI转染试剂和无血清DMEM培养基室温放置10min备用。3.将1μg质粒DNA稀释到40μL无血清的DMEM培养基，用移液枪吹吸3-4次。将3μLPEI转染试剂稀释到40μL无血清的DMEM培养基，用移液枪吹吸3-4次。4.将稀释好的PEI转染试剂逐滴滴加至DNA稀释液中，并立即涡旋混匀。室温孵育15min，已形成PEI-DNA复合物。5.用无血清DMEM润洗B16细胞，除去用于传代的培养基，并将细胞移入无血清培养基，将上述80μLPEI-DNA转染复合物均匀滴入到含细胞的培养皿中。轻轻晃动培养皿，让PEI-DNA复合物分散均匀。6.37℃，CO2培养箱中，孵育细胞，在转染3-5h后，添加1/2体积的包含30%血清的DMEM培养基，在转染12-18h后完全去除含PEI-DNA复合物的培养液，用含血清和抗生素的新鲜培养液继续培养细胞。7.在培养细胞68h后，通过离心收集细胞并进行超声破碎，然后吸取细胞表达产物上清,并进行12%SDS电泳检测。2.2.6.4SDA电泳检测1.将玻璃板正反两面经过清洁液搓洗后。然后用水将清洁液冲洗干净后，再用纯化水冲洗在架子上将水晾干。2.将玻璃板使用配套夹子固定好。然后垂直卡在架子上准备灌胶。3.现配12％分离胶，当即与TEMED混匀进行灌胶。灌胶时，采用1mL移液枪将胶沿着玻璃边缘匀速移入其中，然后胶体液面加至标定线时即停止。然后吸取水加到胶上稍稍溢出即停止。4.取适量电泳液加入其中后，准备加2.2.6.3中的样品。5.待到加样完毕，调节直流电源电压到60V，使样品在浓缩胶中电泳大约15～20min；当指示剂跑至分离胶时，将电泳的电压调至120V，直至电泳结束电压始终保持不变。当指示剂跑至距分离胶底端1～2cm处，即终止电泳。6.当SDS结束后，现将直流电源关闭，取出玻璃板，用刀轻轻撬动，即将胶与玻璃板完全分开，然后将胶片缓缓取下，将其放至于大培养皿中。7.加固定液浸没胶片10-12h取出，用脱色液将其脱色3次，每次10min。漂洗后的凝胶沉浸于辅染液中10min。取出用清水洗3次，每次2min。8.然后将胶片置于强光下30min，在置于室内光线下20min.然后用水洗2次，每次1min。9.把胶转移到显色液中，每2min更换1次，待蛋白质的条带彻底显色，然后放于终止液10min后，保存胶于纯化水。2.2.7IL-24蛋白的生物活性检测1.收集对数期B16细胞，调节细胞悬液浓度1x106/mL，依次将下列物质加入到96孔板（共100μL）：（1）补足DMEM（无血清）培养基40μL；（2）加10μL用DMEM培养液稀释的ActinomycinD（储存液100μg/mL，）；（3）IL-24蛋白10μL；（4）细胞悬液50μL（即5×104cell/孔）。每板设对照（加100μLDMEM培养基）。2.置于37℃，5%CO2孵育16-48h，在倒置显微镜下观察细胞。3.每孔加入10μLMTT溶液（5mg/mL，即0.5%MTT），继续培养4h。在酶联免疫检测仪OD570nm处（630nm校准）测量各孔的吸光值。4.同时设置调零孔和对照孔。调零孔加入培养基，MTT及二甲基亚砜。对照孔加入细胞，培养液，MTT，二甲基亚砜，以及与实验组相同浓度的药物溶解介质。每组各设定6个复孔。第三章实验结果3.1引物设计结果根据GenBank中鼠的IL-24基因序列（登录号NM053095.2）找到CDS序列，见图3-1。根据CDS序列利用引物设计软件Primer5.0设计引物，引物设计结果见图3-2。其中上游引物IL-24-F：5’-GCAGAAGATCCTC-TACCAATG-3’，下游引物IL-24-R：5’-GGAAGTTATCCAATCAGCAGT-3’。图3-1IL-24CDS序列图3-2引物设计结果3.2总RNA抽提结果从293T细胞抽提得到总RNA，经紫外可见分光光度仪测定，总RNA的OD260/OD280值为1.95。3.3IL-24基因的RT-PCR结果以抽提得到的总RNA为模板并以OligodT为引物进行反转录，得到cDNA。经紫外分光光度计测定，cDNA的OD260/OD280=1.76。以反转录获得的cDNA为模板，使用上游引物IL-24-F：5’-GCAGAAGATCCTC-TACCAATG-3’，下游引物IL-24-R：5’-GGAAGTTATCCAATCAGCAGT-3’，分别进行3次PCR扩增。3次PCR扩增产物经过1%琼脂糖凝胶电泳的检测后，分别得到一条700bp左右的清晰条带，与目的基因大小相符，含量较高，见图3-3第1泳道；一条700bp左右的不清晰条带，与目的基因大小相符，但含量较低，见图3-3第2泳道；没有特异性条带，见图3-3第3泳道。综上，选择第1泳道所含目的基因为后续实验所用。123M750500Bp750500BpM:DNAMarker(DL2000);1:IL-24基因（大量）；2：IL-24基因（少量）；3：IL-24基因（无）图3-3IL-24基因的PCR鉴定3.4pUCm-T-IL-24克隆载体的构建与鉴定将PCR产物进行胶回收后，在T4DNA连接酶的作用下，使pUCm-T载体和目的基因片段进行连接反应，得到重组质粒pUCm-T-IL-24。将pUCm-T-IL-24转化至感受态细胞E.coliDH5α后，先挑阳性单克隆进行菌液PCR鉴定，经琼脂糖凝胶电泳后得到一条特异性条带，大小在700bp左右，见图3-4泳道1。然后对重组质粒进行双酶切鉴定，酶切位点为AfⅡ和XbaⅠ，经1%琼脂糖凝胶电泳后,得到大小为大于100bp的特异性条带，见图3-4泳道2。Bp12Bp750500250100750500250100M:DNAMarker;1:pUCm-T-IL-24阳性单克隆菌液PCR鉴定;2:pUCm-T-IL-24经AfⅡ和XbaⅡ双酶切鉴定图3-4pUCm-T-IL-24克隆载体的鉴定3.5pcDNA3.1(+)-IL-24表达载体的构建与鉴定将重组质粒pUCm-T-IL-24与质粒pcDNA3.1(+)分别以EcoRⅠ和XhoⅠ为酶切位点进行双酶切，胶回收目的片段并连接后，得到表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24，挑阳性克隆并进行菌液PCR，并进行琼脂糖凝胶电泳，得到大小在700bp左右的特异性条带，结果见图3-5。然后提取质粒并以StuⅠ和HindⅢ进行酶切鉴定，得到一条280bp左右的特异性条带，鉴定结果见图3-6。M11000750Bp1000750BpM：DNAMarker;1:表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24;2:质粒pcDNA3.1(+)图3-5pcDNA3.1(+)-IL-24阳性单克隆PCR鉴定BpBp500250500250M:DNAMarker;1:pcDNA3.1(+)-IL-24经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切图3-6pcDNA3.1(+)-IL-24双酶切鉴定3.6IL-24基因在B16细胞中的表达与SDS鉴定将重组pcDNA3.1(+)-IL-24质粒通过PEI试剂转染到B16细胞中，在37°C，5％CO2培养箱中，培养细胞68h。通过离心收集细胞并进行超声破碎，然后吸取细胞表达产物上清进行12%SDS电泳检测，细胞表达产物上清的电泳结果中有一条24.5kD左右的蛋白条带，电泳结果见图3-7ADDINNE.Ref.{24F9EE99-0990-497A-BCBB-A0591269FA62}[20]。M129.020.1kD29.020.1kDM：蛋白Marker;1:转化pcDNA3.1(+)-IL-24质粒的B16细胞表达产物上清图3-7IL-24蛋白的SDS电泳检测3.7IL-24生物活性检测将B16细胞加入到96孔板，加入过滤除菌的IL-24蛋白，使其浓度为20mg/L，加ActinomycinD及无血清DMEM培养基。同时设立只加IL-24蛋白的对照孔，及不加细胞和IL-24蛋白的调零孔。使用酶联免疫检测仪在OD570nm处（630nm校准）测量各孔的吸光值，测得实验组OD值为0.338，对照组OD值为0.467。结果见图3.8。OD值图3.8OD值

第四章讨论MDA-7/IL-24可通过多条信号通路，不同作用机制显著抑制肿瘤增殖，侵袭，转移及血管生成等，并扭转多药耐药，增强化疗敏感性，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤组织增殖，且MDA-7/IL-24能够靶向肿瘤干／起始细胞，诱导其凋亡。因此，MDA-7/IL-24作为机体免疫中重要的细胞因子，代表了它能够实现广范的应用前景，从多方面产生抑制癌症或促进癌症治疗的作用。本研究通过构建MDA-7/IL-24基因的真核表达载体，来对IL-24蛋白的作用进行研究。在本次的实验中，我们先从293T细胞中提取到了总RNA，再用引物设计软件Primer5设计出特异性引物。设计引物时，在权衡反转录的难易程度后，选择了在反转录过程中可能产生四对二聚体的引物。随后通过RT-PCR就获取到IL-24的全长基因，其基因大小与目的基因大小相符，因此可以确定PCR扩增成功。利用T4DNA连接酶，把目的基因片段连上T载体，在经菌液PCR鉴定后可以确定克隆载体构建成功。在以AfⅡ和XbaⅠ为酶切位点进行酶切鉴定后，可以根据特异性条带大小判断目的基因正向连接入T载体。将克隆载体pUCm-T-IL-24上的目的基因连入表达载体pcDNA3.1(+)后，经菌液PCR和酶切鉴定，再次确认了表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24的构建成功。在将表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24转染真核细胞B16后，对其表达产物进行SDS检测。检测结果显示表达产物为24.5kD左右,与目的蛋白大小相符，表示IL-24蛋白表达成功。通过采用MTT法检测，我们的实验结果显示该IL-24蛋白对肿瘤细胞有明显的抑制增殖和诱导凋亡的效果。成功表达出的IL-24蛋白具有抗肿瘤生物活性，将为进一步研究IL-24蛋白的功能及其对癌症等相关疾病的研究提供帮助。

结论本实验成功根据IL-24基因的CDS