血清肿瘤标志物与高危型HPV检测在宫颈癌筛查中的比较研究

血清肿瘤标志物与高危型HPV检测在宫颈癌筛查中的比较研究 目录摘要第一章前言1.1HPV简介1.1.1HPV分型1.1.2本次实验第二章试剂与仪器2.1试剂2.2仪器第三章实验方法3.1HPV15型体检3.1.1标本、对照品的核酸裂解处理3.1.2试剂配制3.1.3加样3.1.4PCR扩增3.1.5质量控制3.1.6试验结果的计算3.2肿瘤标志物检测第四章实验结果4.1HPV15型体检结果4.2肿瘤标志物检测结果4.3综合比较4.4我的结论参考文献致谢血清肿瘤标志物与高危型HPV检测在宫颈癌筛查中的比较研究【摘要】随着时代的发展，人们生活水平的逐渐提高，各种疾病的发生率也在慢慢增加，人们的预防疾病意识也在增加。在各种疾病中，癌症是人们最不想看到的；尤其是在女性人群中，乳腺癌和宫颈癌是女性患病率最高的两大癌症，也是危险性最大的。为了提高宫颈癌筛查的准确性，减低误诊率，进行了血清肿瘤标志物与高危型HPV检测在宫颈癌筛查中的比较研究。方法：随机选取2019年3月在美康盛德检验所进行宫颈病变筛查的700例，进行两组实验。A、B组分别进行两次实验。A组700例，进行HPV15型检测；B组700例，进行血清肿瘤标志物检测（选用SCC及CA125）。【关键词】血清肿瘤标志物高危型HPV宫颈癌筛查诚信声明

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第一章前言1.1HPV的简介

HPV（Humanpapillomavirus）是引起女性宫颈癌、头颈部鳞状细胞癌等肿瘤的主要致病因子，其中，以女性宫颈癌发病率最高，是全球第二大女性杀手。

1.1.1HPV分型

HPV主要依据DNA进行分型，目前已发现130多种的HPV型别，至少40个型别可以感染生殖器官。根据不同型HPV与诱发肿瘤的危险性可将HPV分为低危型HPV和高危型HPV，低危型HPV包括HPV6、11、42、43、44等，高危型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等。

1.1.2本次实验本次实验是有关于高危型HPV的检测，我们采用的是HPV15型体检，其中15型包括15种高危型HPV（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82型）。通过荧光PCR法来判断这15种高危型HPV的阴阳性，来筛查宫颈癌，并得到HPV15型的阳性率。第二章试剂与仪器2.1试剂高危型人乳头瘤病毒（HPV）分型核酸测定试剂盒（荧光PCR法）High-riskHumanPapillomavirus(HPV)GenotypingRealtimePCR【检验原理】本试剂盒分别采用HPV15种型别的特异性引物及荧光探针，采用聚合酶链式反应（PCR）结合Taqman技术，对HPV15种型的特异性DNA核酸片段进行分型定性检测。【主要组成成分】序号组分包装规格体积/人份主要成分1核酸抽提液1.4mX2100含有氯化钠和EDYA-Na2的溶液2HPV（16、56、31型+IC）核酸荧光PCR检测混合液936l36l含有dNTP、4对引物和4条荧光探针的溶液3HPV（18、52、58、68型）核酸荧光PCR检测混合液936l36l含有dNTP、4对引物和4条荧光探针的溶液4HPV（45、82、33、35型）核酸荧光PCR检测混合液936l36l含有dNTP、4对引物和4条荧光探针的溶液5HPV（39、51、59、66型）核酸荧光PCR检测混合液936l36l含有dNTP、4对引物和4条荧光探针的溶液6Taq酶41.6l1.6TaqDNA聚合酶7H2O400l水8HPV高危型阳性对照品100l含15种型别（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、66、82型）目的基因片段的缺陷性病毒【标本要求】1）宫颈脱落细胞采集：用宫颈取样器刷取宫颈病灶处脱落细胞，置于无菌玻璃管，密闭送检。2）生殖道分泌物棉拭子：女性：生殖道-用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒钟后旋动棉拭子采取宫颈分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，密闭送检。以上标本在2-8℃条件下可保存7天，≤-20℃条件下可长期保存，避免反复冻融，标本运输采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封运输。SCC、CA125、CEA、CA724、CA19-9、CA15-32.2仪器1）高危型HPV检测所需仪器①设备名称：生物安全柜规格型号：BSC-1500ⅡA2-X设备编号：MKYJ-YQ/HJ-013-PCR②设备名称：全自动医用PCR分析系统型号规格：SLAN-96S设备编号：NBMKSD-YQ/JC-066-PCR2）肿瘤标志物检测所需仪器全自动电化学发光免疫分析仪

第三章实验方法3.1HPV15型体检3.1.1标本、对照品的核酸裂解处理生殖道分泌物棉拭子及宫颈脱落细胞：标本试管充分震荡摇匀，吸取液体800l至1.5ml离心管中13500rpm离心5分钟，小心吸弃上清。沉淀直接加入100l核酸提取液充分震荡混匀，金属浴10分钟，然后13500rpm离心5分钟，取上清作为PCR反应模板。对照品：取阳性对照品、阴性对照（H2O）各100l置于1.5ml离心管中，分别加入核酸提取液100l充分震荡混匀金属浴10分钟然后13500rpm离心5分钟，取上清作为PCR反应模板。3.1.2试剂配制取4种HPV核酸荧光PCR检测混合液nx36l分别与4份nx0.4lTaq酶（n为反应管数），震荡混匀数秒，3000rpm瞬离数秒。3.1.3加样上述4种配置好的混合液36l分别置于薄壁PCR板中，然后将标本、阳性对照品、H2O（阴性对照品）的处理上清液4l分别加入薄壁PCR反应板中，盖好薄壁PCR反应管或PCR反应板膜，立即进行PCR扩增反应。加样方式如下图3.1.4PCR扩增反应管置于荧光PCR仪上，循环参数设置：94℃x2min,93℃x10sec→62℃x31sec，循环40次；单点荧光检测在62℃。反应体系为40l。3.1.5质量控制H2O检测结果HPV核酸荧光检测混合液1通道2通道3通道4通道E216、56、31型+IC阴性阴性阴性F218、52、58、68型阴性阴性阴性阴性G245、82、33、35型阴性阴性阴性阴性H239、51、59、66型阴性阴性阴性阴性阳性对照品检测结果HPV核酸荧光检测混合液1通道2通道3通道4通道E216、56、31型+ICCt≤35Ct≤35Ct≤35F218、52、58、68型Ct≤35Ct≤35Ct≤35Ct≤35G245、82、33、35型Ct≤35Ct≤35Ct≤35Ct≤35H239、51、59、66型Ct≤35Ct≤35Ct≤35Ct≤35若检测结果不符合上述表格，则实验视为无效，需重复实验。3.1.6试验结果的计算HPV核酸荧光PCR检测混合液若1通道Ct≤37且扩增曲线呈典型的S型若2通道Ct≤37且扩增曲线呈典型的S型若3通道Ct≤37且扩增曲线呈典型的S型若4通道Ct≤37且扩增曲线呈典型的S型E216、56、31型+IC16型56型31型未出现需复查F218、52、58、68型18型52型58型68型G245、82、33、35型45型82型33型35型H239、51、59、66型39型51型59型66型待检样本按照下进行结果判读：如果待检样本Ct值在37-40之间，需重复测定，如仍在37-40之间，且扩增曲线呈典型的S型，则判断为阳性；若非典型的S型曲线，则判为阴性。结果判断图释如下:①典型的阳性曲线，呈S型②为阴性样本检测结果①典型的阳性曲线，呈S型②为阴性样本检测结果图1图2如所示图1、图2为阳性标本结果，IC出现阳性扩增曲线，不需要复查；HPV16型的Ct值＜37，记为HPV16型阳性。3.2肿瘤标志物检测3.2.1检测前准备从前处理处拿去已经离心好的血标本（从各个医院运往美康盛德检验所），未离心的标本需要重新离心，5000rpm离心5分钟。吸取50l血清至1.5ml离心管中加450l生理盐水稀释10倍。3.2.2上机检测选择实验项目：血清肿瘤标志物（SCC、CA125）将离心管中的稀释血清加入机器对应的孔板内，进行检测3.2.3结果判断将所得的结果与SCC、CA125的阳性判定标准的1/10进行比较，若结果大于其值，则记为阳性；反之，则为阴性。2.2.4结果处理①计算SCC、CA125全为阴性的体检者的SCC及CA125的平均浓度②计算SCC、CA125全为阳性的体检者的SCC及CA125的平均浓度③计算SCC为阳性的体检者的SCC及CA125的平均浓度④计算CA125为阳性的体检者的SCC及CA125的平均浓度并得出SCC、CA125体检的阳性率肿瘤标志物的阳性判定标准:SCC>1.5ng/mL,CEA>5ng/mL,CA-125>35U/mL。第四章实验结果4.1.1HPV15型体检结果700例标本中出现了102例阳性结果，分别为：标本序号阳性型别566+1118+59+4152+4256+35+4952+33+5052+66+8031+8266+8939+9816+10316+10652+51+10758+16+33+10852+11466+11616+12352+13716+14258+15468+15758+15939+18758+19066+19358+52+19952+22266+22482+22616+56+22916+23039+24258+25766+26352+27558+27916+31+28552+29166+29531++66+32268+32916+35552+35735+36939+38152+38218+39952+40582+41452+41558+41658+41816+42435+42758+43058+68+51+43651+44056+39+44535+44851+18+44952+45152+45856+46352+46516+47158+48551+50366+50435+33+51052+51782+52152+52366+52458+16+53616+55833+57058+56+52+57156+57656+58152+59756+66+60668+60752+60818+61066+39+61352+61466+61539+52+61739+52+61851+62166+62868+63235+64158+65556+66218+66352+66466+66652+59+66958+35+67258+67439+计算得该700例标本HPV15型检测的阳性率为13.33%4.1.2肿瘤标志物检测结果例数SCC(ng/mL)CA125(U/mL)阳性率全阴性5230.1919.87SCC阳性653.8323.539.29%CA125阳性860.8439.2612.19%全阳组269.2849.763.71%70025.19%4.3综合比较肿瘤标志物检测中，只有CA125或SCC一项阳性的阳性率均低于HPV15型检测的阳性率，但CA125的阳性率高于HPV15型检测的阳性率，SCC的阳性率与HPV15型检测的阳性率相差不大。4.4我的结论通过血清肿瘤标志物及高危型HPV检测的比较研究，我们可以知道，HPV15型检测对于宫颈癌及癌前病变筛查的准确性可能是高于肿瘤标志物的，或者说光凭其中一项的检测结果不能诊断是宫颈癌，还需要进行其他项目的检测并且时隔一个月或数月进行复查，才能得到更为准确的结果。其中SCC的阳性率与HPV15型检测的阳性率相近，或许SCC检测是与高危型HPV检测的联合筛查宫颈癌及癌前病变的最好选择，这个问题还有待探究。致谢【参考文献】[1]RobertoFlores-Munguia，ErinSiegel，etal.PerformanceAssessmentofEightHigh-ThroughputPCRAssaysforViralLoadQuantitationofOncoge