土壤细菌分离及计数实验教案

土壤细菌分离及计数实验教案一、实验目的本实验旨在使学生掌握从土壤中分离纯化细菌的基本原理和操作技术，学习并实践活菌计数的方法，了解土壤微生物的多样性，加深对微生物在自然界中分布的认识。同时，培养学生的无菌操作意识、细致的观察能力以及数据记录与分析能力。二、实验原理土壤是微生物生活的天然培养基，含有极其丰富的微生物种类和数量。土壤细菌是其中数量最多、分布最广的类群之一。本实验采用稀释涂布平板法（或平板划线分离法，此处以稀释涂布为例，可根据实际教学情况选择或补充）对土壤中的细菌进行分离。其原理是将土壤样品进行一系列梯度稀释，然后取一定体积的稀释液涂布在固体培养基表面，经过培养，单个细菌细胞或一小团同种细胞会生长繁殖形成肉眼可见的菌落。活菌计数则基于“一个菌落由一个活的微生物细胞繁殖而来”的假设（注：实际操作中，某些情况下一个菌落可能来源于多个细胞的聚集，因此计数结果通常以colony-formingunit,CFU表示）。通过统计平板上形成的菌落数量，并结合稀释倍数和取样量，可以计算出原始土壤样品中所含的活菌数量。涂布平板法能较好地将菌落分散开来，便于计数和后续的纯化。三、实验材料与试剂1.土壤样品：取自不同生境（如菜园土、林地土、花园土等，可由学生采集或实验室提供）。2.培养基：营养琼脂（NA）培养基。3.稀释液：无菌生理盐水（0.85%NaCl溶液）。4.其他试剂：75%酒精、无菌水。四、实验仪器与用具超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、天平、pH计（或精密pH试纸）、酒精灯、移液枪（1mL、200μL）及配套无菌吸头、试管（若干，用于梯度稀释）、培养皿（若干）、锥形瓶（用于配制培养基和分装稀释液）、烧杯、玻璃棒、试管架、记号笔、灭菌皿、接种环、玻璃刮铲（L型玻璃棒）、盛有75%酒精的烧杯（用于消毒涂布器）、灭菌纱布或滤纸。五、实验步骤（一）实验准备阶段1.培养基制备：按照NA培养基配方准确称量各成分，溶解后调节pH至7.0-7.2，分装于锥形瓶中，包扎灭菌。2.稀释液制备：配制0.85%无菌生理盐水，分装于试管中（通常每管9mL或9.9mL），包扎灭菌。3.其他用具灭菌：培养皿、移液枪吸头、试管、接种环、玻璃刮铲等均需经高压蒸汽灭菌。（二）土壤样品的采集与处理（若学生已提前采集，则此步可省略或简述）1.选择典型采样点，去除地表浮土及杂物。2.用无菌工具（如灭菌小铲）采集5-10cm深度的土壤样品约20g，装入灭菌袋或灭菌容器中，标记采样地点、日期、采集人等信息。3.尽快带回实验室，若不能立即处理，应冷藏保存。（三）土壤悬液的制备与梯度稀释1.称取土样：在超净工作台内，用灭菌的药匙和天平准确称取10g（或1g，视预计菌量而定）新鲜土壤样品，放入盛有90mL（或99mL）无菌生理盐水的锥形瓶中（内可放少量灭菌玻璃珠以助分散）。2.振荡混匀：将锥形瓶置于摇床（或人工剧烈振荡）振荡15-20分钟，使土壤颗粒充分分散，制成10^-1（或10^-2）的土壤悬液。3.梯度稀释：取6支装有9mL无菌生理盐水的试管，依次标记为10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7（假设初始为10^-1）。用1mL无菌移液枪从10^-1土壤悬液中吸取1mL悬液，加入到标记10^-2的试管中，混匀。更换新的无菌吸头，从10^-2试管中吸取1mL悬液加入到10^-3试管中，混匀。以此类推，进行系列梯度稀释，直至所需稀释度（通常稀释至10^-6或10^-7）。每更换一次稀释度，必须更换新的无菌吸头，并充分混匀。（四）涂布平板1.倒平板：将灭菌后的NA培养基融化，待冷却至45-50℃左右（手感不烫手为宜），在超净工作台内无菌操作，向每个培养皿中倒入约15-20mL培养基，水平放置，待其凝固。标记培养基名称、日期。2.选择稀释度：根据对土壤中细菌数量的估计，选择2-3个适宜的稀释度进行涂布。通常选择10^-4、10^-5、10^-6或10^-5、10^-6、10^-7等稀释度。3.加样涂布：在超净工作台内，用200μL无菌移液枪分别从选定的最高稀释度开始，依次吸取200μL（或100μL）稀释液，分别滴加到对应标记好稀释度的NA培养基平板中央。每个稀释度做2-3个重复平板。4.涂布均匀：将玻璃刮铲在75%酒精中浸泡消毒，然后在酒精灯火焰上烧灼（注意安全，避免酒精滴落引燃），待冷却（可在空白琼脂边缘轻触冷却）后，将平板上的菌液均匀涂布于整个培养基表面。每涂布一个平板，刮铲需重新灭菌并冷却。5.标记：在培养皿皿底标记样品名称、稀释倍数、接种日期、操作者等信息。6.待干：将涂布好的平板水平放置于超净工作台内片刻，待菌液完全吸收。（五）培养将待干后的平板倒置（防止冷凝水滴落污染菌落），放入30℃或37℃恒温培养箱中培养1-2天。（六）菌落观察与计数1.观察菌落：培养结束后，取出平板，观察菌落形态、大小、颜色、边缘、表面特征、质地、透明度等，并记录。注意区分不同类型的菌落。2.选择菌落数适宜的平板计数：选择菌落数在____个之间、菌落分布均匀的平板进行计数。若所有平板菌落数均小于30，则记录最低稀释度的菌落数；若所有平板菌落数均大于300，则记录最高稀释度的菌落数，并注明“TNTC”（TooNumerousToCount）。3.计数方法：可采用手动计数（使用菌落计数器辅助）或自动菌落计数仪。记录同一稀释度下各重复平板的菌落数。六、注意事项1.无菌操作：整个实验过程严格遵守无菌操作规程，防止杂菌污染。超净工作台使用前需紫外灭菌30分钟以上，操作时打开风机。手需用75%酒精消毒。2.梯度稀释准确性：稀释时应充分混匀，更换吸头，确保稀释倍数准确。3.涂布均匀性：涂布时刮铲要冷却充分，避免烫死细菌；涂布动作要轻柔、均匀，确保菌落分散良好。4.平板倒置培养：防止培养过程中产生的冷凝水落入培养基，冲散菌落。5.计数规范：计数时，注意区分菌落与培养基沉淀或杂质。若菌落蔓延生长，该平板不宜用于计数。6.安全第一：使用酒精灯时注意防火，高温物品避免烫伤。实验结束后，废弃物按规定处理。七、实验结果与分析1.菌落形态描述：记录所观察到的不同类型菌落的形态特征，可绘图或拍照。2.菌落计数结果记录表：土壤样品名称稀释倍数平板1菌落数平板2菌落数平板3菌落数平均菌落数备注:-----------:-------:----------:----------:----------:---------:---------3.计算每克土壤样品中的活菌数：每克土壤样品中的活菌数(CFU/g)=(平板平均菌落数×稀释倍数)/接种土样量(g)（注：若接种体积为0.2mL，则需再乘以5，即1/0.2；若接种体积为0.1mL，则乘以10。公式可调整为：CFU/g=(平均菌落数×稀释倍数)/接种体积(mL)×10mL/10g(若初始是10g土样加90mL水，则10g/100mL，每mL含土0.1g，接种1mL即0.1g；此处需根据实际称样量和稀释液体积调整，核心是算出每克土对应的菌落数。）例如：若称取1g土样加入99mL无菌水中（即10^-2稀释），然后取1mL进行10倍系列稀释至10^-6，取0.2mL涂布10^-6稀释度的平板，平均菌落数为150个，则：每克土壤活菌数=150×10^6/0.2=150×5×10^6=750×10^6=7.5×10^8CFU/g。4.结果表示：通常以colony-formingunits(CFU)pergramdrysoil或pergramfreshsoil表示，并使用科学计数法。若需干重，需测定土壤含水量。5.数据分析：比较不同稀释度平板的菌落数，分析数据的可靠性。若重复平板间菌落数差异较大，需分析原因。八、思考题1.本实验中，进行梯度稀释的目的是什么？如果不进行稀释，直接涂布会出现什么结果？2.为什么选择菌落数在____个之间的平板进行计数？这个范围是如何确定的？3.平板倒置培养有何意义？4.你所观察到的土壤样品中，细菌菌落有哪些主要类型？不同类型的菌落可能代表不同种类的细菌吗？5.除了稀释涂布平板法，还有哪些方法可以对土壤细菌进行计数？各有何优缺点？6.在实验操作过程中，哪些环节可能会导致计数结果偏高或偏低？请分析原因。7.无菌操作技术在微生物学实验中有何重要性？请列举本实验中涉及的无菌操作步骤。九