（正式版）DB65∕T 4495-2022 《牛布鲁氏菌A19-△VirB12分子标记疫苗鉴别诊断方法》

牛布鲁氏菌A19-△VirB12分子标记疫苗I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构本文件由新疆畜牧科学院兽医研究所(新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心)提出。本文件起草单位：新疆畜牧科学院兽医研究所(新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心)、新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站。庭辉、范伟兴、孙翔翔、田莉莉。本文件实施应用中的疑问，请咨询新疆畜牧科学院兽医研究所(新疆畜牧科号)、新疆畜牧科学院兽医研究所(新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心)(乌鲁木齐市新市区冬融街726号)、新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站(乌鲁木齐市米东区米东南路2188号红光雅居7号楼)、新疆维吾尔自治区市场监督管理局(乌鲁木齐市新华南路167号)。新疆维吾尔自治区畜牧兽医局联系电话传真邮编：830004新疆畜牧科学院兽医研究所(新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心)联系电话传真邮编：830013新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话传真：本文件的发布机构提请注意，申明符合本文件时，可能涉及到国家发明专利“一种牛布病A19-△VirB12疫苗的血清学检测方法(发明专利号：CN202010286353.8)”与国家发明专利“鉴定布鲁氏菌病疫苗株与野毒株的引物、探针及试剂盒(发明专利号：CN202010819161.9)”相关专利的使用。本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任务立场。该专利持有人已向本文件的发布机构承诺，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的申明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：专利“一种牛布病A19-△VirB12疫苗的血清学检测方法”持有人姓名：易新萍、叶锋、马晓菁、钟旗、刘丽娅、谷文喜、谢彩云、张旭、薛晶、李静、古努尔·吐尔逊、李岩。地址：新疆乌鲁木齐市新市区冬融街726号。刘丽娅、易新萍、谢彩云、陈荣贵、刘帅、钟旗、古丽努尔·吐尔逊、张旭。地址：新疆乌鲁木齐市新市区冬融街726号。请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责1牛布鲁氏菌A19-△VirB12分子标记疫苗本文件规定了牛布鲁氏菌A19-△VirB12疫苗株鉴别诊断方法的术语和定义、生物安全要求、仪器、设备和试剂、间接酶联免疫吸附试验、PCR检测方法的要求。本文件适用于新疆境内布鲁氏菌A19-△VirB12疫苗免疫抗体阳性牛与布鲁氏菌感染抗体阳性牛的鉴别诊断。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18646—2018动物布鲁氏菌病诊断技术GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。布鲁氏菌病brucellosis由布鲁氏菌属(Brucella)细菌引起牛、羊、猪、鹿、犬等哺乳动物和人类共患的一种传染病，我国将其列为二类动物疫病，以下简称布病。敲除牛布鲁氏菌A19疫苗株VirB12基因后获得的具有人为标记的牛种布鲁氏菌分子标记疫苗。自然感染布鲁氏菌后，在布病血清学或病原学检测中呈阳性的牛。布鲁氏菌病血清学阳性牛serologicallypositivecattleofbrucellosis布鲁氏菌病血清学检测抗体阳性牛，包括布鲁氏菌感染牛和布鲁氏菌A19-△VirB12疫苗免疫牛。荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。被检测物吸收掉的光密度。24缩略语PCR:聚合酶链式反应(PolymeraseChainRedNTP:脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxy-ribonucleosideTriphosphaiELISA:间接酶联免疫吸附试验(indirectEnzyme-LinkedImmunoSorbentAssay)BSL:生物安全等级(BiologicalSafetyLevel)Taq:水生栖热菌(ThermusAquaticus)PBST:含0.5%吐温-20的磷酸缓冲盐溶液(PhosphateBufferedSalineTween-20)5.1分离或操作布鲁氏菌活菌实验在生物安全三级(BSL-3)实验室内进行。5.2疑似布鲁氏菌感染待检样本，如乳样、抗凝全血、阴道分泌物、流产胎儿、肛拭子、组织样品、精液等检测操作在生物安全二级(BSL-2)实验室内进行。5.3不含布鲁氏菌病原的待检样品，检测操作在生物安全一级(BSL-1)实验室内进行。5.4使用过的实验用品应按照GB19489中规定的对废弃物的处理要求进行无害化处理。6仪器、设备和试剂6.2试剂6.2.1商品化的牛布鲁氏菌病标准阳性血清和牛布鲁氏菌病标准阴性血清。6.2.2布鲁氏菌病虎红平板凝集试验抗原6.2.4商品化实时荧光2×qPCRmix(探针法)(含DNA聚合酶、dNTP、Mg²+)。6.2.5商品化的DNA提取试剂盒。6.2.6生理盐水：0.9%的氯化钠6.2.750×TAE电泳缓冲液(见附录A中A.1)。6.2.8DNAmarker(包含2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp以及250bp)。6.2.9布鲁氏菌VirB12蛋白包被酶标板(见附录B)。6.2.10抗原包被缓冲液(见附录A中A.2)。6.2.11商品化的磷酸缓冲盐溶液(1×PBS)。6.2.12商品化含0.5%吐温-20的磷酸盐缓冲液(1×PBST)。6.2.14商品化的TMB显色液。6.2.15商品化的iELISA反应终止液。36.3.1布鲁氏菌基因组DNA阳性质控：商品化牛布鲁氏菌A19-△VirB12疫苗株基因组DNA、商品化牛布鲁氏菌A19株(菌种阴性质控为灭菌水。布病血清学阳性牛，或竞争酶联免疫吸附试验(cELISA)结果判定为布病血清学阳性，进行编号登记7.2.1在96孔U型聚苯乙烯板上，平行设置标准阳性血清(2孔)、标准阴性血清(2孔)和空白对照(1孔),用含0.5%吐温-20的磷酸盐缓冲液(以下简称“1×PBST”)将标准阳性血清、标准阴性血清和7.2.2取已封闭的酶标板恢复至室温，用1×PBST缓冲液洗涤1次。以100μL/孔按顺序加入7.2.1中稀释好的血清，用封板膜封板，37℃温箱孵育1h。7.2.3用1×PBST缓冲液将辣根标记兔抗牛二抗稀释8000倍待用。辣根标记兔抗牛二抗100μL/孔，37℃温箱孵育30min。显色液，室温避光显色10min～154布鲁氏菌感染，当S/P值≤60%时，判定检测样品为牛布鲁氏菌A19-△VirB12疫苗免疫。8PCR检测方法采集布病血清学阳性牛的乳样，弃去前三把乳汁后，将乳汁挤入15mL无菌带盖离心管中，记录并登记耳标号等采样信息，置于(-20±2)℃保存备检。的1.5mL无菌带盖离心管(以下简称“Ep管”)中，记录登记耳标号等采样信息，置于(-20±2)℃保存取布病血清学阳性牛的流产物或胎衣(约0.3g)置于含500μL生理盐水的1.5mL无菌Ep管中，记录并登记耳标号等采样信息，置于(-20±2)℃保存备检。记编号等采样信息，置于(-20±2)℃保存备检。对待检样品进行(65±2)℃,灭活处理60min后，取200μL待检样品按照商品化DNA提取试剂盒说明书操作提取样品DNA,置于(-20±2)℃备用。8.3常规PCR检测8.3.1常规PCR检测引物a)IF:5'-GTCAGCTTCTCb)IR:5'-CGTCGGAACCGCTCTATAGGTC-3'。8.3.2常规PCR检测反应体系因组DNA1.0μL作为标记苗对照、商品化牛布鲁氏菌A19株基因组DN8.3.3常规PCR检测反应程序595℃预变性10min,94℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环，72℃延伸10min。当阳性对照出现731bp扩增条带，见附录C中图C.1(电泳道1);A19-△VirB12标记疫苗对照出现236bp扩增条带，见附录C中图C.1(电泳道2);阴性对照未出现条带，见附录C中图C.1(电泳道3);即阳性对照、A19-△VirB12标记疫苗对照和阴性对照PCR反应均成立条件下，判定结果。如果阴性对照出现扩增条带，或阳性对照未出现预期大小的扩增条带，或A19-△VirB12标记疫苗对照未出现预期扩增条带，本次待测样品的PCR检测结果无效，应重新检测，并排除污染因素。阳性，即待测样品为布鲁氏菌感染，见附录C中图C.1(电泳道4);如待检样品PCR扩增产物电泳检测见附录C中图C.1(电泳道6);如待检样品PCR扩增产物电泳检测结果未出现扩增条带，则判定该待测中图C.1(电泳道7)。a)16S-F:5'-ACCCTTTACGCCb)16S-R:5’-AGc)16S-P:5’-FAM-AACAACGCT中设置阳性对照、阴性对照和标记疫苗对照。其中阳性对照为商品化牛布鲁氏菌A19株基因组DNA1.08.4.3实时荧光定量PCR反应程序将PCR反应管置于实时荧光定量PCR仪上，荧光参比设为NONE,荧光基团选择FAM,淬灭基团选择TAMRA。反应条件设置为95℃15min,95℃3s,65℃30s,共40个循环，样品和对照均设置两孔6读取每个样品Ct值，标准阳性对照有特异性扩增曲线且Ct值应≤40.0,见附录C中图C.2(1);标准阴性和标记疫苗对照无特异性扩增曲线并且无Ct值，见附录C中图C.2(5,6)则表明实时荧光定量待检样品实时荧光定量PCR检测无特异性扩增曲线且无Ct值，则判定为牛布鲁氏菌A19-△VirB12疫苗免疫牛，见附录C中图C.2(7);待检样品实时荧光定量PCR检测出现扩增曲线，且Ct值≤40.0,7(规范性)见表A.1。A.1.3使用液调至pH9.6,加去离子水定容至1L,室温保存。8 (规范性)a)根据布鲁氏菌A19的VirB12基因设计如下引物：1)VirB12F:5'-CATATGCGCACATTGGTTATGGTC-3′含NdeI酶切位点；2)VirB12R:5'-GTCGACTTACTTGCGTAAAATTTC-3’含SalI酶切位点。b)从牛种布鲁氏菌A19株提取细菌总DNA,以细菌总DNA为模板，进行聚合酶链反应，获得c)将VirB12蛋白基因转入原核表达载体pET-28a(+)中，获得重组表达载体；e)收集的VirB12抗原蛋白经8M尿素变性，组氨酸结合树脂柱纯化，复性得到纯化的VirB12g)弃去孔内液体，用1×PBST洗涤4次，按200μL/孔加入含有3%鱼皮胶的1×PBST,37℃孵育h)弃去孔内液体，用1×PBST洗涤4次，甩干后-80℃冻存待用。9PCR检测结果及判定