CN120081811B 一种脂滴特异性荧光探针及其制备方法和应用 （四川大学华西医院）

(19)国家知识产权局(12)发明专利(10)授权公告号CN1200818(65)同一申请的已公布的文献号(73)专利权人四川大学华西医院地址610000四川省成都市武侯区国学巷37号庄伟华柴正张颖(74)专利代理机构成都正德明志知识产权代理有限公司51360专利代理师黄鑫G01N21/64(2006.01)(54)发明名称应用本发明公开了一种脂滴特异性荧光探针及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域；本发明提供了脂滴特异性荧光探针的结构式，且在制备时，将2-甲醛-6-(二乙氨基)苯并[B]呋喃与丙二腈衍生物在碱环境作用下制备了一类具备扩展的π共轭体系的荧光探针；这类荧光探针均具有分子内电荷转移(TICT)特性，在水溶液中荧光极其微弱，而在葵花籽油中荧光显著增强，具有显著的斯托克斯位移、优良的生物相容性、卓越的光稳定性以及高信噪比。同时，该荧光探针在细胞脂滴成像方面展现出极高的灵敏度和信Bodipy493/503实施例1产品合并21.一种脂滴特异性荧光探针，其特征在于，其结构式为以下的其中一种：02.权利要求1所述的脂滴特异性荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将2-甲醛-6-(二乙氨基)苯并[B]呋喃和丙二腈衍生物溶于溶剂中，然后在碱作用下反所述丙二腈衍生物为丙二腈或1,3茚满二酮。3.如权利要求2所述的脂滴特异性荧光探针的制备方法，其特征在于，所述2-甲醛-6-(二乙氨基)苯并[B]呋喃和丙二腈衍生物摩尔比为1:5-5:1。4.如权利要求2所述的脂滴特异性荧光探针的制备方法，其特征在于，所述碱和2-甲醛-6-(二乙氨基)苯并[B]呋喃摩尔比为1:4000-1:200。5.如权利要求2所述的脂滴特异性荧光探针的制备方法，其特征在于，所述碱为三乙一种。6.如权利要求2所述的脂滴特异性荧光探针的制备方法，其特征在于，在0-180℃温度下反应1-72h,对反应液进行浓缩处理，柱色谱法分离纯化。7.如权利要求2所述的脂滴特异性荧光探针的制备方法，其特征在于，所述溶剂为水、苯、均三甲苯、叔戊醇、1,4-二氧六环、1,2-二氯乙烷、N,N-二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺中的至少一种。8.权利要求1所述的脂滴特异性荧光探针在制备细胞脂滴成像和/或脂滴特异性标记试剂方面的应用。3一种脂滴特异性荧光探针及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种脂滴特异性荧光探针及其制备方法和应用。背景技术[0002]脂滴作为动态的细胞内细胞器，在脂质储存和代谢中发挥着关键作用。研究表明，脂滴的异常积累与多种代谢紊乱密切相关，如II型糖尿病、脂肪肝疾病和动脉粥样硬化等。其中，动脉粥样硬化是一种慢性全身性进行性疾病，已成为全球心血管疾病发病率和死亡率的主要原因。动脉粥样硬化病变的发展伴随着持续的脂质沉积，进而促进斑块的形成并最终导致急性心血管事件。对脂滴的可视化在临床干预中显示出巨大潜力。通过在细胞和组织水平提供有价值的信息，脂滴成像将有助于动脉粥样硬化的早期诊断和治疗，以及预防与动脉粥样硬化相关的急性心血管事件。[0003]近年来，针对脂滴的荧光成像因其灵敏快捷、非侵入性、高时空分辨率、实时原位等独特优势受到了广泛关注，在临床转化方面表现出广阔的应用前景。近年来，已经开发了各种用于脂滴成像的荧光染料。其中，尼罗红(Nilered)和BODIPY493/503是目前广泛使用的商业荧光染料。然而，尼罗红因其特异性低和发射光谱宽而受到限制，信噪比较低。针在水性环境和脂滴环境中均表现出强发射，生物成像应用有限。因此，具有高信噪比和大斯托克斯位移的新型脂滴特异性荧光探针还需要进一步开发。发明内容[0004]为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种脂滴特异性荧光探针及其制备方法和应用，该具备扩展的π共轭体系的荧光探针在细胞脂滴成像方面，展现出极高的灵敏度和信噪比，能够轻松实现脂滴的动态精准靶向成像，有效解决了现有荧光探针信噪比低、生物成像应用有限的问题。[0005]本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种脂滴特异性荧光探针，其结构式为以下的其中一种： 4[0007]本发明还提供了上述脂滴特异性荧光探针的制备方法，包括以下步骤：[0008]将2-甲醛-6-(二乙氨基)苯并[B]呋喃和丙二腈衍生物溶于溶剂中，然后在碱作用[0009]进一步，2-甲醛-6-(二乙氨基)苯并[B]呋喃和丙二腈衍生物摩尔比为1:5-5:1。[0010]进一步，碱和2-甲醛-6-(二乙氨基)苯并[B]呋喃摩尔比为1:4000-1:200。[0011]进一步，丙二腈衍生物为丙二腈、1,3茚满二酮、(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈、2-(3-氰基-4,5,5-三甲基呋喃-2(5H)-亚甲基)丙二腈、(E)-2-异氰基-2-(3-氧代-2,3-二氢-1H-茚-1-亚基)乙腈和(E)-2-(3-(氰基(异氰基)亚甲基)-2,3-二氢-1H-茚-1-亚基)丙二腈中的其中一种。氨基锂和碳酸氢钠中的至少一种。[0013]进一步，在0-180℃温度下反应1-72h,对反应液进行浓缩处理，柱色谱法分离纯二甲基甲酰胺和N,N-二甲基乙酰胺中的至少一种。[0016]本发明还提供了上述脂滴特异性荧光探针在细胞脂滴成像和/或脂滴特异性标记方面的应用。[0017]本发明具有以下有益效果：[0018]1、本发明通过用苯并呋喃片段作为π桥作为供电基团，用丙二腈及其衍生物作为电子受体基团，制备具有推拉电子特征的D-A型荧光分子，表现为显著的斯托克斯位移、优良的生物相容性、卓越的光稳定性以及高信噪比，有助于减少背景荧光干扰，提高脂滴成像灵敏度。5附图说明[0032]在室温下，将2-甲醛-6-(二乙氨基)苯并[B]呋喃(0.50g,2.30mmol)与丙二腈[0036]在室温下，将2-甲醛-6-(二乙氨基)苯并[B]呋喃(0.50g,6[0040]1、将实施例1和实施例2所得产物分别溶解在二甲基亚砜中，配置成10mM的存储[0041]由图3和图4可知，随着溶剂极性的增加，本发明的荧光探针在不同极性溶剂中的最大发射波长向较长波长(即红色端)移动；这很可能归因于扭转分子内电荷转移(TICT)效[0042]2、将实施例1和实施例2所得产物分别溶解在二甲基亚砜中，配置成10mM的存储[0043]由图5和图6可知，本发明的荧光探针在水溶液中几乎没有荧光，而在葵花籽油中的荧光强度显著升高。这种仅在油脂环境下出现荧光增强的特性，极大程度减少了荧光探针自身带来的干扰，有利于提高信噪比。[0044]3、将HeLa细胞接种到玻底皿中，别将实施例1和实施例2所得荧光探针配置成10mM的二甲基亚砜储存液，用培养基稀释成5色荧光染料进一步孵育30min以便标记脂滴；通过三次PBS洗涤去除未结合的染料，并利用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察荧光探针脂滴靶向成像能力，其结果如图7和图8所示。[0045]由图7和图8可知，本发明的荧光探针发出的红色荧光与BODIPY493/503的绿色荧光实现了良好的重叠；这一现象充分表明，本发明的荧光探针适用于脂滴的生物成像研究。[0046]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和三三88887--二8图28图图附书明说3/5页3/5页图36006509葵花籽油葵花籽油水一