2025年HPLC幻灯片教学课件

HPLC日常维护与故障排除高效液相色谱仪一.概述二.HPLC系统：高压输液系统;进样系统;分离系统;检

测系统;辅助系统三.流动相和固定相介绍四.如何选择液相色谱仪五.HPLC常规分析操作步骤及规程六.HPLC系统中气泡对检测的影响以及解决方法七.六通阀进样器的使用及保养八.色谱柱的应用九.HPLC日常简易维护及保养十.HPLC常见故障的判定及解决方法1.1概述

高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外，还有亲和色谱、薄层色谱等。早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm,长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。即使这样，流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！

当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。

为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10m

）！

直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g,荧光检测器——10-11g。1.2高效液相色谱与经典液相色谱方法比较1.3HPLC与GC的比较

分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物，而这些物质只占有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小；HPLC采用的流动相为液体或各种液体的混合，可供选择的机会多。它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和改进分离。操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。1.4HPLC的应用

由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。

右图是各种HPLC方法的应用范围及对象2.HPLC仪器HPLC仪器包括：

高压输液装置;

进样系统;

分离系统;

检测系统;

此外还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理系统。其工作过程如图所示。HPLC仪器详解2.1高压输液系统1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约2m，可防止颗粒物进行泵内。2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。3）高压泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。输液泵种类：恒压型和恒流型。

恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器)。2.1.1高压输液系统4）梯度淋洗装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。2.1.2高压输液系统往复式双柱塞并联泵2.2进样系统

与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。手动进样阀示意图2.3分离系统（色谱柱）1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为15~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大)；2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：平衡密度法：

即使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法：

当采用粘度较大的试剂，如CC4，CH3OH,丙酮，二氧杂环已烷、THF等。填充方法：

填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。2.4检测系统

液相色谱检测器：

紫外检测器

荧光检测器

示差折光检测器

安培检测器

蒸发光检测器MSIR

极谱

等等2.4.1紫外检测器其检测原理和UV-Vis方法一样。只是，此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为2-10mm,体积约为1~10

L。HPLC分析中，约有80%的物质可以在254nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。

在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。快速扫描—光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图2.4.2荧光检测器许多有机物具荧光活性，尤其是芳香族化合物具有很强的活性。荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高2~3个数量级。2.4.3示差折光检测器原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。

通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。2.4.3示差折光检测器2.4.4安培检测器由恒电位仪和一薄层反应池（体积为1~5

L）组成。如图。

该检测器是利用待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓度成正比。

采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性。它最适于与反相色谱匹配。但此检测器只能检测具有电活性的物质。2.4.4安培检测器2.4.5电导检测器电导检测器主要用于离子色谱的检测。

其原理是基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量。

电导检测器的主要部件是电导池。其响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中。另外，当pH>7时，该检测器不够灵敏。3.HPLC流动相和固定相简介与GC流动相不同，HPLC流动相为溶剂，它既有运载作用，又和固定相一样，参予对组分的竞争，因此溶剂的选择对分离十分重要。

理想的溶剂应有下列特性：1）对待测物具一定极性和选择性；2）使用UV检测器时，溶剂截止波长要小于测量波长(为什么？)；使用示差折光检测器，溶剂的折光率要与待测物的折光率有较大差别；3）高纯度。否则基线不稳或产生杂峰，同时可使截止波长增加；4）化学稳定性好；5）适宜的粘度。粘度过高，柱压增加；过低，易产生气泡。3.1流动相3.HPLC流动相和固定相简介

原则上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有机种，按极性由高到低为：

,’-氧二丙腈(ODPN)、聚乙二醇(PEM)、三甲撑二醇(TMG)、十八烷(C18)、角鲨烷(SQ)。

根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛。

根据涂渍方法的不同，可将固定相分为机械涂渍型和化学键合型，后者应用更为广泛。3.2固定相3.HPLC流动相和固定相简介

机械涂渍固定相：将固定液通过机械混合的方法涂渍到表面多孔型(0.5-1.5%涂布量)或全多孔型载体(5-10%涂布量)上形成的液液色谱固定相。该种固定相最大的不足是固定液易流失、分离稳定性及重现性差，不适合梯度淋洗。

为减少固定液的流失，通常在柱前加一根很短的前置柱，该柱涂有与分析柱相同但有更高含量的固定液，使流动相进入分析柱之前，预先被固定液饱和。3.HPLC流动相和固定相简介化学键合固定相：

化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、流失小、适于梯度淋洗等特点。这种固定相分离机理既不是简单的吸附，也不是单一的液液分配，而是二者兼而有之。化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用。对多数键合相来说，以分配机理为主。

3.HPLC流动相和固定相简介通常，化学键合相的载体主要是硅胶（表面有硅醇基）：Si-O-R：对热不稳定、遇水、乙醇等强极性会水解，使酯链断裂，因此只适于以不含水或醇的流动相。Si-R(或Si-N)：不水解，热稳定性比硅酸脂好。但所用的格式反应不方便。使用水溶液作流动相时，其pH应在4-8之间。Si-O-Si-R：不水解，热稳定性好，在pH2-8范围内对水稳定。3.HPLC流动相和固定相简介正相和反相键合色谱法3.HPLC流动相和固定相简介正、反相色谱中极性和保留时间的关系3.HPLC流动相和固定相简介硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。4.选择液相色谱仪的选择一台品质好的液相色谱系统应从以下几个方面考虑：

一．主要技术指标的优异：

首先是如何看指标。液相色谱仪的指标很多，有泵的、检测器的、色谱柱等等。我们认为要看主要1.进样体积过大同(10.4)12.在进样阀中造成峰技术指标，根据国家标准，仪器的主要指标有噪音，漂移，最小检测浓度，定性、定量重复性等。这些指标都要放在系统，回路里去看，去比较。就是需要把各单元装置都要联接好，如接好色谱柱，进样阀，并且要通上流动相。因为您在分析中也都是联接好以后才可以进行分析的，而不是单单用检测器或是泵的。然后在这个基础上，我们再去比较这些主要指标。4.液相色谱仪的选择1．噪音是指由仪器的电器元件、温度波动、电压的线性脉冲以及其他非溶质作用产生的高频噪声和基线的无规则波动。噪音的大小直接关系到仪器的检测灵敏度，噪音越大，检测的灵敏度就越低。对于检测低含量的样品就要求仪器的噪音越小越好，否则噪音过大将会导致基线不稳，甚至影响分析结果。4.如何选择液相色谱仪2．最小检测浓度（最小检测限）

最小检测浓度是反映仪器灵敏度的重要参数。

CL=2×Nd×C/H（CL：最小检测浓度Nd:噪音C：样品浓度最小检测浓度H：样品峰高）由上式可见，最小检测浓度是和噪音成正比的，噪音越大，最小检测浓度就越大，灵敏度就越低。某些厂家回避了这个指标，说明他们不愿在最小检测浓度的基础上去比较噪音。

4.液相色谱仪的选择3．漂移是指仪器稳定后一段时间内基线漂离原点的距离，通常用来衡量仪器稳定快慢。高品质的仪器能在较短的时间内达到稳定，从而在一定程度上提高了分析效率。

4.如何选择液相色谱仪4．定性、定量重复性主要是考核仪器稳定性的指标，这对于分析样品来说是非常重要的。好的仪器其稳定性应该是十分优秀的，这就要求多次进样保留时间及含量的一致性，这样做出来的结果才能使人信服。有的朋友会认为这些指标好像都是检测器的。对的，但是就前面所说条件是要放在整个回路和系统里去看去比较。例如：泵的脉动会直接影响噪音指标，泵的流量准确度、精确度指标，以及密封性不好也会影响相关指标。所以要系统地看指标。例如：某些公司在公布的指标中，噪音和漂移指标写的条件是空池或有的干脆不写。这个指标只考核了UV检测器光学和电气的特性，与实际情况相差甚远，并没有考验泵的压力脉动，液流回路的阻尼和UV检测器流通池的性能。所以我们认为从以上的主要指标中可以反应出仪器的一些真实水平。4.如何选择液相色谱仪二．操作方便操作方便性无论是对新手还是成熟的用户都是很重要的。操作越简单，有利于提高分析效率，也为以后分析方法的拓展提供有力的帮助。上海伍丰科学仪器有限公司的WS-100工作站软件实现了真正的智能化操作。它摒弃了以往工作站软件只能起到数据处理的理念，率先在国内推出了集控制与后处理于一身的软件，在操作使用上给用户带来了极大的方便。4.如何选择液相色谱仪三．系统的整体开发这里指的是仪器的整体开发，是一个完整的系统。目前市场上有这个现象，说我的泵是进口的，或者是检测器怎么好，用了什么很多的进口件组装等等。其实这是个误区。液相色谱是个复杂的系统，不是整体开发的，各项指标之间、软件和硬件、硬件和硬件等都不匹配，整体水平不会高到哪里去，而且在售后服务方面对用户也是不负责任的。整体开发的主要优点有：各项技术指标统一、仪器各单元的通信协调、能够建立一个整体的数字化评价系统、体现了企业的科技及开发实力。国外知名的仪器生产厂家的产品也是整体开发的，所以能够保证仪器的整体水平。4.如何选择液相色谱仪四．稳定可靠，故障率低5.HPLC常规分析操作步骤及规程

1.）严格过滤色谱纯流动相，根据需要选择不同的滤膜。2.）对抽滤后的流动相进行超声脱气20-30分钟。3.）打开色谱工作站，连接好流动相管道，连接检测系统。4.）有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，冲洗时速度不要超过10ml/min5.)调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000psi。选用合适的流速。6.)设定不同样品的检测器分析参数。7.)

等基线走稳即可进样分析，分析样品时对样品的前处理非常重要。8.)关机时，先关检测器，泵不要关掉，应改用流动相冲洗泵，不同的流动相冲洗时间不同，一般冲洗30min以上，若是缓冲盐作流动相应先用水冲洗30min，再用纯甲醇冲洗。9.)然后关液相泵。10.)需要把进样阀冲洗干净，另把注射器等工具清理整洁。11.)填写登记本，由负责人签字。5.HPLC常规分析操作步骤及规程注意事项：

1).1.）试剂首先必须是HPLC级的。2.)脱气由于流动相里含有微量空气，经泵的压力作用，会在流通池里产生气泡，这对分析产生一定的影响，如噪音增大，甚至于掩盖信号峰。因此，流动相在使用前必须经超声脱气20分钟以上。

3.)过滤由于流动相里有很微小的颗粒杂质，如不经过过滤，会使单向阀堵塞，从而产生压力波动。这一点很多用户不太注意，等到产生压力波动又不知道什么原因产生的。

6.HPLC系统中气泡对检测的

影响及其解决方法

在我们进行液相色谱分析时，有时会遇到这样一个问题：系统的流路中存在气泡。由于气泡的存在，会造成色谱图上出现尖锐的噪声峰，严重时会造成分析灵敏度下降；气泡变大进入流路或色谱柱时会使流动相的流速变慢或不稳定，使基线起伏。造成上述现象的主要原因有三条：6.HPLC系统中气泡对检测的

影响及其解决方法1.是流动相溶液中往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡；2.是系统开始工作时未能将流路中的空气驱赶干净；3.是在注入样品时不注意混入了空气。为了避免这类问题的出现，液相色谱实际分析过程中必须重视对流动相进行脱气处理。

6.HPLC系统中气泡对检测的

影响及其解决方法常用的脱气方法有以下几种：

1.吹氦脱气法使用在液体中比空气溶解度低的氦气，在0.1Mpa压力下，以约60ml/min流速通入流动相10-15min以驱除溶解的气体。此法使用于所有的溶剂，脱气效果较好，但在国内因氦气价格较贵，本法使用较少；2.加热回流法此法的脱气效果较好；3.抽真空脱气法此时可使用微型真空泵，降压至0.05-0.07MPa即可除区溶解的气体。显然使用水泵连接抽滤瓶和G4微孔玻璃漏斗可一起完成过滤机械杂质和脱气的双重任务。由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化，故此法适用于单一溶剂体系脱气。对多元溶剂体系应预先脱气后再进行混合，以保证混合后的比例不变。6.HPLC系统中气泡对检测的

影响及其解决方法4.超声波脱气法它是目前实验室使用最广泛的脱气方法，将配制好的流动相连同容器一起放入超声波水漕中脱气10-20min即可。该方法操作简便，基本能满足日常分析的要求。5.在线真空脱气法把真空脱气装置串联到储液系统中，并结合膜过滤器，实现了流动相在进入输液泵前的连续真空脱气。此法的脱气效果明显优于上述几种方法，并适用于多元溶剂体系。另外，还要注意：1.）在液相色谱系统开始工作前，可以用注射器连接恒流泵的排空阀，抽入流动相，将流路中的空气驱赶干净。2.）在注入样品前注意排出样品注射器中的空气。7.手动进样阀的使用及保养

六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。

7.手动进样阀的使用及保养手动进样阀的工作原理

1、手柄位进样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出；

2、将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。

虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、日常无需维修等特点，但正确的使用和维护将能增加使用寿命，保护周边设备，同时增加分析准确度。如使用得当的话，六通阀进样器一般可连续进样3万次而无需维修。

7手动进样阀的使用及保养1、手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱，是平头注射器。一方面，针头外侧紧贴进样器密封管内侧，密封性能好，不漏液，不引入空气；另一方面，也防止了针头刺坏密封组件及定子。

2、六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75％，如20gL的定量环最多进样15p,L的样品，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20gL的定量环最少进样60至1001aL的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。推荐采用100ul的平头进样针配合20ul满环进样。7手动进样阀的使用及保养3、可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精确计算定量环的体积，譬如，一根名义上10uL的定量环，实际是9uL还是11uL并不重要，因为被测样品和校正样品的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。4、进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用0.45um的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。8.色谱柱的应用8.1色谱柱的选择

8.1.1硅胶基质填料

8.1.2聚合物填料

8.1.3其它无机填料

8.色谱柱的应用

8.1.1硅胶基质填料8.1.1.1正相色谱正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其它具有极性官能团,如胺基团（NH2,APS）和氰基团（CN,CPS）的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其它极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组份的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正己烷（Hexane）、氯仿（Chloroform）、二氯甲烷（MethyleneChloride）等。8.1.1.2反相色谱反相色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。反相色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组份最先被冲洗出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有：C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。

8.色谱柱的应用

8.1.2聚合物填料聚合物填料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸酯等，其主要优点是在pH值为1～14均可使用。相对于硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。

8.色谱柱的应用

8.1.3其它无机填料其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如，石墨化碳正逐渐成为反相色谱柱填料。这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳可用于分离某些几何异构体,又由于在HPLC流动相中不会被溶解,这类柱可在任何pH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC,氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在pH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用。新型氧化锆基质色谱填料也可用于HPLC,商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用pH范围1～14，温度可达100℃。由于氧化锆填料是最近几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行中。

8.色谱柱的应用8.2色谱柱的使用

色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。

8.色谱柱的应用

a、最好使用流动相溶解样品。

b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。8.2.1

样品的前处理8.色谱柱的应用液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：

a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。

b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。

d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

8.2.2流动相的配制8.色谱柱的选择8.2.3流动相流速的选择

因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。8.色谱柱的选择

a．由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。

b．对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。

c．含水流动相最*在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。

d．流动相要求使用0.45μm滤膜过滤，除去微粒杂质。

e．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。8.2.4注意8.色谱柱的选择8.2.5色谱柱常见故障与排除

柱子的维护：1.使用色谱柱前认真阅读使用说明书；

2.使用保护柱及在线过滤器；3.大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过色谱柱的pH范围4．避免流动相组成及极性的剧烈变化

5．流动相使用前必须充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒核强保留成分；

6．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存在乙腈或甲醇中；柱子长期不使用应该用叠氮化钠保存，以抑制细菌的生长；7.经常以强溶剂冲洗色谱柱；8.压力升高是需要更换保护柱的信号。8.2.5色谱柱常见故障与排除故障现象解决办法旧色谱柱柱效低，分离不好，柱入口床层塌陷

填料被流动相溶蚀而流失。

用同型填料填补柱效可部分恢复。

对硅胶质填料，流动相PH值在2—7范围内，否则可能被溶蚀。

旧色谱柱柱效低分离不好，有时出现双峰。

入口填料被污染变质所致。用强溶剂冲洗。

刮除被污染的床层，用同型的填料填补柱效可部分恢复。

污染严重，则废弃或重新填装。

柱使用一段时间后，柱效下降出现双峰。

柱入口床层被污染使柱填料变质。

用强溶剂冲洗除去杂质。

8.2.5色谱柱常见故障与排除故障现象解决办法新柱接到仪器上后，柱头漏液。柱接头与仪器之间连接管的压环变形量不够。用扳手顺时针方向拧紧1／4圈直到不漏液为止。柱接头与仪器之间连接管的压环变形量不够。柱放置时间过长柱内充装的液体己挥发干。继续开泵，用流动相将柱内气体置换掉。新柱接到仪器上后，检测器出口不断有小气泡出现。①同上。②流动相脱气不彻底特别是MeOH／H20体系由于氢键作用很容易出现气泡。①同上。②配好流动相后一定要进行脱气处理。8.2.5色谱柱常见故障与排除故障现象解决办法新柱接到仪器上后柱压降不断增加，甚至超过仪器的耐压限。柱入口滤片被固体颗粒堵塞(或被霉菌堵塞)。更换或清洗柱入口滤片；用0．45µm过滤膜过滤流动相除去微小颗粒物。进样次数增加柱压降逐渐增加。①样品中含有不溶于流动相的微小颗粒物。

②样品在流动相中析出微小结晶。①用0.45µm过滤膜过滤样品。

②推荐使用流动相溶解样品。使用—段时间后，柱效下降，分离不好。①柱填料被流动相溶解而流失。

②柱填料被样品杂质污染。①推荐使用予柱。如柱床层塌陷，用相同型号填料填补。

②推荐使用保护柱或用强溶剂冲洗色谱柱除去污染杂质。8.2.5色谱柱常见故障与排除故障现象解决办法柱使用—段时间后，柱效下降，出现峰拖尾。柱入口床层被污染。用强溶剂冲洗20-30ml，若效果不明显应废弃。进样量增大与峰面积增加不成正比．即进样量与峰面积不是线性关系。样品在流动相中的溶解度小，只有部分样品被流动相冲如色谱柱中而另一部分则沉积在柱人口端。①用流动相溶解样品。

②样品的浓度不宜太大。

④进样量不宜过大。使用缓冲液作流动相时，柱压降升高很快。霉菌生长所致。①在流动相中加入有毒物质或加叠氯化钠防止霉菌生长。

②实验结束后先用纯水后用MeOH各冲洗20-30ml后关机。8.2.5色谱柱常见故障与排除故障现象解决办法用5µm颗粒填料柱时，

以MeOH／H20作流动相柱压较高。MeOH与水之间由于氢键作用黏度增大。可用乙腈／水体系使柱压降低，分离效率更好。长时间放置的色谱柱，出现双峰。柱床层出现干裂。柱放置时，最好使用相应的溶剂充填好，防止受大的机械震动，如床层干裂应废弃掉。流动相洗涤强度由弱渐强时出现很多杂质峰。强溶剂将弱溶剂洗不出的杂质冲出来。不影响柱的性能。8.2.5色谱柱常见故障与排除故障现象解决办法柱使用一段时间后保留值逐渐缩短。柱中固定相流失所致。①更换色谱柱。②检查所用的色谱条件是否合适。在UV色谱图中，靠近死时间处出现负峰。①进样时压力波动所致。

②样品溶剂比流动相的UV吸收值低。①采用阀进样。②用流动相溶解样品。9.高效液相色谱日常简易保养及维护

1、流动相的抽滤要求：色谱纯试剂，二次蒸馏水，缓冲盐一定要过滤；流动相脱气至关重要（可采用抽滤，超声波脱气等方法）

2、吸滤头：特殊情况下可拆下滤头抽取以判断其中是否堵塞；亦可用注射器吸取流动相通过吸滤头打出以判断其是否堵塞。若有堵塞情况可用异丙醇超声波清洗；清洗不成功则需要更换。

3、单向阀：如遇到泵压不稳或流动相不能抽取，则可能是单向阀出现问题，卸下用异丙醇超声波清洗，清洗时须按其安装的方向放置在小烧杯中，切记不可与安装方向倒置超洗！9.高效液相色谱日常简易保养及维护4、泵头：泵头漏液或出现其它故障一般要申请维修（如漏液，或更换柱塞杆及其密封垫等）5、过滤器：当色谱峰出现异常情况时，有可能是此部件被污染，拆下用异丙醇超洗或更换过滤垫片。

6、排液阀：此处不能完全密封或漏液时一般是其中的垫片污染或磨损，可卸下后取出其垫片用异丙醇超声波清洗或更换垫圈。

7、手动进样器：平时应注意用二次蒸馏水和甲醇在装载状态及进样分析状态清洗；如出现漏液现象，原因极可能为转子密封垫磨损或污染，一般须申请维修或更换配件。9.高效液相色谱日常简易保养及维护8、流通池：在色谱峰不正常时会可能是此部件补污染。可拆卸后取出其中的垫片用异丙醇超洗（可根据说明书进行操作或申请维修）。

9、工作站：出现死机可重启计算机；不正常运行时，首先可更换电脑测试其硬件故障；或在本机上重新插拔接口、重新安装软件。10.HPLC常见故障的判定及解决方法

10.1保留时间变化

1.柱温变化柱恒温，必要时需配置恒温箱

2.等度与梯度间未能充分平衡至少用10倍柱体积的流动相平衡柱

3.缓冲液容量不够用>25mmol/L的缓冲液

4.柱污染每天冲洗柱