白芨多糖对两种常见致病菌抑菌活性和机制的研究

白芨多糖对两种常见致病菌抑菌活性和机制的研究摘要：以白芨为原材料，通过碱水提取法提取白芨多糖，经木瓜蛋白酶精制后采用苯酚-硫酸法测定提取物中白芨多糖含量，采用滤纸片扩散法对大肠杆菌和沙门氏菌进行系列浓度梯度的抑菌试验，确定白芨多糖对两种常见致病菌的抑菌效果，之后分别通过测白芨多糖处理过的大肠杆菌培养液的电导率、碱性磷酸酶和蛋白质含量推断白芨多糖的抑菌机制。结果表明：白芨多糖对大肠杆菌和沙门氏菌均有抑菌作用，其对大肠杆菌的抑菌机制包括但不限于破坏菌体的细胞膜和细胞壁结构。可为白芨潜在价值的开发和利用提供依据。关键字：白芨；多糖；滤纸片扩散法；抑菌活性；抑菌机制StudyonantibacterialactivityandmechanismofbletillastriatapolysaccharideontwocommonpathogenicbacteriaAbstract:With

bletilla

as

raw

materials,

bletilla

polysaccharide

was

extracted

by

alkaline

extraction

method,

after

the

refined

papain

by

phenol

-

sulfuric

acid

method

of

bletilla

polysaccharide

content

in

the

extract,

then

using

filter

diffusion

method

for

e.

coli

and

salmonella

series

concentration

gradient

bacteriostatic

test,

determine

the

bletilla

polysaccharide

bacteriostatic

effect

of

two

kinds

of

common

pathogens.then

the

antibacterial

mechanism

of

bletilla

polysaccharide

was

deduced

by

measuring

the

electrical

conductivity

alkaline

phosphatase

and

protein

content

of

e.

coli

culture

solution

treated

with

bletilla

polysaccharide.

The

results

showed

that

bletilla

striata

polysaccharide

had

antibacterial

effect

on

both

escherichia

coli

and

salmonella,its

antibacterial

mechanism

against

escherichia

coli

includes

but

is

not

limited

to

the

destruction

of

cell

membrane

and

cell

wall

structure,whichcanprovideabasisforthedevelopmentandutilizationofbletillae.Keywords:Bletilla;Polysaccharide;Ffilterdiffusion;Bacteriostaticactivity;Antibacterialmechanism白芨为多年生草本植物，属兰科白芨属，主要产地在我国广西、贵州、四川、云南、陕西南部等，具有广泛的药用价值和观赏价值。在我国，白芨入药已有上千年的历史，中药白芨是白芨的干燥块茎，而其发挥药效的主要成分是白芨胶质。已有研究表明，白芨胶质主要成分为大分子杂多糖，由葡萄糖和甘露糖以一定比例通过β-糖苷链聚合而成，结构复杂，具有较强粘性的物理性质，并具有抑菌，止血，抗肿瘤，抗氧化，免疫调节，促进创面愈合等生物学活性。作为一种廉价易得的高分子材料，白芨多糖在许多领域都具有广泛的应用，例如，在食品领域可用作药膳，也可通过制成复合液利用其抗氧化性用于水果的运输和储藏，保持果实的良好品质；在临床方面可用于止血和促进术后创面愈合；在化妆品领域也可利用其抗氧化活性制成相关产品；同时，白及胶具有的较强粘性使其在新型高分子材料方面也有很好的应用前景。近年来，关于白芨多糖的研究增多，但主要还是其在临床和作为高分子材料方向的应用，而对白芨多糖抑菌活性的研究较少。本文主要研究白芨多糖对两种常见致病菌的抑菌活性及其对大肠杆菌的抑菌机制，可对白芨在抑菌方向的开发利用提供参考。1.仪器、材料与试剂1.1仪器恒温干燥箱、小型粉碎机、分析天平、恒温水浴锅、电炉、恒温培养箱、高压灭菌锅、电导率仪、分光光度仪均由成都市青羊区疾病预防控制中心提供。1.2材料云南白芨，取自云南省文林市古木镇，大肠杆菌和沙门氏菌由成都市青羊区疾病预防控制中心提供。1.3试剂蒸馏水，实验室自制；葡萄糖标准品、木瓜蛋白酶；硫酸、苯酚、氢氧化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钾、氯化钠、乙醇均为AR级；普通营养琼脂；LB液体培养基；诺福杀菌剂；碱性磷酸盐试剂盒；考马斯亮蓝G-250；磷酸二氢钾；磷酸氢二钠；氯化钠；氯化钾。2.方法2.1材料的准备取完整无损的白芨种球于流水下洗净，切片后置于恒温干燥箱中，52℃下烘48h至无水分。将干燥后的白芨片经小型粉碎机粉碎后得白芨粉。2.2白芨多糖提取称取白芨粉80g，加20倍量体积ph=10的氢氧化钠溶液，在恒温水浴锅中于80℃下浸提4h。提取液滤过之后取上清，蒸发浓缩至稠膏状，加1倍体积的85%乙醇4℃沉淀8h，过滤之后55℃干燥，即得粗多糖。2.3多糖精制称取白芨粗多糖12g，溶于200ml蒸馏水中，加入精密称取的0.060g木瓜蛋白酶，将待水解液调成ph=7，在恒温水浴锅中于55℃水解3h。酶解完成后在水解液中加入2倍体积85%乙醇4℃沉淀8h，过滤干燥后得白芨多糖。2.4多糖含量测定2.4.1标准曲线的制作准确称取葡萄糖标准品，配制成2.5g/L的标准溶液。分别量取葡萄糖标准溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9ml于比色管中，再各加1ml的5%苯酚溶液和5ml浓硫酸，用蒸馏水定容至25ml刻度线，震荡摇匀后静置30min，在490nm波长下测其OD值。以葡萄糖标准溶液浓度（X，ug/ml）为横坐标，以OD值（Y）为纵坐标，得出线性方程与相关系数分别为Y=0.010X+0.006，R2=0.999，表明线性关系良好。2.4.2白芨多糖含量测定精密称取干燥的白芨多糖3.00g，加入适量蒸馏水溶解后定容至100ml，配成样品溶液。吸取1ml样品溶液于比色管中，再加1ml的5%苯酚溶液和5ml浓硫酸，用蒸馏水定容至25ml刻度线，震荡摇匀后静置30min，在490nm波长下测其OD值。将OD值带入回归方程，得其浓度。通过白芨多糖含量计算公式W（%）=（样品浓度×样品定容体积/样品质量）×100求得精制后的白芨多糖中多糖含量。2.5抑菌活性试验2.5.1菌悬液的制备取大肠杆菌和沙门氏菌菌株，接种到两支普通营养琼脂斜面上，37℃培养24h后，以1.0号麦氏浊度标准管为对照，用接种环从斜面上挑菌至20ml无菌生理盐水中制成菌悬液，菌悬液中细菌数约为3×108个/ml。2.5.2滤纸片的制备用打孔器制作直径为1cm的滤纸片，置于锥形瓶中高压灭菌。精密称取精制后的白芨多糖2.00g溶于20ml无菌生理盐水中，稀释成1:1、1:10、1:100、1:500的浓度梯度，同时用无菌生理盐水做阴性对照，用稀释10倍的诺福杀菌剂做阳性对照。将灭菌后的滤纸片置于上述浓度梯度的白芨多糖溶液和阴阳性对照中，于冰箱中浸泡过夜后取出沥干多余溶液，密封保存备用。2.5.3接种在无菌条件下吸取0.5ml菌液，注入普通营养琼脂平板中，用无菌涂布器涂匀，将不同浓度多糖溶液浸泡过及阴阳性对照的滤纸片置于平皿上，用镊子按压，使滤纸片紧贴于培养基上。每个浓度梯度设置一个平行，置于37℃恒温培养箱中培养2天，观察菌落生长情况，有无抑菌圈的形成。2.6抑菌机制试验2.6.1对数生长期细菌的培养用接种环挑取一环复苏后培养的大肠杆菌菌液（因2.5抑菌活性试验结果表明白芨多糖对大肠杆菌的抑菌活性较好，所以抑菌机制试验采用大肠杆菌做目标菌）于Luria-Bertani液体培养基（以下简称LB液体培养基）中，摇床震荡培养2h后，以LB液体培养基做空白对照，每隔30min测其OD600，其OD600在0.35-0.6之间的时期为大肠杆菌的对数生长期。2.6.2细胞膜通透性试验将白芨多糖用适量蒸馏水溶解后过滤除菌，加入到LB液体培养基中使其浓度为50mg/ml。将处于对数生长期的大肠杆菌菌液通过1.0号麦氏浊度管和LB液体培养基调整其菌液浓度为3×108CFU/ml后，转入上述白芨多糖-LB液体培养基中震荡培养，分别于0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h时通过电导率仪测其电导率，同时以不加白芨多糖的培养基为对照。2.6.3细胞壁通透性试验将白芨多糖用适量蒸馏水溶解后过滤除菌，加入到LB液体培养基中使其浓度为50mg/ml。将处于对数生长期的大肠杆菌菌液通过1.0号麦氏浊度管和LB液体培养基调整其菌液浓度为3×108CFU/ml后，转入上述白芨多糖-LB液体培养基中震荡培养，分别于0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h时按照碱性磷酸酶试剂盒说明书进行处理，在410nm波长下测其吸光度值，同时以不加白芨多糖的培养基为对照。2.6.4菌液蛋白质浓度试验2.6.4.1Bradford浓染液的配制将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后用蒸馏水补充至1000ml。于4℃冰箱中冻存备用。2.6.4.2蛋白质浓度测定将白芨多糖用适量蒸馏水溶解后过滤除菌，加入到LB液体培养基中使其浓度为50mg/ml。将处于对数生长期的大肠杆菌菌液通过1.0号麦氏浊度管和LB液体培养基调整其菌液浓度为3×108CFU/ml后，转入上述白芨多糖-LB液体培养基中震荡培养，分别于0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h时取3ml菌液加入2ml按1:5用蒸馏水稀释的Bradford浓染液结合溶液，作用2min后，在595nm波长下测其吸光度值，以不加白芨多糖的培养基为对照。同时考虑到前面提取的白芨多糖中可能存在蛋白质对试验结果造成影响，在相同条件下通过Bradford法测白芨多糖的吸光度值做空白以消除影响。3.结果3.1白芨多糖提取及含量测定3.1.1葡萄糖标准曲线表1.葡萄糖标准系列试剂0123456789葡萄糖浓度0102030405060708090吸光度0.00130.10550.22100.32660.44680.52830.64750.74890.85040.9561图1.葡萄糖标准曲线3.1.2多糖含量采用碱水提取法从80g白芨粉中提取白芨粗多糖13.27g，经木瓜蛋白酶精制后得白芨多糖10.78g,通过苯酚-硫酸法测得精制后的白芨多糖含量为53.2%。3.2抑菌活性采用滤纸片法对大肠杆菌和沙门氏菌进行白芨多糖的抑菌活性试验，以稀释10倍的诺福杀菌剂做阳性对照，以无菌生理盐水做阴性对照。试验结果表明，当白芨多糖在53.2mg/ml即多糖溶液1:1稀释时对两种菌均有抑制作用，均出现明显的抑菌环，且两种细菌的抑菌环大小不同。当白芨多糖在5.3mg/ml及更低浓度时，培养基上未出现明显的抑菌环。推断白芨多糖在高浓度时对细菌的生长有抑制作用，且抑菌活性随着浓度的降低而减弱，并且对不同的细菌抑菌活性表现不同。（因白芨多糖对大肠杆菌的抑菌活性强于沙门氏菌，所以后续试验采用大肠杆菌）图2.阳性对照图3.阴性对照图4.大肠杆菌（1:1稀释度）图5.沙门氏菌（1:1稀释度）3.3细胞膜通透性试验细菌细胞膜是细菌的保护屏障。当细菌遇到不利生长条件或是抑菌剂的作用时，细菌细胞膜会遭受破坏导致其半透性丧失，菌体内部电解质如K+大量渗入至培养液使培养液的电导率上升，因此，菌液电导率的变化反映了细菌细胞膜通透性的变化情况。图6.细胞膜通透性试验图6是大肠杆菌经白芨多糖处理后其LB液体培养基的电导率变化情况。经统计分析，试验组和对照组的电导率值具有显著性差异（P＜0.05），说明白芨多糖作用于大肠杆菌会破坏其细胞膜结构，导致胞内电解质大量渗入胞外。3.4细胞壁通透性试验细菌细胞壁具有抗渗透压及保持菌体形状等作用，在细菌细胞膜和细胞壁之间存在碱性磷酸酶，在细菌的正常生长繁殖过程中，碱性磷酸酶不能通过细胞壁渗透到胞外。当细胞壁遭受一定程度的破坏后，碱性磷酸酶便能通过透性增加的细胞壁渗透到胞外。因此，通过检测细菌培养液中碱性磷酸酶的含量变化可以判断细胞壁受损的情况。图7.细胞壁通透性试验图7反映的是大肠杆菌经白芨多糖处理后其LB液体培养基中碱性磷酸酶含量的变化情况。经统计分析，试验组和对照组的碱性磷酸酶含量具有显著性差异（P＜0.05），说明白芨多糖作用于大肠杆菌会破坏其细胞壁结构，导致细胞壁通透性增加，从而使碱性磷酸酶通过细胞壁渗透到胞外。3.5培养液蛋白质浓度试验蛋白质是细胞内的大分子物质，正常情况下，蛋白质不可能通过细胞膜和细胞壁渗透到细胞外。通过检测大肠杆菌培养液中蛋白质含量的变化，可以反映菌体细胞膜和细胞壁的受损情况。图8.蛋白质浓度试验图8是大肠杆菌经白芨多糖处理后其LB液体培养基中蛋白质浓度的变化情况，经统计分析，试验组和对照组的蛋白质含量具有显著性差异（P＜0.05），说明白芨多糖会使大肠杆菌胞内的蛋白质外渗，进一步说明白芨多糖会对大肠杆菌的细胞膜和细胞壁的通透性造成影响。4.结论报道表明，很多植物的多糖均具有抑菌作用。本次试验通过滤纸片扩散法对常见致病菌大肠杆菌和沙门氏菌进行抑菌活性试验，结果表明，白芨多糖浓度在50mg/ml左右时对两种致病菌均具有抑菌作用，并且对两种细菌的抑菌活性强度不同。药物的抑菌作用包括损伤细菌的细胞膜，干扰细菌细胞壁的合成，抑制细菌核酸、蛋白质的合成，破坏胞内蛋白质的结构等。本次试验通过白芨多糖对大肠杆菌LB液体培养基中电导率、碱性磷酸酶和蛋白质含量的变化情况分析了白芨多糖对大肠杆菌的抑菌机制，结果表明，白芨多糖能通过破坏细菌细胞膜和细胞壁的结构，改变其渗透压，从而抑制细菌的生长，与已有的研究结果基本一致。而白芨多糖是否存在其他的抑菌机制有待进一步的研究。参考文献:[1]刘长命,王洁.白芨多糖提取的工艺优化[J].商洛学院学报,2018,32(4):2-4.[2]朱昌玲,张锋伦.几种天然产物的抑菌性能研究[J].中国野生植物资源,2017,36(5):2-3.[3]蔡年春,胡仁火,李亚男,王欢,王娟.六种中草药提取液的抑菌杀菌作用研究[J].咸宁学院学报,2009,2(3):1-2.[4]林福林,杨昌云,杨薇薇,黄美蓉,庞素秋.中药白芨的现代研究概况[J].中国医院药学杂志,2013,33(7):571-572.[5]陶阿丽,金耀东,刘金旗,张国升.中药白芨化学成分、药理作用及临床应用研究进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白芨多糖提取工艺及其抑菌机制研究进展摘要：本文综述近年来白芨多糖提取工艺及其抑菌机制的研究进展，主要从白芨多糖的提取工艺、抑菌机制和白芨多糖在其他领域的应用三方面展开。

关键字：白芨多糖；提取；抑菌机制Research

progress

on

extraction

technology

and

antibacterial

mechanism

of

bletilla

striata

polysaccharideAbstract:

this

paper

reviews

the

research

progress

of

bletilla

bletilla

polysaccharide

extraction

technology

and

antibacterial

mechanism

in

recent

years,

mainly

including

the

extraction

technology,

antibacterial

mechanism

and

application

of

bletilla

bletilla

polysaccharide

in

other

fields.Key

words:

bletilla

polysaccharide;

Extraction;

Bacteriostatic

mechanisms白芨为多年生草本植物，属兰科白芨属，主要产地在我国广西、贵州、四川、云南、陕西南部等，具有广泛的药用价值和观赏价值。在我国，白芨入药已有上千年的历史，中药白芨是白芨的干燥块茎，而其发挥药效的主要成分是白芨胶质。已有研究表明，白芨胶质主要成分为大分子杂多糖，由葡萄糖和甘露糖以一定比例通过β-糖苷链聚合而成，结构复杂，具有较强粘性的物理性质，并具有抑菌，止血，抗肿瘤，抗氧化，免疫调节，促进创面愈合等生物学活性。作为一种廉价易得的高分子材料，白芨多糖在许多领域都具有广泛的应用，例如，在食品领域可用作药膳，也可通过制成复合液利用其抗氧化性用于水果的运输和储藏，保持果实的良好品质；在临床方面可用于止血和促进术后创面愈合；在化妆品领域也可利用其抗氧化活性制成相关产品；同时，白及胶具有的较强粘性使其在新型高分子材料方面也有很好的应用前景。本文从从白芨多糖的提取工艺、抑菌机制和白芨多糖在其他领域的应用三方面展开综述。1.白芨多糖的提取工艺1.1提取1.1.1水提-醇沉法该方法是白芨多糖提取的常用工艺，方法简单。首先将白芨块茎洗净干燥粉碎，加入蒸馏水搅拌均匀后放置过夜，次日加水并于60℃水浴锅中加热提取。提取完成后将滤液浓缩至粘稠状加乙醇沉淀，过滤得到沉淀物后洗净干燥即为白芨粗多糖。1.1.2碱水提取法该方法与水提-醇沉法类似。不同之处是提取液采用ph=10的氢氧化钠溶液，该方法的提取效率要高于水提-醇沉法。1.1.3醇提法醇提法同样与水提-醇沉法类似。不同之处是提取液采用80%的乙醇，该方法提取效率优于以上两种方法。1.1.4逆流提取法逆流提取法适合规模化的白芨多糖提取，单罐容量500L，每批投料30kg。最适的提取工艺为料液比1:14、提取时间3h、提取温度60℃，提取完成后同样采用醇沉干燥得粗多糖。在实验室条件下，逆流提取可通过小型回流装置实现。1.1.5超声波提取法超声波可造成植物细胞的破裂，从而有利于植物细胞内有效成分的溶出，相比于传统浸提法具有操作简便，提取效率更高的特点。该方法首先用石油醚脱脂，再用蒸馏水超声提取。后面的步骤与传统方法类似。该方法的最佳提取参数为超声时间50min，温度60℃，超声波频率400W，料液比1:50。1.1.6酶解法该方法主要利用纤维素酶提取白芨多糖，首先将纤维素酶活化，再将一定量的白芨粉末浸泡于两倍体积的蒸馏水，接着将活化好的酶和浸泡的白芨粉置于磷酸盐缓冲液中50℃酶解，之后同样采用醇沉干燥得白芨粗多糖。除了采用纤维素酶酶解外，还可采用酸性蛋白酶、果胶酶等进行酶解。1.2精制精制的主要目的是去除粗多糖中的蛋白质。1.2.1三氯乙酸法该方法时往白芨多糖中加入10%的三氯乙酸，将ph调制3.0后静置过夜，之后离心取上清透析、干燥的白芨多糖。1.2.2氯仿-正丁醇法于白芨粗多糖溶液中加入氯仿-正丁醇（4:1）试剂，振荡离心后取水层干燥得白芨多糖。1.2.3蛋白酶精制该方法的蛋白酶加入量为5mg/g底物，水解时间120min,水解体系按所选用蛋白酶的最适合=体系。可用蛋白酶有木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，糜胰蛋白酶，碱性蛋白酶等。2.抑菌机制研究报道表明，很多植物的多糖均具有抑菌作用。药物的抑菌作用包括损伤细菌的细胞膜，干扰细菌细胞壁的合成，抑制细菌核酸、蛋白质的合成，破坏胞内蛋白质的结构等。2.1电导率测定细菌细胞膜是细菌的保护屏障。当细菌遇到不利生长条件或是抑菌剂的作用时，细菌细胞膜会遭受破坏导致其半透性丧失，菌体内部电解质如K+大量渗入至培养液使培养液的电导率上升，因此，菌液电导率的变化反映了细菌细胞膜通透性的变化情况。该方法是将白芨多糖处理的细菌培养液经不同培养时间培养后用电导率仪测其电导率，通过绘制电导率变化曲线判断其细胞膜受损情况。2.2碱性磷酸酶试验细菌细胞壁具有抗渗透压及保持菌体形状等作用，在细菌细胞膜和细胞壁之间存在碱性磷酸酶，在细菌的正常生长繁殖过程中，碱性磷酸酶不能通过细胞壁渗透到胞外。当细胞壁遭受一定程度的破坏后，碱性磷酸酶便能通过透性增加的细胞壁渗透到胞外。因此，通过检测细菌培养液中碱性磷酸酶的含量变化可以判断细胞壁受损的情况。该方法与电导率试验类似，只不过其测定碱性磷酸盐的方法采用快速试剂盒和或酶标仪。2.3培养液蛋白质含量试验蛋白质是细胞内的大分子物质，正常情况下，蛋白质不可能通过细胞膜和细胞壁渗透到细胞外。通过检测大肠杆菌培养液中蛋白质含量的变化，可以反映菌体细胞膜和细胞壁的受损情况。该方法的分析步骤与前两种方法类似，其蛋白质测定方法可采用考马斯亮蓝法。三种方法可用于论证白芨多糖的抑菌机制可能为破坏菌体的胞膜和胞壁。3.白芨多糖的应用3.1食品领域作为一种传统的中药，白芨可入药，也可用作药膳。因其具有抗氧化的作用，可将白芨多糖制成试剂用于果蔬的运输和保存。3.2医学领域白芨多糖在临床、医学等领域也同样有应用。其可促进创面愈合的作用使其可用于术后创口愈合，其抗肿瘤的能力可用于临床治疗癌症的研究，其具有的免疫调节作用使其同样能应用于临床增强免疫力方面。参考文献：[1]刘长命,王洁.白芨多糖提取的工艺优化[J].商洛学院学报,2018,32(4):2-4.[2]朱昌玲,张锋伦.几种天然产物的抑菌性能研究[J].中国野生植物资源,2017,36(5):2-3.[3]蔡年春,胡仁火,李亚男,王欢,王娟.六种中草药提取液的抑菌杀菌作用研究[J].咸宁学院学报,2009,2(3):1-2.[4]林福林,杨昌云,杨薇薇,黄美蓉,庞素秋.中药白芨的现代研究概况[J].中国医院药学杂志,2013,33(7):571-572.[5]陶阿丽,