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实验三

病料的触片染色及细菌的分离培养

一.实验目的与要求1.培养无菌操作的意识2.掌握病料的正确触片及美兰染色方法3.掌握病料细菌分离的操作步骤及其分区划线二.实验仪器及材料1.仪器：恒温箱、显微镜等2.实验材料：培养基：麦康凯培养基、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）病料：猪肺、肝脏、脾脏等酒精灯、接种环、剪刀、接种环、镊子等染色液：美兰染色液三.内容与方法1.病料触片染色：灼烧剪刀、镊子从病料上剪取小块组织→→用新鲜切面在干净载玻片上轻触3～4个触面→→自然干燥→→美兰染色。2.美兰染色步骤：触片经过火焰固定→→滴加适量美兰染色液覆盖涂面→→染色3分钟→→晾干→→镜检→→菌体呈蓝色。用灭菌的烙刀（趁热）对病料的表面进行灭菌→→用灭菌的剪刀在病料上灭过菌的地方剪一切口→→接种环灭菌，从切口取细菌→→无菌操作进行平板分区划线→→用过的剪刀、镊子、烙刀、接种环等烧灼灭菌→→平板放入恒温箱中18-24小时→→观察培养后的细菌菌落性状。3.病料中细菌的分离培养：4.分区划线①右持接种环，烧灼冷却后，蘸取划线。②左手抓握琼脂平板，在酒精灯火焰左上方，使平板面向火焰，右手将已沾的病料接种环在琼脂表面分区划线③划线完毕，将接种环烧灼。④将平板倒扣并做标记，培养。划线及其结果分区划线有单菌落划线模示图有单菌落四.结果及分析讨论1病料触片染色结果及其分析2细菌培养结果及其分析培养基的制备1肉膏汤培养基成分：牛肉膏1g，蛋白胨1g，氯化钠1g，蒸馏水200mL。制法：将牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，加蒸馏水至200mL，矫正PH7.4～7.6,121.3℃灭菌20min即可.2营养琼脂培养基成分：牛肉膏1g，蛋白胨1g，氯化钠1g，琼脂粉5g，蒸馏水200mL。补充制法：将上述成份用水溶解后，矫正PH7.4～7.6,121.3℃灭菌20min即可，冷却到不烫手，倒平板。补充棉塞﹑棉球制备及玻璃器皿清洗1.棉塞制备：每人制一个2.棉球制备：每人制50个3.玻璃器皿清洗

2%盐酸浸泡过夜清水冲洗2次，烘干。参考课本227页。补充灭菌锅安全阀放气阀压力表设定时间温度按键盖子补充原理：在密闭的蒸锅内，蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

。补充注意：灭菌锅内冷空气要排除：原因空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度补充使用步骤1将内层灭菌桶取出，加入适量的水。2．放回灭菌桶，装入待灭菌物品。

3．加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。4.0.05MPa时切断电源排气

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