紫花苞舌兰原球茎内生真菌多样性研究

题目紫花苞舌兰原球茎内生真菌多样性研究III摘要兰科植物内生真菌及其多样性研究一直是兰科植物保护生物学研究的热点领域之一。紫花苞舌兰是较为普遍，是兰科植物中少有的非稀有类群，什么因素导致的其成功的繁殖策略尚不得而知。为研究紫花苞舌兰种子共生萌发有效真菌的专一性，本研究利用紫花苞舌兰的原球茎，从中分离得到78株内生真菌，测序获得54株ITS-rDNA序列。在NCBI（）进行物种相似度比对分析发现54株真菌分别属于藻菌纲Phycomycetes毛霉目Mucorales毛霉科Mucoraceae的毛霉属Mucor和根霉属Rhizopus真菌；子囊菌纲Ascomycetes多腔菌目Pezizales痂囊腔菌科Elsinoaceae的痂囊腔菌属Elsinoe真菌，纵裂壳霉目Hysteriale纵裂壳菌科Hysteriaceae的枝顶孢属Acremonium真菌，曲霉目Eurotiales发菌科Trichocomaceae的青霉属Monocillium真菌和曲霉科Eurotiaceae的曲霉属Aspergillus真菌，柔膜菌目Helotiales柔膜菌科Helotiacese柔膜菌属Hizoscyphussp；担子菌纲Basidiomycetes鸡油菌目Cantharellales鸡油菌科Cantharellaceae的胶膜菌属Tulasnella（Epulorhiza）真菌；以及半知菌纲Deuteromycetes的从梗孢目Hyphomycetales瘤座孢科Tuberculariaceae的镰刀菌属Fusarium真菌和类肉座菌科Nectrioidaceae的类柱孢霉属Pleiocarpon真菌，黑盘孢目Melanoconiales黑盘孢科Melanoconiaceae的炭疽病菌属Colletotrichum真菌，和链孢霉目Neurospora黑霉科Dematiaceae的顶柱霉属Acrocalymma真菌。其中，镰刀菌属Fusarium真菌和柔膜菌属Hizoscyphussp真菌是优势类群，相对频率为24.1%和14.8%；胶膜菌属Tulasnella（Epulorhiza）真菌共分离3株，是典型的兰科菌根菌，为下一步紫花苞舌兰种子共生萌发筛选有效真菌提供了菌种资源。关键词：ITS测序；原球茎；真菌多样性；分离；纯化；优势属；相对频数；胶膜菌AbstractThestudiesonbiodiversityandecologicalfunctionoforchidmycorrhizalfungihasbeenonekeyhotspotforsymbiosisrelationshipandorchidconservation.Thespecies,Spathoglottisplicata,widelydistributesinJapan(RyukyuIslands),Philippines,Malaysia,SriLanka,Vietnam,Thailand,southernIndia,Indonesia,NewGuinea,someislandsinAustraliaandMexico.Itisacommonandnoendangeredspeciesbutwithinvasiveproperties.Whichstrategiesleadtoitssuccessfulpropagationisunknownyet.Toelucidatethemechanismofspeciespropagation,NGS(nextgenerationsequence)wasusedforstudyoffungaldynamicsduringitslifestagesandfungalstrainswereobtainedfromhostprotocormsinthisstudy.78endophyticfungalstrainswereisolatedfromtheprotocormsofthespecies,Spathoglottisplicata,and54sequencesofrDNA-ITSwereavailableandanalyzed.ThespeciessimilarityanalysisusingBLASTinNCBI()showedthat54fungalstrainsareidentifiedtoMucoraandRhizopus,Mucoraceae,Phycomycetes;Elsinoe,Elsinoaceae,Pezizales,Ascomycetes;Acremonium,Hysteriaceae,Hysteriale,Ascomycetes;Monocillium,Trichocomaceae,Eurotiales;Aspergillus,Eurotiaceae,Eurotiales;Hizoscyphussp,Helotiaceae,Helotiales;Tulasnella(Euplorhiza),Cantharellaceae,Cantharellales;Fusarium,Tuberculariaceae,Hyphomycetales,Deuteromycetes;Pleiocarpon,Nectrioidacea,Hyphomycetales,Deuteromycetes;Colletotrichum,Melanoconiaceae,Melanoconiales;Acrocalymma,Dematiaceae,Neurosporales;respectively.Thegenera,FusariumandHizoscyphussp,arethethemostprevalentcommunitieswiththerelativefrequencyof24.1%and14.8%,respectively.Inaddition,threestrainsastypicalorchidmycorrhizalfungifromthegenus,Tulasnella,willbescreenedforpromotiononseedgermination.Thisstudywillsupportfungalresourcesforsymbioticseedgerminationandcontributetodiscoverpropagationstrategyofthespecies,Spathoglottisplicata.Keywords:ITS;Protocorm;Bophytes;Isolation;Purification;Dominantgenus;Relativefrequency目录1.引言 11.1兰科植物 11.1.1兰科植物简述 11.1.2兰科植物生活史简述 11.2兰科植物内生真菌多样性研究背景与进展 21.3本研究的目的对象及目的意义 31.3.1紫花苞舌兰概述 31.3.2本研究目的意义 42.研究方法 42.1实验样品采集 42.2内生真菌分离培养 62.3样品ITS测序 72.4计算菌株的相对频率 72.5系统发育关系分析 73.结果 73.1紫花苞舌兰原球茎内生真菌结构组成 73.2紫花苞舌兰原球茎内生真菌系统学关系 94.讨论 10参考文献 12致谢 13--引言1.1兰科植物1.1.1兰科植物简述兰科植物是被子植物的第二大科，仅次于菊科，全世界大约有25000多种，也是最高等，最进化的类群。许多种类具有极高的观赏价值、药用价值和文化价值，在我国有着2000多年的栽培历史。随着全球变化以及人类活动的影响，特别是野生资源的乱采滥挖，导致了兰科植物生存环境遭到破坏，大多数种类正处于极度濒危的状态。现如今兰科植物所有种类都被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》的保护范围，占该公约应保护植物的90%以上，是植物保护的旗舰类群。兰科植物是一个高度进化的类群，有着十分复杂的生活史，因此对兰科的保护和研究都面临极大困难。兰科植物最显著的特征之一是其种子非常微小，每枚蒴果当中都有几千到上百万粒种子，被称为尘埃种子（dustseed）。其种子结构简单，外层只有一层薄薄的种皮包被着种胚，种胚由几个细胞组成，几乎无胚乳和营养物质储存，这个特点决定了兰科植物的种子无法储存足够的养分来供本身萌发，野外条件下种子必须由特定的真菌侵染才能启动萌发，继续萌发形成幼苗。这也是兰科植物除了人为活动外还如此濒危的一个重要自身原因。所以，怎样提高种子的萌发率，以及保证兰科植物幼苗的存活率是目前兰科植物研究和保护保育的主要工作。1.1.2兰科植物生活史简述兰科植物生活史十分艰难复杂。它们种子细小无胚乳所以相对于其他植物来说种子萌发阶段就特别困难，只能利用真菌来提供营养并萌发成为原球茎，继而长出叶子和根最后才能形成幼苗（原球茎是兰科植物种子吸水膨大后种胚突破种皮而没有形成胚根的一个阶段）。而当兰科植物幼苗顺利成长到开花的时候又因为传粉烦恼，因为兰科植物花朵多数没有花蜜来吸引传粉昆虫帮助它们传播花粉，所以兰科植物又进化出了食源性欺骗还有性欺骗等手段来利用昆虫免费为其传粉[1-2]，而且兰科植物的花粉都是聚集成团的所以只要一有机会传粉就能一次性把花粉全部带到柱头上完成传粉过程，也因为如此兰科植物虽然说结果困难，但是只要一结果就会长生成千上万的种子，这些种子又希冀于遇到合适的真菌开始新的一生。总的来说就是兰科植物的生活史虽然复杂但是还是利用进化得到的各种技能来完美的克服了这些困难在地球上继续生存着。其实除了它自身的进化以外兰科植物最不可或缺的就是与之共生的真菌了，因为真菌不仅仅是对几种兰科植物的种子萌发起作用，而是对绝大多数兰科植物的各个生长阶段都有促进作用，这个作用甚至陪伴了兰科植物的一生；对腐生兰科植物而言，则完全依赖寄生于共生真菌存活。从真菌跟兰科植物种子相遇开始，就帮助其提供营养促进萌发；还帮助提高其在幼苗时期的成活率；在其不同阶段促进其对各种所需营养物质的吸收[3]。从种子开始萌发成长一直到下一代的种子成熟，真菌贯彻了兰科植物的整个生活史，也就是说兰科植物的一生都与真菌共生，与真菌有着密不可分的关系，所以研究兰科植物各个时期的内生真菌是兰科营养关系研究必不可少的过程。1.2兰科植物内生真菌多样性研究背景与进展兰科植物与真菌的关系相当密切，研究兰科植物的内生真菌对兰科植物的保护和保育方面都有极大的指导意义，所以有关兰科植物内生真菌的研究一直是兰科植物研究的重点领域。从19世纪初Bernard发现了兰科植物与真菌的共生关系以后就打开了兰科植物跟真菌共生萌发的大门，而在十九世纪四十年代Curtis发现了相同生境生存的不同兰科植物有相近的内生真菌，而在不同地方生存的同一种兰花有不同的内生真菌，此后便开展了有关兰科植物共生真菌生态学的研究[4]。随后各种有关兰科植物真菌的报道相继发表，也更加促进了兰科植物学家们对其内生真菌的各种相互作用、真菌种群结构以及多样性的研究。植物内生真菌通常是指在其生活史的一定阶段，生活在活体植物内且没有明显病害症状的一类真菌，几乎所有植物类群中都有内生真菌的存在[5]。兰科植物作为植物界显花植物的大科之一，也是最为依赖真菌的一个大科之一。因为兰科植物种子细小，无胚乳，自然条件下只有与适宜的真菌共生才能萌发，而且兰科植物不仅仅是种子萌发需要真菌的参与，大多数兰科种类从其种子萌发到其幼苗的成长甚至整个生活史都需要真菌的共生形成菌根帮助其生长发育。因此，兰科植物的内生真菌多样性研究一直是兰科植物学家们的热门研究领域。由于兰科植物种类繁多，高达25000余种，广泛分布于热带，亚热带以及部分温带等地区，而且兰科植物生长的环境也复杂多样，有生长在有砾石和腐殖质的沙壤土或沼泽、湿地的地生兰，也有附着生长在有苔藓、腐殖质和积土的附生兰和石生兰。数量和种类繁多以及生存环境的复杂造成了兰科植物内生真菌丰富程度极高。冯晓晓等人通过研究西双版纳纳板河流域国家级自然保护区的万代兰Vanda、毛兰Eria、贝母兰Coelogyne和盆距兰Gastrochilus五种附生兰的根、茎、叶的内生真菌发现其中粪壳菌纲Sordariomycetes的炭角菌目Xylariales和肉座菌目Hypocreales、座囊菌纲Dothideomycetes的格孢腔菌目Pleosporales真菌是附生兰中常见的内生真菌；根、茎、叶的内生真菌差异较为显著，其中根的内生真菌是最丰富的，叶次之，茎的内生真菌丰富度则最低，而且在其中分离自根的镰刀菌Fusarium是核心真菌[6]。而这些存在于兰科植物的内生真菌根据现在研究发现的可以大致分为与其确定有共生关系的菌根真菌如胶膜菌科Tulasmellaceae真菌，角担菌科Ceratobasidiaceae和蜡壳耳科Sebacinaceae真菌[7]，以及报道较少的隔担菌科Septobasidiaceae、口蘑科Tricholomataceae、伏革菌科Corticiaceae、鸡油菌目Cantharellales、小纺锤菌纲Atractiellales、牛肝菌目Boletales、层腹菌科Hymenogastraceae和红担子菌科Erythrobasidiaceae等真菌[8]，还有大量没有发现共生关系或者没有形成菌根的非菌根内生真菌，其中大部分是属于子囊菌门的盘菌纲Pezizomycetes、座囊菌纲Dothideomycetes、粪壳菌纲Sordariomycetes和锤舌菌纲Leotiomycetes真菌[9]。分析这些真菌的真菌多样性和种群结构特征，研究真菌与兰科植物间的互作关系，以期利用好这些真菌为兰科植物的种质保育及濒危种类的种群恢复研究提供参考，同时也能为内生真菌应用于兰科植物人工栽培和生物活性物质研究提供菌种资源。1.3本研究的对象及目的意义1.3.1紫花苞舌兰概述紫花苞舌兰（学名：SpathoglottisplicataBl.）是苞舌兰属兰科植物（图1-1），其植株高约1米左右，有卵圆形的假鳞茎，叶的质地薄而狭长且有折扇状的叶脉，花呈总状花序，约10朵花，苞片紫色呈卵形，中萼片呈卵形，侧萼片呈斜卵形，与中萼片等大。花瓣近乎椭圆形，比萼片大，先端锐尖。唇瓣贴生于蕊柱基部分3裂；侧裂片直立，狭长，先端扩大并呈截形；中裂片具长爪，向先端扩大而呈扇形，先端近截形并凹入或浅2裂，基部与侧裂片相连接地方具一对黄色肉突，其基部彼此连生并向背面伸出2个三角形的齿突；蕊柱长约1.5厘米。花期常在夏季。图1-1紫花苞舌兰图紫花苞舌兰果荚跟大多数的兰科植物果荚一样是蒴果（图1-1A），每个果荚内包含大约10-20万粒种子；都是只有一层种皮包被着种胚，整个种子呈两头尖中间凸起的梭形，大约有400-800微米长，其中种胚只有约60-100微米长（图1-2），相对于其他大多数兰科植物种子来说算是较大的一种。在自然界中种子萌发相对容易，且成苗率较高，适宜的生境可见大量植株个体，据文献报道紫花苞舌兰具有一定的入侵性质，分布范围也比较广泛，广泛分布在从日本（琉球群岛）经菲律宾、马来西亚、斯里兰卡、越南、泰国、印度南部、印度尼西亚、新几内亚岛到澳大利亚和太平洋的一些群岛。其成功的繁殖策略明显不同于多数珍惜濒危兰科植物，这在兰科植物当中很不常见，其定置繁育的机理尚未见报道。其野生植株常见山坡草丛中，由于花期较长而且花型与颜色较为优美鲜艳具有极高的观赏价值和园艺栽培价值。图1-2种子形态图1.3.2本研究目的意义为了探明紫花苞舌兰繁殖策略，为兰科植物保护提供理论依据，项目对其整个生活史周期开展了内生真菌动态变化研究，具体包括种子萌发阶段、幼苗阶段、花期植株，果期植株以及根际土壤内生真菌多样性和动态变化；同时分离紫花苞舌兰原球茎内生真菌，利用种子共生萌发实验筛选促进种子萌发的有效菌株。本课题是上述研究项目的一个组成部分，主要目的是从紫花苞舌兰的原球茎中分离出其内生真菌，并对分离出来的真菌从真菌种群组成、种群结构、亲缘关系等方面对紫花苞舌兰原球茎内生真菌的多样性进行阐述。意义在于能够为研究兰科植物与其共生真菌之间的互作关系以及其他共生萌发或者真菌相关的研究提供菌种资源；能够丰富我们对真菌多样性的认识；同时能够对真菌在兰科植物保育和繁育的应用，真菌共生萌发或者其他种类兰花的真菌多样性研究有着一定的参考价值。2.材料与方法2.1实验样品采集2019年6月在中国科学院西双版纳热带植物园苗圃兰圃开展样品采集时，采集到紫花苞舌兰自然发育形成的各个阶段的幼苗，包括种子萌发形成的原球茎，长出叶片的幼苗，生根幼苗，成苗（图2-1）。将采集到的各阶段幼苗带回实验室处理，选取一部分原球茎（图2-1B）作为分离菌种的实验材料，材料要冷藏保存并且尽快分离内生真菌。图2-1采集到的紫花苞舌兰各阶段幼苗2.2内生真菌的分离培养将带回实验室的紫花苞舌兰原球茎样品用自来水冲洗并用柔软毛刷刷干净盛于玻璃皿中，选取状态较好且无病害的原球茎用75%酒精溶液表面消毒3min，无菌水清洗干净以后再用浓度为1%（有效氯）次氯酸钠溶液表面消毒5min，消毒以后再次用无菌水清洗3-5次，以洗干净残留的次氯酸钠。将清洗干净的原球茎用刀片切成薄片放置于无菌的PDA平板上培养（25℃，黑暗培养），每个平板可放多个原球茎薄片培养（整个过程需在提前消过毒的无菌工作台上酒精灯附近进行）。待培养至原球茎薄片边缘长出真菌菌丝时（大约培养3天）用灭菌的接种针从边缘挑出菌丝尖端转移到新的PDA平板上进行纯化培养，经过多次纯化挑取培养得到的真菌即为内生真菌（图2-2）纯培养。再挑取纯化了的真菌培养后放在斜面PDA培养基当中编号并保存以保存菌种资源（每个菌种至少保存四管）。图2-2分离纯化后获得的部分菌株2.3样品ITS测序将纯化得到的真菌样品挑取到液体PDA培养基中，于摇床上以150r/min转速常温培养；直到培养出肉眼可见的真菌菌体（约5天左右），利用无菌操作技术把液体培养基里面的真菌菌丝挑出后利用灭菌过的滤纸过滤后装到离心管里标号并低温冷藏保存；将挑取的菌丝样品标号放入1.5ml离心管，常规CATB法提取内生真菌总DNA。聚合酶链式反应（PCR）采用25μL反应体系，ITS-rDNA通用引物ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）利用PCR仪器（型号ABI-2720，美国AppliedBiosystems公司）对DNA进行扩增经预变性（95℃，5min）-变性（95℃，30s）-退火（58℃，30s）-延伸（72℃，1min）-终延伸（72℃，7min）-循环数（35）；PCR扩增得到的产物由上海派森诺生物科技有限公司利用ABI3730XL测序仪进行最终的序列测定；测序后得到的序列利用软件chromas进行杂乱序列的删除和初步筛选以得到最终需要比对的序列；本批次样品共送样62个，剔除重峰套峰等问题序列共获得有效序列54条。最终得到的ITS-rDNA序列在NCBI网站上采用BLAST[10]进行基本的序列比对，与现如今已知的代表性序列进行比对然后根据相似程度选择相似度最近的真菌作为鉴定结果。2.4计算菌株的相对频率根据比对鉴定出来的具体菌株数计算出每种菌株的相对频率，并以菌株的鉴定结果及计算出的相对频率制作表格来表示紫花苞舌兰原球茎内生真菌所属的纲Class、目order、科Branch属family等具体结构组成（相对频率=该菌株数/总菌株数，通常用百分比表示）[11]，并对表格内容加以说明。2.5系统发育关系分析根据菌种鉴定结果筛选出具有代表性的菌株序列，利用软件MEGA-X对序列进行比对，运算最佳模型，运用最大似然法构建菌株的系统关系树，并对其进行系统关系分析。结果3.1紫花苞舌兰原球茎内生真菌结构组成测序后利用软件chromas筛选以后得到了54条有效序列，将这54条序列比对以后获得了和54株紫花苞舌兰的内生真菌相似性最高的结果，鉴定结果如表3-1。菌编号Bacterianumber参考菌种Species 相似度Identity收录号Accessionnumber参考文献Referencessp3Acremoniumnepalense99.59%JQ647430MycoKeysetal.2012sp4,sp33,sp34,sp46,sp55,sp56,sp65,sp71Helotialessp.99.46％HQ649975Microbetal.2012sp5,sp24,sp27,sp45Fusariumoxysporum100%MN153518Wangetal.2019sp7,sp62,sp73Fusariumsolani100%MK335677Aveskampetal.2010sp8,sp9,sp32,sp40,sp49,sp50Mucorfragilis100%MK910058Lombardetal.2015sp10,sp11,sp13Plectosphaerellacucumerina100%HQ248206Vuetal.2019sp15,sp16,sp18,sp19,sp21,sp23,sp28Acrocalymmavagum100%MH141292Rolandetal.2019sp20Pleiocarponlivistonae99.8%KC787021Endeetal.2013sp22Colletotrichumgloeosporioides99.62%MK424387Bhavanaetal.2019sp29,sp26Fusariumproliferatum100%KU939071Wangetal.2016sp35Epulorhizasp.96.46%AJ313459Wongetal.2001sp41,sp74Aspergillusniger100%LC434645Sohsomboon.2018sp43Aspergillussydowii100%MH793853Chikereetal.2018sp44Epulorhizasp.94.68%AJ313456Wongetal.2001sp48,sp64,sp77Fusariumfujikuroi100%MF033173Aveskampetal.2009sp51,sp52,sp53,sp60,sp66,sp67Monocilliumsp99.41%MG827028Gerritsetal.2015sp63Aspergillusflavus100%MH793857Chikereetal.2018sp70 Monocilliumsp99.40%MK518422Kiranmayeeetal.2019sp76Epulorhizasp.96.11%AJ313458Wongetal.200表3-1菌株比对结果54个菌株属于子囊菌纲Ascomycetes、半知菌纲Deuteromycetes、藻菌纲Phycomycetes和担子菌纲Basidiomycetes4个纲；分属于多腔菌目Pezizales、柔膜菌目Helotiales、纵裂壳霉目Hysteriale、从梗孢目Hyphomycetales、链孢霉目Neurospora、多孔菌目Polyporales、毛霉目Mucorales、黑盘孢目Melanoconiales和曲霉目Eurotiales等9个目；又分为痂囊腔菌科Elsinoaceae、纵裂壳菌科Hysteriaceae、发菌科Trichocomaceae、曲霉科Eurotiaceae、柔膜菌科Helotiacese、瘤座孢科Tuberculariaceae、类肉座菌科Nectrioidaceae、黑盘孢科Melanoconiaceae、黑霉科Dematiaceae、鸡油菌科Cantharellaceae和毛霉科Mucoraceae等11个科；其中柔膜菌目的8个菌株都归属于柔膜菌属Hymenoscyphus；毛霉目的6个菌株归属于2个属：毛霉属Mucor和根霉属Rhizopus；从梗孢目的14个菌株归属于2个属：镰刀菌属Fusarium和类柱孢霉属Pleiocarpon；纵裂壳霉目的1个菌株归属于枝顶孢属Acremonium；黑盘孢目的1个菌株归属于炭疽病菌属Colletotrichum；多孔菌目的3个菌株归属于胶膜菌属Epulorhiza；曲霉目的11个菌株归属于2个属：曲霉属Aspergillus和青霉属Monocillium；链孢霉目的7个菌株属于顶柱霉属Acrocalymma；多腔菌目的3个菌株属于痂囊腔菌属Elsinoe。半知菌纲的丛梗孢目，子囊菌纲的曲霉目是紫花苞舌兰内生真菌中出现频率最高的，相对频率分为26%和20.4%。而其中的柔膜菌属Hizoscyphussp和镰刀菌属Fusarium为明显的优势属，相对频率高达14.8%和24.1%。表3-1紫花苞舌兰内生真菌组成纲(菌株数)相对频率目（菌株数）相对频率科（菌株数）相对频率属（菌株数）相对频率子囊菌纲Ascomycetes（23）42.6%多腔菌目Myraingiales（3）5.6%痂囊腔菌科Elsinoaceae（3）5.6%痂囊腔菌属Elsinoe（3）5.6%纵裂壳霉目Hysteriale（1）1.9%纵裂壳菌科Hysteriaceae（1）1.9%枝顶孢属Acremonium（1）1.9%曲霉目Eurotiales（11）20.4%发菌科Trichocomaceae（7）13%青霉属Monocillium（7）13%曲霉科Eurotiaceae（4）7.4%曲霉属Aspergillus（4）7.4%柔膜菌目Helotiales（8）14.8%柔膜菌科Helotiacese（8）14.8%柔膜菌属Hizoscyphussp（8）14.8%半知菌纲Deuteromycetes（22）40.7%从梗孢目Hyphomycetales（14）26%瘤座孢科Tuberculariaceae（13）24.1%镰刀菌属Fusarium（13）24.1%类肉座菌科Nectrioidaceae（1）1.9%类柱孢霉属Pleiocarpon（1）1.9%黑盘孢目Melanoconiales（1）1.9%%黑盘孢科Melanoconiaceae（1）1.9%炭疽病菌属Colletotrichum（1）1.9%链孢霉目Neurospora（7）13%黑霉科Dematiaceae（7）13%顶柱霉属Acrocalymma（7）13%担子菌纲Basidiomycetes（3）5.6%多孔菌目Polyporales（3）5.6%鸡油菌科Cantharellaceae（3）5.6%胶膜菌属Epulorhiza（3）5.6%藻菌纲Phycomycetes（6）11.1%毛霉目Mucorales（6）11.1%毛霉科Mucoraceae（6）11.1%毛霉属Mucor（4）7.4%根霉属Rhizopus（2）3.7%3.2紫花苞舌兰内生真菌系统学关系图3-1是利用54个真菌序列中具有代表性的21个真菌序列建成的进化关系树形图，其中标号（sp+数字）是代表分离出来的真菌，拉丁名和属名则是对应真菌的鉴定结果（有的只能鉴定到属），分支处的数字代表支持率，数字越大说明分支的支持率越高。半知菌类群其有性世代对应子囊菌门，因此半知菌类和子囊菌门真菌聚为一个分支。瘤菌根菌（有性世代为胶膜菌属）聚为单独一个分支，支持率为100。sp76根瘤菌属Epulorhizasp.（3）sp44根瘤菌属Epulorhizasp.（3）spsp76根瘤菌属Epulorhizasp.（3）sp44根瘤菌属Epulorhizasp.（3）sp50脆毛霉菌Mucorfragilis如fragilisfragilis（6）讨论寄主植物的种类、生存环境、地域、生长阶段等都有可能影响其内生真菌的种群结构和真菌多样性，而其中最主要的两个因素是寄主植物的种类以及所处地域，热带地区的内生真菌丰富程度要远远高于高纬度地区[12]。西双版纳热带植物园所在的地区属于全球生物多样性热点区域之一[13]，所以对该地区紫花苞舌兰原球茎内生真菌的研究不仅能够丰富对兰科植物内生真菌多样性的认识还能提高我们对真菌资源的后续利用研究。石斛属Dendrobium的植物是典型的兰科植物，前人研究了云南、贵州以及四川等地的40多种石斛属植物也报道了许多兰科植物内生真菌，其中大部分是属于盘菌亚门粪壳菌纲Sordariomycetes的粪壳菌目、炭角菌目、肉座菌目、间座壳目、假毛球壳目和小丛壳目；座囊菌纲Dothideomycetes的格孢腔菌目、煤炱目、座囊菌目和葡萄座腔菌目；散囊菌纲Eurotiomycetes的散囊菌目以及锤舌菌纲Leotiomycetes的柔膜菌目等四纲十二目的真菌。其中有的菌种Xylaria、Alternaria、Fusarium和Colletotrichum是很多植物的内生真菌的优势属[7]。从属的水平来说本研究分离到的内生真菌Fusarium和Hymenoscyphus共占了总菌数的38.9%，相对频率分别为24.1%和14.8%，是非常明显的优势属群。这些结果与前人研究的结果基本是一致的，石斛内生真菌优势种群已经报道的为炭角菌类和Fusarium[14]。这些结果都能够说明其中的Fusarium为兰科植物的“核心菌群”[15],极有可能在兰科植物的生长发育当中发挥着重要的作用。而在本研究当中也分离到了Fusarium的真菌而且还是本研究的内生真菌的优势属；至于在本研究未能分离到炭角菌目，假毛球壳目，间座壳目，煤炱目、座囊菌目和葡萄座腔菌目等石斛属常见的真菌可能是因为紫花苞舌兰是地生兰的缘故，也可能是因为真菌分离的部位以及时期的缘故，因为本研究只是分离了紫花苞舌兰原球茎阶段的内生真菌所以结果不太完善，同时这也表明了虽然兰科植物的“核心菌群”是类似的，但是其他的内生真菌群落也存在着较大的差异，这种差异的影响可能是多方面的，比如采集地的不同，分离菌种的方式不同等都有可能造成影响。也正因为如此，更加广泛的采集多地的各个阶段植株真菌样品作比较并且完善分离内生真菌的方法才能分离得到更多更全的内生真菌，也才能能够让我们更好的进行兰科植物内生真菌多样性的研究，促进兰科植物保护保育工作进程。本研究只是研究了紫花苞舌兰的原球茎阶段的内生真菌，在真菌多样性和代表性来说都很片面，也就是说本研究得到的内生真菌群落结构和真菌多样性不能代表紫花苞舌兰其他阶段或者部位的真菌结构组成和多样性，但是本研究得到的结果对紫花苞舌兰其他阶段的内生真菌多样性研究或者其他兰科植物的内生真菌多样性研究有着极高的借鉴意义，而且本研究分离到的内生真菌为紫花苞舌兰后续的共生萌发研究提供了菌种资源。参考文献任宗昕，王红，罗毅波．兰科植物欺骗性传粉[J]．生物多样性，2012，20(03)：270-279．[2]任宗昕．兰科植物欺骗性传粉[C]．中国植物学会系统与进化植物学专业委员会、云南省植物学会．2011年全国系统与进化植物学暨第十届青年学术研讨会论文集．中国植物学会系统与进化植物学专业委员会、云南省植物学会：中国植物学会，2011，108．[3]高越，郭顺星，邢晓科．兰科植物种子共生萌发真菌多样性及共生萌发机制研究进展[J]．菌物学报，2019，38(11)：1808-1825．[4]Marc-AndréSelosse,BernardBoullard,DavidRichardson.NoëlBernard(1874–1911):orchidstosymbiosisinadozenyears,onecenturyago[J].Symbiosis,2011,54(2).[5]黄磊，高燕燕，许才万，等．药用植物内生菌的多样性及其活性代谢产物功能研究进展[J]．贵州林业科技，2019，47(03)：59-64．[6]冯晓晓，陈家杰，刘峰等．西双版纳5种附生兰非菌根内生真菌多样性研究[J/OL]．菌物学报．190-190．[7]陈娟，谭小明，郭顺星等．石斛属植物内生真菌及菌根真菌物种多样性研究进展．中国药学杂志，2013，48(19)：1649-1653．[8]XingXK,JacquemynH,GaiXG.2019.Theimpactoflifeformonthearchitectureoforchidmycorrhizalnetworksintropicalforest.Oikos,doi:10.1111/oik.06363.[9]MaX,KangJ,NontachaiyapoomS.2015.Non-mycorrhizalendophyticfungifromorchids.CurrentScience,109(1):36-51.[10]AltschulSF,GishW,MillerW.1990.Basiclocalalignmentsearchtoo