2025年大学《生物信息学》专业题库- RNA测序技术与生物信息学

2025年大学《生物信息学》专业题库——RNA测序技术与生物信息学考试时间：______分钟总分：______分姓名：______一、名词解释（每题4分，共20分）1.RNA测序（RNA-Seq）2.数字基因表达谱（DigitalGeneExpression,DGE）3.rRNA去除4.对齐（Alignment）5.FDR（FalseDiscoveryRate）二、简答题（每题6分，共30分）1.简述Illumina测序技术和PacBio测序技术在RNA测序应用中的主要区别。2.RNA测序实验流程中，进行rRNA去除的目的是什么？可能会对后续分析产生什么影响？3.简述使用DESeq2进行差异表达分析时，计算TPM值的步骤和意义。4.在RNA测序数据分析中，什么是多重假设检验问题？如何控制错误发现率（FDR）？5.简述lncRNA在进行RNA测序分析时，相较于mRNA，在数据预处理和分析上需要注意的特别之处。三、论述题（每题10分，共20分）1.论述RNA测序数据标准化方法的必要性，并比较TMM（TrimmedMeanofM-values）方法与CPM（CountsPerMillion）方法的原理和适用场景。2.假设你正在进行一项比较药物处理与空白对照组小鼠肝脏组织RNA表达差异的研究。请设计一个RNA测序实验方案，需要考虑的关键因素有哪些？并简述数据分析的主要步骤和目标。四、分析题（10分）某研究通过RNA测序分析了正常组织与某种癌症组织中基因表达的差异。他们使用DESeq2分析了数据，得到一个包含基因名称、FoldChange（倍数变化）和FDR值的列表。请描述如何解读这个列表中的信息，以初步判断哪些基因可能在该癌症的发生发展中发挥作用？在解读时需要关注哪些关键指标？试卷答案一、名词解释1.RNA测序（RNA-Seq）：一种通过高通量测序技术测定生物体在不同条件下或不同组织中转录本（RNA分子）种类和丰度的方法。2.数字基因表达谱（DigitalGeneExpression,DGE）：一种将RNA转录本转化为数字化信号（如信号强度）的技术，能够以高精度量化不同RNA分子的相对丰度。3.rRNA去除：在RNA测序实验中，去除样品RNA中丰度极高的核糖体RNA（rRNA）的过程，以提高目标转录本（如mRNA）的检测效率和通量。4.对齐（Alignment）：将测序产生的短读长（reads）或长读长（longreads）与参考基因组或转录组序列进行比对的过程，目的是确定每个读长在基因组/转录组中的位置。5.FDR（FalseDiscoveryRate）：在多重假设检验中，被错误拒绝的假设（即错误发现）所占的比例，是控制假阳性率的一种统计指标。二、简答题1.简述Illumina测序技术和PacBio测序技术在RNA测序应用中的主要区别。答案：Illumina测序为高通量测序技术，产生大量短读长（~50bp）数据，读长较短但准确性高、测序速度快、成本相对较低，适合检测已知基因的表达量和进行精细的转录本结构变异分析。PacBio测序为长读长测序技术，产生读长可达数万bp的数据，读长长但错误率相对较高、通量较低、成本较高，特别适合检测全长转录本、发现新的转录本、进行基因重复序列分析和绘制复杂基因组/转录组的精细结构。解析思路：分析点在于技术特性（通量、读长、准确率、速度、成本）及其在RNA测序中的具体应用优势。需分别阐述两种技术的核心特点，并明确这些特点如何影响其在RNA测序不同层面的应用价值。2.RNA测序实验流程中，进行rRNA去除的目的是什么？可能会对后续分析产生什么影响？答案：进行rRNA去除的目的是为了去除样品总RNA中丰度极高的核糖体RNA（rRNA），因为rRNA占据了RNA总量的很大比例（可达80-90%），去除它们可以提高后续步骤中目标转录本（如mRNA）的检测效率和通量，减少测序资源浪费，并获得更清晰的转录组图谱。对后续分析的影响：一方面是积极的，提高了目标转录本的分析深度和准确性，使得低丰度转录本也能被检测到；另一方面，如果去除不完全或过度，可能会丢失一部分非编码RNA（如某些rRNA宿主基因编码的snRNA、snoRNA）或低丰度转录本，也可能影响后续定量分析的准确性（如使用基于rRNAhostgene的UMI计数方法时）。解析思路：首先回答目的（去高丰度序列，提高效率和通量）。然后分析其影响，需包含正面影响（提高低丰度序列检测能力）和潜在负面影响（可能丢失部分序列，影响定量准确性）。3.简述使用DESeq2进行差异表达分析时，计算TPM值的步骤和意义。答案：在DESeq2中计算TPM值的步骤通常不是DESeq2的核心功能，TPM通常是在DESeq2进行差异检验后，使用R语言中的`edgeR`包或其他工具，根据每个基因在不同样本中的原始计数（counts）和经过DESeq2标准化后的估计图书馆大小（librarysizeestimates,如TPM计算公式中的分子）来计算的。计算步骤涉及：获取基因的标准化丰度（如FPKM或CPM），然后根据公式TPM_i=10^9*(FPKM_i/sum(FPKM_iacrossallgenesinonesample))计算每个基因在每个样本中的TPM值。其意义在于，TPM提供了一个相对单位，消除了样本间测序深度和基因数量的差异，使得不同样本或条件下的基因表达水平具有可比性，常用于可视化表达差异（如热图）。解析思路：明确DESeq2本身不直接计算TPM。指出TPM是在DESeq2分析后，基于标准化丰度（FPKM/CPM类）计算的。给出计算公式并解释其含义（相对标准化，可比性强），并点明其常用可视化场景。4.在RNA测序数据分析中，什么是多重假设检验问题？如何控制错误发现率（FDR）？答案：在RNA测序数据分析中，特别是差异表达分析，我们通常会同时测试成千上万个基因的表达差异（即进行成千上万个假设检验）。这些问题是相互独立的，因此当进行大量假设检验时，即使每个单独检验的假阳性率（p-value）很低，假阳性结果累积起来的概率也会显著增加，这就是多重假设检验问题。错误发现率（FDR）是指在所有被拒绝的假设（即判断为差异表达的基因）中，真正错误的假设所占的比例。FDR是一个比Bonferroni校正更实用的控制假阳性率的方法。解析思路：首先定义什么是多重假设检验问题（大量独立检验导致假阳性累积）。然后解释FDR的概念（被拒绝假设中错误假设的比例）。最后强调FDR相对于传统校正方法（如Bonferroni）的优势。5.简述lncRNA在进行RNA测序分析时，相较于mRNA，在数据预处理和分析上需要注意的特别之处。答案：在数据预处理上，lncRNA通常比mRNA短，且表达量更低，因此在对齐时需要使用更长的读长（如PacBio或OxfordNanopore长读长测序）以提高检测率；由于lncRNA结构多样且部分序列保守性低，可能需要使用专门针对lncRNA设计的索引或参数进行测序和比对；去除rRNA时需谨慎，避免去除部分lncRNA宿主基因。在数据分析上，lncRNA的注释通常比mRNA复杂，需要专门的lncRNA数据库；由于表达量低且可能存在转录本结构复杂性（如可变剪接），lncRNA的定量和差异表达分析对噪声更敏感，需要更精确的定量方法和统计模型；在结果解读时，需结合lncRNA的生物学功能进行深入探究。解析思路：从预处理（读长需求、比对参数、rRNA去除的谨慎性）和分析（注释数据库、定量统计模型、生物学功能解读）两个层面，对比lncRNA与mRNA的特殊性，点出lncRNA分析中的难点。三、论述题1.论述RNA测序数据标准化方法的必要性，并比较TMM（TrimmedMeanofM-values）方法与CPM（CountsPerMillion）方法的原理和适用场景。答案：RNA测序数据标准化是必要的，因为不同样本间的原始测序读数（counts）受到样本总RNA量、rRNA比例、文库构建效率、测序深度等多种因素影响，直接比较原始读数会导致偏差。标准化旨在消除这些技术变异，使基因表达水平的比较基于相对丰度而非绝对数量，从而更准确地反映生物学差异。TMM（TrimmedMeanofM-values）方法是一种基于对数变换和trimmedmean的标准化方法，它计算每个基因在不同样本间的M值（log2FoldChange），然后使用trimmedmean（去除极值后的均值）来估计librarysizefactor，能有效处理不同样本间差异表达基因数量的变化，对测序深度变化不敏感，是目前差异表达分析中常用的方法。CPM（CountsPerMillion）方法将每个样本的总读数标准化为1百万，然后计算每个基因的读数占百万分之几。其原理简单直观，易于理解，但在处理样本间差异表达基因数量变化时不如TMM鲁棒，且对测序深度变化敏感，可能导致高丰度基因的相对比例被不恰当地压缩。TMM适用于需要准确估计基因间FoldChange的比较，尤其是在样本间差异表达模式复杂时。CPM方法更简单，适用于初步探索或需要快速获得相对丰度近似值的情况，但精度和鲁棒性相对较低。解析思路：首先论证标准化的必要性（解决技术变异问题，实现生物学比较）。然后分别详细解释TMM和CPM的原理（TMM基于对数变换和trimmedmean处理差异表达基因数量变化；CPM基于总读数比例）。接着比较两者的优缺点（TMM鲁棒性更好，CPM更简单直观）。最后明确各自的适用场景。2.假设你正在进行一项比较药物处理与空白对照组小鼠肝脏组织RNA表达差异的研究。请设计一个RNA测序实验方案，需要考虑的关键因素有哪些？并简述数据分析的主要步骤和目标。答案：实验方案设计需要考虑以下关键因素：1）实验动物：选择遗传背景相似、性别、年龄、体重一致的小鼠，确保实验起点一致。设置足够的样本数量（如每组至少3只），并考虑设置技术重复。2）分组：明确对照组和药物处理组，确保除了药物处理外，其他条件完全一致。3）药物处理：确定药物的剂量、给药途径、给药时间和处理周期。4）样本采集：在预定时间点同步采集肝脏组织，快速液氮速冻或RNAlater固定，确保RNA质量。5）RNA质量检测：采集后立即检测RNA完整性（如RIN值）、纯度（A260/A280/A230）和浓度，合格的RNA才用于后续实验。6）实验重复：设置生物学重复和技术重复，以保证结果的可靠性和可重复性。数据分析的主要步骤和目标：1）数据预处理：进行质量控制和过滤（去除低质量读长、adapter序列），使用合适的工具（如STAR/HISAT2）将读长对齐到小鼠参考基因组（如GRCm38），使用featureCounts/HTSeq-count等进行基因/转录本计数。2）数据标准化：使用DESeq2或edgeR等软件进行数据标准化，计算如TPM或FPKM等标准化表达矩阵，消除测序深度和基因数量差异。3）差异表达分析：使用DESeq2或edgeR进行统计检验，识别并在指定FDR阈值下（如0.05）筛选出药物处理组与对照组间显著差异表达的基因。4）结果可视化：绘制热图、火山图等，直观展示差异表达模式。5）功能富集分析：对显著差异表达基因进行GO（GeneOntology）和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenome